不同類型呼吸道上皮細(xì)胞感染金黃色葡萄球菌的基因表達(dá)差異研究

尹 僖，謝 偉

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/重慶市兒童發(fā)育重大疾病診治與預(yù)防國(guó)際科技合作基地，重慶 400014)

感染性疾病是全球引起人類死亡的第二大主要原因，而金黃色葡萄球菌是引起人類感染[1]，尤其是呼吸道感染的主要病原體之一[2-3]。金黃色葡萄球菌是一種可寄生于宿主體表的條件致病菌，同時(shí)也是引起局部化膿性感染、肺炎、心內(nèi)膜炎及全身膿毒血癥等醫(yī)院獲得性感染的主要致病菌[4]。α溶血毒素(Hla)是一種外毒素，通常由致病性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌產(chǎn)生[5]。Hla可促使中性粒細(xì)胞裂解，損傷上皮細(xì)胞而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，引起菌血癥等臨床癥狀[6]。呼吸道上皮作為宿主對(duì)抗細(xì)菌感染的第一道防線，研究其在感染條件下發(fā)生的變化對(duì)于理解宿主-細(xì)胞的相互作用非常關(guān)鍵。人支氣管上皮細(xì)胞株16HBE14o-是一種對(duì)Hla敏感的細(xì)胞株，而人支氣管上皮細(xì)胞株S9則對(duì)Hla不敏感[7]。對(duì)比研究這2種細(xì)胞株，對(duì)研究Hla在金黃色葡萄球菌感染時(shí)對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的作用具有重要意義。

表達(dá)譜芯片可以同時(shí)研究組織的數(shù)萬(wàn)個(gè)基因表達(dá)情況，在全基因組層面對(duì)細(xì)胞的基因表達(dá)變化進(jìn)行全面化較，尋找與感染相關(guān)的各種基因。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院生物信息中的基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)是當(dāng)今最大、最全面的公共基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，至今已經(jīng)收集100多萬(wàn)個(gè)樣本的表達(dá)譜原始數(shù)據(jù)。從不同的角度對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行再分析，可以讓這些數(shù)據(jù)獲得更大的使用價(jià)值，也可減少不必要的重復(fù)研究[8-9]。為發(fā)現(xiàn)在病原體-宿主相互作用中起關(guān)鍵作用的基因，本研究將從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載的不同呼吸道上皮細(xì)胞在不同類型金黃色葡萄球菌感染的表達(dá)譜芯片進(jìn)行分析，旨在尋找差異表達(dá)基因，并對(duì)其進(jìn)行基因本體論分析，然后通過(guò)通路分析方法篩選出金黃色葡萄球菌感染中的相關(guān)通路。另外，通過(guò)提取差異通路中的基因，進(jìn)行基因產(chǎn)物蛋白互作的分析，找到維持上述通路關(guān)鍵的節(jié)點(diǎn)基因?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1一般材料 從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索下載不同呼吸道上皮細(xì)胞在不同類型金黃色葡萄球菌感染的表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，登錄號(hào)為GSE65018[10]。該數(shù)據(jù)集包括對(duì)金黃色葡萄球菌Hla毒素敏感的細(xì)胞株16HBE14o-和對(duì)Hla毒素抵抗的細(xì)胞株S9，分別用表達(dá)/非表達(dá)Hla毒素的金黃色葡萄球菌感染。

1.2方法 利用在線基因分析系統(tǒng)(https://www.gcbi.com.cn/gclib/html/index)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。對(duì)通過(guò)過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)的基因進(jìn)行非配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，利用Class comparison工具對(duì)2組樣本分類對(duì)比，找到差異表達(dá)基因，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用DAVID在線分析系統(tǒng)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO本體分析。

2 結(jié) 果

2.1基本情況 根據(jù)預(yù)先設(shè)定的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化過(guò)濾要求，16HBE14o-組共有1 164個(gè)基因，S9組有201個(gè)基因通過(guò)了過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)，可用于進(jìn)一步生物信息學(xué)分析。

2.2差異表達(dá)分析 應(yīng)用在線基因分析系統(tǒng)的差異表達(dá)分析工具，分類比較差異顯著的基因(P<0.05，變化倍數(shù)大于2倍)，分別篩選出50個(gè)在16HBE14o-和S9中，表達(dá)/非表達(dá)Hla毒素金黃色葡萄球菌感染時(shí)差異表達(dá)最顯著的基因。在S9感染表達(dá)/非表達(dá)Hla毒素金黃色葡萄球菌時(shí)，50個(gè)差異最顯著的基因中，有24個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，26個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。在16HBE14o-感染表達(dá)/非表達(dá)Hla毒素金黃色葡萄球菌時(shí)，50個(gè)差異最顯著的基因中，有9個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，41個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。

2.3差異基因的GO分析 DAVID在線分析系統(tǒng)對(duì)差異基因進(jìn)行基因本體論GO分析結(jié)果，見(jiàn)表1、2。

表1 S9細(xì)胞株中與Hla毒素相關(guān)的GO分析

續(xù)表1 S9細(xì)胞株中與Hla毒素相關(guān)的GO分析

表2 16HBE14o-細(xì)胞株中與Hla毒素相關(guān)的GO分析

續(xù)表2 16HBE14o-細(xì)胞株中與Hla毒素相關(guān)的GO分析

2.4差異基因的通路分析 使用在線基因分析系統(tǒng)的Pthway Relation Network功能，通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析2組細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)中差異基因的信號(hào)通路。結(jié)果顯示，對(duì)Hla毒素非敏感的S9細(xì)胞株中，發(fā)現(xiàn)差異基因相關(guān)的信號(hào)通路主要為MAPK、JAK/STAT及Toll樣受體通路等與免疫反應(yīng)關(guān)系密切。而16HBE14o-細(xì)胞株中與Hla毒素相關(guān)的信號(hào)通路結(jié)果顯示，受體通路等與免疫反應(yīng)無(wú)特異相關(guān)性。

2.5差異基因的蛋白互作分析 使用STRING功能，通過(guò)在線網(wǎng)絡(luò)http://www.string-db.org/數(shù)據(jù)庫(kù)分析2組細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)中差異基因的蛋白互作情況。S9細(xì)胞株中表達(dá)/非表達(dá)Hla毒素金黃色葡萄球菌感染時(shí)的差異基因蛋白互作分析結(jié)果顯示，其主要與FOS蛋白、EGR1蛋白、DUSP1蛋白、ATF3蛋白作用聯(lián)系緊密。16HBE14o-細(xì)胞株中表達(dá)/非表達(dá)Hla毒素金黃色葡萄球菌感染時(shí)的差異基因蛋白互作分析結(jié)果顯示，其與蛋白作用不大。

3 討 論

本研究從16HBE14o-和S9細(xì)胞株感染表達(dá)/非表達(dá)Hla毒素金黃色葡萄球菌的基因芯片數(shù)據(jù)中，分別篩選出1 164個(gè)和201個(gè)顯著差異(差異大于1.5倍)的基因，并對(duì)這些基因進(jìn)行了基因本體論和信號(hào)通路分析。2種細(xì)胞株在感染條件下的差異基因數(shù)量上區(qū)別較大，可能是由于2種細(xì)胞株對(duì)Hla毒素的敏感度不同所導(dǎo)致。說(shuō)明細(xì)菌因子與氣道上皮細(xì)胞的相互作用可能具有高度的細(xì)胞類型特異性，這與文獻(xiàn)[11]報(bào)道內(nèi)容一致。基因本體論分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎性反應(yīng)及免疫反應(yīng)等有關(guān)，這與公認(rèn)的感染免疫相關(guān)基因本體一致[8-9]。

值得注意的是，在對(duì)Hla毒素非敏感的S9細(xì)胞株中，與差異基因相關(guān)的基因本體包括細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)，這一現(xiàn)象可能是由于差異基因的重疊性所致。信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)，差異基因相關(guān)的信號(hào)通路主要為MAPK、JAK/STAT及Toll樣受體通路等與免疫反應(yīng)關(guān)系密切的信號(hào)通路，這也與公認(rèn)的金黃色葡萄球菌感染中被激活的信號(hào)通路相一致[12-13]。進(jìn)一步證明，Hla是金黃色葡萄球菌的主要效應(yīng)毒素。S9細(xì)胞株中，表達(dá)/非表達(dá)Hla毒素金黃色葡萄球菌感染時(shí)的差異基因蛋白互作分析結(jié)果顯示，其主要與FOS蛋白、EGR1蛋白、DUSP1蛋白、ATF3蛋白作用聯(lián)系緊密；而16HBE14o-細(xì)胞株中，表達(dá)/非表達(dá)Hla毒素金黃色葡萄球菌感染時(shí)的差異基因蛋白互作分析結(jié)果顯示，其與蛋白作用不大。這提示S9細(xì)胞可能對(duì)Hla誘導(dǎo)的細(xì)胞膜損傷具有更高水平的抵抗力,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)的方法分析基因芯片數(shù)據(jù)，16HBE14o-和S9細(xì)胞株中，表達(dá)/非表達(dá)Hla毒素金黃色葡萄球菌感染時(shí)基因表達(dá)差異顯著；S9細(xì)胞株蛋白互作聯(lián)系緊密。