不同時間低壓低氧刺激對大鼠肺動脈壓力及肺組織的影響

鄧 會 王 勇 陳小蘭 秦 崇 潘 磊*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科低壓低氧實驗室,北京 100038； 2. 北京急救中心， 北京 100031)

我國幅員遼闊、地形復(fù)雜，擁有海拔最高的青藏高原、內(nèi)蒙古高原等四大高原。隨著海拔升高，空氣壓力逐漸下降，不同的地區(qū)和海拔的空氣中氧氣含量也不同[1]，氧氣分壓也會隨高度升高而下降，導(dǎo)致高海拔地區(qū)出現(xiàn)低壓低氧環(huán)境[2-3]。突然暴露于高原的低壓低氧環(huán)境可能會發(fā)生急性高原反應(yīng)，嚴(yán)重者可發(fā)展為急性腦水腫或急性肺水腫[4-5]，長期暴露于低壓低氧環(huán)境可導(dǎo)致慢性高原病，如肺動脈高壓[6-7]等。低氧環(huán)境可以刺激血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板源性生長因子(platelet derived growth factor,PDGF)、成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)的產(chǎn)生，從而促進(jìn)肺小血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化，大量炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子等，最終導(dǎo)致肺動脈高壓[8]。目前大約超過1.4億人永久居住在海拔2 500米以上的地方，每年有超過3 500萬人前往高海拔地區(qū)，包括軍隊、救援人員、鐵路工作人員等[7]，因此了解間斷及持續(xù)低壓低氧環(huán)境對機(jī)體的影響至關(guān)重要。前期本課題組模擬高原的特殊環(huán)境，已經(jīng)成功建造了低壓低氧肺動脈高壓大鼠模型[9-11]。本文旨在觀察不同低壓低氧刺激時間對大鼠平均肺動脈壓力、肺組織及酪氨酸激酶中VEGF、PDGF、FGF表達(dá)水平的影響，以期為更合理的高原工作時間安排提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究采用Sprague Dawley雄性大鼠，8周齡，體質(zhì)量約280～320 g，SPF級，共計32只，訂購于北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。大鼠VEGF ELISA檢測試劑盒，PDGF ELISA檢測試劑盒，F(xiàn)GF ELISA檢測試劑盒均購自英國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1)利用低壓低氧艙構(gòu)建肺動脈高壓大鼠模型：將32只健康雄性SD大鼠采用抽簽法隨機(jī)分為4組：A組正常海拔環(huán)境下飼養(yǎng)21 d，B組持續(xù)低壓低氧環(huán)境21 d，C組每天6 h低壓低氧環(huán)境持續(xù)21 d，D組隔天24 h低壓低氧環(huán)境21 d。先于常壓常氧下適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始實驗。持續(xù)低壓低氧條件為：低壓低氧艙內(nèi)持續(xù)減壓到模擬海拔5 000米(條件為大氣壓約50 kPa，氧濃度10%)，艙內(nèi)溫度、濕度、照明與外界環(huán)境相同，每天開艙1 h更換墊料及補(bǔ)充食水。

2) 肺循環(huán)血流動力學(xué)測定:采用右心導(dǎo)管檢查的方法測定大鼠肺循環(huán)血流動力學(xué)的參數(shù)。各組 SD 大鼠飼養(yǎng)到規(guī)定時間，用戊巴比妥鈉( 40 mg /kg) 腹腔注射麻醉，仰臥固定、右側(cè)頸部備皮、消毒、切開，分離右頸外靜脈，插入充有 1 mg/mL肝素[0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(以下簡稱生理鹽水)]的聚乙烯PE-50右心導(dǎo)管，導(dǎo)管的另一端與 BL-420S 生物信號采集系統(tǒng)(成都泰盟)相連，在壓力波形的引導(dǎo)下，導(dǎo)管經(jīng)上腔靜脈進(jìn)入右心房、三尖瓣口、右心室，最后進(jìn)入肺動脈干，監(jiān)測壓力變化，并進(jìn)行采集和記錄。

3)HE染色：分離大鼠左肺下葉組織塊, 常規(guī)石蠟包埋, 連續(xù)切片(厚5 μm)，將部分切片進(jìn)行HE染色后光鏡觀察。

4)指標(biāo)檢測：采用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附法)檢測大鼠血清中VEGF、PDGF、FGF表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同低壓低氧處理時間對大鼠肺動脈壓力的影響

B、C、D組大鼠平均肺動脈壓力較A組大鼠肺動脈平均壓力升高(P<0.05)，其中B組升高最為明顯，平均肺動脈壓力為(27.4±1.2) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。C組和D組平均肺動脈壓力較A組有升高但是均小于25 mmHg，詳見表1。肺動脈壓力波形圖如圖1。

圖1 通過 BL-420S 生物壓力傳感器測定大鼠肺動脈壓力采集圖形Fig.1 The pulmonary artery pressure of rats was measured by BL-420S pressure sensor △1mmHg=0.133 kPa.

表1 通過右心導(dǎo)管法測定大鼠平均肺動脈壓力的數(shù)值

2.2 4組大鼠肺組織HE染色

與A組相比，B組大鼠肺血管周圍可見淋巴細(xì)胞浸潤，可見肺組織局部實變，亦可見部分肺泡過度充氣；C組少量肺血管周圍可見淋巴細(xì)胞浸潤，未見明顯肺組織實變或過度充氣；D組肺血管可見淋巴細(xì)胞浸潤，肺組織局部實變。B組肺組織病變較C組和D組明顯(圖2)。

圖2 4組大鼠肺組織病理圖Fig. 2 Pathological changes of lung tissue in four group rats(HE staining,100×) Lymphocyte infiltration can be seen at the black arrow; The yellow triangle was the consolidation lung tissue; The red triangle area was alveolar hyperinflation (the focus of various pathological changes was selected in the visual field);A: Group A; B: Group B; C: Group C; D: Group D.

2.3 4組大鼠血清中VEGF、PDGF、FGF表達(dá)量比較

與A組相比，B、C、D組大鼠的VEGF、PDGF、FGF表達(dá)量均會出現(xiàn)升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。

表2 不同低壓低氧處理時間大鼠血清中VEGF、PDGF、FGF表達(dá)量

3 討論

隨著高原鐵路的修建及旅游業(yè)發(fā)展，越來越多的人生活或工作在高海拔地區(qū)(低壓低氧環(huán)境)，了解急性或慢性高原病的發(fā)生機(jī)制及如何更好地適應(yīng)高原環(huán)境對避免急性及慢性高原病的發(fā)生具有重要意義。高原的低壓低氧環(huán)境可使肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、代謝和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[12]，促使肺血管收縮、重塑，導(dǎo)致肺小動脈產(chǎn)生功能及器質(zhì)性病變，最終導(dǎo)致肺動脈壓力升高。肺血管重塑不僅表現(xiàn)為肺動脈壁(肺動脈平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞和周細(xì)胞)中不同血管細(xì)胞的增殖，還表現(xiàn)為毛細(xì)血管的丟失和血管周圍過度浸潤炎性細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)[13]。既往本團(tuán)隊成功建立了低壓低氧肺動脈高壓動物模型[9-11]，并且發(fā)現(xiàn)低壓低氧肺動脈高壓模型大鼠肺組織可見動脈管壁的增厚、平滑肌細(xì)胞增生、炎癥細(xì)胞浸潤等[14]。本實驗研究探索了不同低壓低氧處理時間肺組織內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)的破壞，部分肺血管壁增粗，肺動脈壓力升高情況，為間歇性低壓低氧刺激下肺動脈壓力及肺組織變化提供了理論依據(jù)。但由于實驗動物數(shù)量較少，測量肺動脈壓力操作技術(shù)等多種因素影響，可能會造成一定的實驗誤差。

刺激血管生成的細(xì)胞因子包括直接和間接促血管生成。直接促血管生成標(biāo)志物包括VEGF、FGF和肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte grouth factor,HGF)，而間接促血管生成標(biāo)志物包括生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6)、IL-8和PDGF,VEGF和FGF是血管生成的最強(qiáng)激活因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖，從而產(chǎn)生和穩(wěn)定新生血管[8]。研究[15-16]表明，VEGF促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，在各種肺疾病尤其是急性呼吸窘迫綜合征的患者血漿中含量增加。FGF在正常人中有重要的生理功能，如促進(jìn)傷口愈合、胚胎發(fā)育等，但是FGF的過度表達(dá)導(dǎo)致血管的異常增殖[17]。有研究[18]曾在肺動脈高壓患兒重塑的肺小動脈上檢測出VEGF和FGF的過度表達(dá)。PDGF是一種有效的有絲分裂原，對血管壁細(xì)胞如平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells,SMCs)具有較強(qiáng)的趨化作用[19]。PDGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增加可能參與肺動脈高壓的病理生理學(xué)過程[20-21]。既往也有研究[22]表明，F(xiàn)GF和VEGF在低壓低氧環(huán)境下表達(dá)升高并且與低壓低氧持續(xù)刺激時間有關(guān)。本實驗也顯示，在受到低壓低氧環(huán)境刺激后，VEGF、FGF、PDGF表達(dá)量升高，且與平均肺動脈壓力成正比，在今后的實驗中會進(jìn)一步延長實驗周期，觀察三者動態(tài)變化及肺動脈壓力的改變，并且將從細(xì)胞水平上觀察肺組織及肺血管的改變。

目前關(guān)于長期間斷性往返高原環(huán)境工作的人群所發(fā)生的病理生理改變的研究甚少, 近年才開始關(guān)注這一特殊人群的健康問題[23]。本實驗?zāi)M海拔5 000 m 高度，對不同低壓低氧時間大鼠的平均肺動脈壓力、肺組織改變及血清中VEGF、FGF、PDGF表達(dá)量進(jìn)行探討，結(jié)果顯示，每天間斷低壓低氧刺激6 h對大鼠肺動脈壓力及肺組織影響較小，但是仍可見大鼠肺血管周圍有淋巴細(xì)胞浸潤，說明誘發(fā)了肺內(nèi)炎癥反應(yīng)；間斷低壓低氧24 h的大鼠平均肺動脈壓力升高及肺組織改變較前者明顯，但是兩者并未到達(dá)肺動脈高壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)。血清中VEGF、FGF、PDGF表達(dá)量與低壓低氧刺激時間呈正相關(guān)，間斷低壓低氧刺激后肺內(nèi)炎癥改變及大鼠平均肺動脈壓力改變是否可逆，在今后的實驗中筆者會進(jìn)一步探究，同時也將適當(dāng)延長實驗周期觀察上述指標(biāo)的動態(tài)變化。該實驗?zāi)M間斷低壓低氧環(huán)境刺激，通過不同時長的低壓低氧刺激觀察大鼠一些病理生理指標(biāo)改變，以期為保證高原作業(yè)人員這一特殊人群的身體健康狀況，為設(shè)立適當(dāng)?shù)墓ぷ髌谙藁蜉啺嘀贫忍峁├碚撘罁?jù)。