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    戰(zhàn)傷后污染精子收集及純化方法

    2021-07-30 08:00:58于月新
    臨床軍醫(yī)雜志 2021年7期
    關(guān)鍵詞:前向密度梯度感染率

    崔 鑫,張 寧,陸 輝,于月新

    北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心,遼寧 沈陽 110016

    戰(zhàn)時(shí)男性泌尿生殖系統(tǒng)傷害發(fā)生率高[1-2],骨盆個(gè)人防護(hù)裝備、護(hù)腹股溝合成內(nèi)衣、凱夫拉板等防護(hù)裝備可對泌尿生殖系統(tǒng)起到一定的保護(hù)作用[3]。當(dāng)睪丸受到破壞性損傷時(shí),立即從精囊或殘余輸精管中收集搶救精子并進(jìn)行冷凍保存,復(fù)蘇后用于體外受精胚胎移植,可使受傷官兵獲得自己的后代[4-5]。本研究旨在探索戰(zhàn)時(shí)泌尿生殖系統(tǒng)損傷后污染精子的收集及純化方法。現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 標(biāo)本來源 選取2019年1月1日—5月1日于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心門診就診的500例男性志愿者為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):禁欲2~7 d,手淫取精后精液體積≥3 ml。研究對象平均年齡(25±5)歲。所有研究對象均簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 1.6%感染率污染模型制備 收集志愿者精液,隨機(jī)每10份為1組。選取自然環(huán)境中土壤、砂子、樹葉、污水、血液、灰塵,分別選取采樣點(diǎn)5處,將精液與上述污染物混合備用(污染精子原液)。前期建立1.6%感染率污染模型(200例志愿者),從0.1%慶大霉素加入精子洗液起始,根據(jù)除菌效果,逐漸升高加入的慶大霉素濃度,找到除菌效率高的加入下限后停止?jié)舛让?。將精液?biāo)本隨機(jī)分為兩組,密度梯度法組和上游法組。

    1.2.2 除雜質(zhì)沉淀污染精子中大量固體雜質(zhì) 吸取污染精子500 μl于2 ml離心管中,將含慶大霉素的精子洗液1 000 μl緩慢加于污染精子上層,避免吹起精液層,37℃恒溫箱上游30 min。

    1.2.3 密度梯度法 進(jìn)一步除雜質(zhì)及死精子。將經(jīng)過1.2.2除雜質(zhì)后的上清液300 μl緩慢加入50/90密度梯度液上層,800 r/min離心15 min,吸取沉淀,計(jì)數(shù)精子密度及活力并涂板,血平板、巧克力平板37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

    1.2.4 上游法 進(jìn)一步除雜質(zhì)及篩選出活力高的精子。吸取經(jīng)密度梯度法處理后的精液沉淀,再次按照1.2.2除雜質(zhì)后,吸取上清、精液層計(jì)數(shù)精子密度及活力并涂板,血平板、巧克力平板37℃恒溫箱培養(yǎng)48 h。

    1.2.5 2.0%感染率污染模型制備 1.6%感染率污染模型達(dá)到預(yù)期實(shí)驗(yàn)效果后建立2.0%感染率污染模型(300例志愿者),從1.6%感染率污染模型加入慶大霉素下限起始,根據(jù)除菌效果,逐漸升高加入的慶大霉素濃度,找到除菌效率高的加入下限后停止。后續(xù)操作同1.2.2、1.2.3、1.2.4。

    1.3 計(jì)數(shù)方法 吸取10 μl精子滴于精子計(jì)數(shù)板上,蓋上計(jì)數(shù)板蓋,顯微鏡下計(jì)數(shù)精子密度及精子活力(前向運(yùn)動(dòng)精子率、非前向運(yùn)動(dòng)精子率)。每份樣本計(jì)數(shù)2次,取平均值。

    密度回收率=處理后精子密度/處理前精子密度×100%

    活力提高率=[處理后(前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率)-處理前(前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率)]/處理前(前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率)×100%

    2 結(jié)果

    2.1 1.6%感染率污染模型除菌及精子回收結(jié)果 污染精子原液:精子密度為95.00×106個(gè)/ml,前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(34.00%+10.00%)。除雜質(zhì)后:血平板、巧克力平板均有菌落生長,但菌落數(shù)與污染精子原液涂板比較,有明顯減少趨勢;上清液中,精子密度為22.00×106個(gè)/ml,前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(73.00%+18.00%),密度回收率為23.16%,活力提高率為107.00%。密度梯度法處理后:血平板、巧克力平板均無菌落生長;沉淀中,精子密度為13.00×106個(gè)/ml,前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(61.00%+22.00%),密度回收率為13.68%,活力提高率為88.64%。上游法處理后:血平板、巧克力平板均無菌落生長;上清液中,精子密度為0.11×106個(gè)/ml,前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(65.00%+11.00%),密度回收率為0.12%,活力提高率為72.73%;沉淀中,精子密度為48.00×106個(gè)/ml,前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(43.00%+8.00%),密度回收率為50.53%,活力提高率為15.91%。因單純除雜質(zhì)無法抑制細(xì)菌生長,僅對密度梯度法和上游法對精子的回收情況進(jìn)行比較:密度梯度法處理后沉淀的密度回收率、活力提高率均高于上游法處理后上清液,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2 2.0%感染率污染模型除菌及精子回收結(jié)果 污染精子原液:精子密度為96.00×106個(gè)/ml,前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(38.00%+11.00%)。除雜質(zhì)后:血平板、巧克力平板均有菌落生長,但菌落數(shù)與污染精子原液涂板比較,有明顯減少趨勢;上清液中,精子密度為21.00×106個(gè)/ml,前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(50.00%+3.00%),密度回收率為21.88%,活力提高率為8.16%。密度梯度法處理后:血平板、巧克力平板均無菌落生長;沉淀中,精子密度為17.00×106個(gè)/ml,前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(45.00%+5.00%),密度回收率為17.71%,活力提高率為2.04%。上游法處理后:血平板、巧克力平板均無菌落生長;上清液中,精子密度為0.09×106個(gè)/ml,前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(43.00%+3.00%),密度回收率為0.09%,活力提高率為-6.12%;沉淀中,精子密度為71.00×106個(gè)/ml,前向運(yùn)動(dòng)精子率+非前向運(yùn)動(dòng)精子率為(43.00%+1.00%),密度回收率為73.95%,活力提高率為-10.20%。因單純除雜質(zhì)無法抑制細(xì)菌生長,僅對密度梯度法和上游法對精子的回收情況進(jìn)行比較:密度梯度法處理后沉淀的密度回收率、活力提高率均高于上游法處理后上清液,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    3 討論

    利用精子庫和生殖保障車為戰(zhàn)時(shí)男性泌尿生殖系統(tǒng)損傷傷員提供緊急救治,根據(jù)傷情程度采用不同方法采集并凍存精子,可為保存男性傷員生育力提供有效保障。同時(shí),應(yīng)對傷員進(jìn)行心理干預(yù),通過生育指導(dǎo)、輔助生殖助孕、產(chǎn)前診斷、隨訪等一系列優(yōu)生優(yōu)育措施,為軍人提供生育保障,提高部隊(duì)官兵戰(zhàn)斗力。

    目前,精子的洗滌方法主要有直接上游法、非連續(xù)密度梯度法等。Waldemar等[6]采用三次精子洗滌、病毒RNA純化及定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)純化人類免疫缺陷病毒感染者的精子以實(shí)施夫精人工授精干預(yù)。Andrea等[7]采用精子洗滌方法對人乳頭狀瘤病毒感染者進(jìn)行輔助生殖技術(shù)前的精子純化。本研究結(jié)果提示,密度梯度離心可有效去除污染精子中的污物,并保存良好的精子密度及精子活力以供輔助生殖助孕。但由于添加了抗生素,在后續(xù)的臨床使用過程中,需考慮體外受精使用者對抗生素的過敏情況。本實(shí)驗(yàn)的技術(shù)難點(diǎn)在于從傷殘的睪丸組織和殘余的精囊或輸精管中獲取精子后,立即應(yīng)用基層現(xiàn)有設(shè)備對污染精液進(jìn)行污染的快速消除。本實(shí)驗(yàn)對抗生素種類、抗生素添加比例、密度梯度離心液種類、離心時(shí)間、上游時(shí)間等過程做了梯度認(rèn)證,實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告了抗菌成功及保證精子密度、活力的步驟,數(shù)據(jù)可為其他實(shí)驗(yàn)室提供參考。

    綜上所述,慶大霉素、密度梯度離心、上游等聯(lián)合分離純化污染精子可消除細(xì)菌生長,使精子具備行輔助生殖技術(shù)的密度和活力。

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