跌打萬(wàn)應(yīng)膏治療小鼠急性軟組織損傷的實(shí)驗(yàn)研究?

甄朋超 戚晴雪 王倩倩 周 喬 王 琦

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬護(hù)國(guó)寺中醫(yī)醫(yī)院，北京 100035；2.北京市肛腸醫(yī)院，北京市二龍路醫(yī)院，北京 100120）

急性軟組織損傷是由于人體筋、骨、分肉、脈絡(luò)受損，屬于中醫(yī)學(xué)“傷筋”等范疇［1］，多因扭、挫、跌、打等外部因素所致氣血瘀阻而出現(xiàn)腫脹、疼痛、功能受限等癥狀。若損傷失治、遷延日久會(huì)導(dǎo)致筋脈失養(yǎng)，甚至關(guān)節(jié)屈伸不利，治療宜舒筋活血，祛瘀通絡(luò)［2］。在前期研究中，我們從臨床角度總結(jié)了踝關(guān)節(jié)急性扭挫傷的臨床具體表現(xiàn)特點(diǎn)以及跌打萬(wàn)應(yīng)膏治療踝關(guān)節(jié)扭挫傷的臨床優(yōu)效性及安全性［3］，但對(duì)其治療急性軟組織損傷的作用機(jī)制研究目前還是空白。本研究從不同載藥量跌打萬(wàn)應(yīng)膏對(duì)二甲苯所致的小鼠耳腫脹改善實(shí)驗(yàn)、毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)以及醋酸扭體實(shí)驗(yàn)方面探討跌打萬(wàn)應(yīng)膏消腫、消炎、鎮(zhèn)痛作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取中日友好醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心體質(zhì)量18～22 g，2月齡的雄性SD小鼠，無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)，許可證號(hào)：SKXK-京-2020-0008。動(dòng)物飼養(yǎng)于清潔柜中，喂普通飼料，飼養(yǎng)時(shí)溫度控制在（20±1）℃，濕度50%左右。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 跌打萬(wàn)應(yīng)膏，由北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬護(hù)國(guó)寺中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)Z20053605，規(guī)格：每盒30 g。處方：乳香、沒(méi)藥、血竭、當(dāng)歸、川芎、紅花、蘇木、劉寄奴、土鱉蟲(chóng)、自然銅、制馬錢子。配置方法：諸藥混勻碾碎為粉，80目篩過(guò)濾，加入凡士林共熱融化，再加入液體石蠟與樟腦，混勻研磨呈膠狀細(xì)糊備用。受試物濃度：高劑量組生藥粉含量50%，中劑量組生藥粉含量25%，低劑量組生藥粉含量12.5%。雙氯芬酸二乙胺乳膠劑，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字H19990291，規(guī)格20 g/支，雙氯芬酸二乙胺含量為1 g/10 g。

1.3 試劑與儀器 紫外分光光度計(jì)：7530G（Angilent公司），二甲苯、0.5%醋酸：北京北化化學(xué)品有限責(zé)任公司。伊文思藍(lán)染色液：上海谷研實(shí)業(yè)有限公司。

1.4 耳郭腫脹實(shí)驗(yàn) 選取雄性小鼠50只，稱體質(zhì)量，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型組，跌打萬(wàn)應(yīng)膏高、中、低劑量組，對(duì)照組。模型組不用藥，其他組按體質(zhì)量各自給藥。根據(jù)臨床用量計(jì)算，跌打萬(wàn)應(yīng)膏給生藥量0.05 g/kg體質(zhì)量，小鼠用量的等效倍數(shù)為臨床用量的10倍，相當(dāng)于生藥0.5 g/kg體質(zhì)量，故高、中、低劑量給藥量分別為4、1、0.5 g/kg體質(zhì)量。對(duì)照組予雙氯芬酸二乙胺乳膠劑，給藥量為1 g/kg體質(zhì)量。各組連續(xù)給藥3 d，末次給藥60 min后，在小鼠左耳郭兩面均勻涂抹二甲苯，右耳不涂為正常耳，30 min后將小鼠脫頸椎處死，沿耳郭邊緣剪下左、右兩耳，用直徑為6 mm的打孔器在左右兩側(cè)耳相同部位取下圓耳片。計(jì)算腫脹度：左右耳片質(zhì)量之差。腫脹抑制率（%）=（對(duì)照組腫脹度-實(shí)驗(yàn)組腫脹度）/對(duì)照組腫脹度×100%。

1.5 毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn) 選取雄性小鼠50只，稱體質(zhì)量，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型組，跌打萬(wàn)應(yīng)膏高、中、低劑量組，對(duì)照組。模型組不用藥，其他組腹部脫毛后連續(xù)外用給藥3 d（給藥劑量同1.4）。末次給藥60 min后，小鼠尾靜脈注射0.5%伊文思藍(lán)（0.1 mL/10 g）。隨后立即腹腔注射0.5%醋酸（0.1 mL/10 g），20 min后脫臼處死。用6 mL生理鹽水沖洗小鼠腹腔，吸取腹腔液，3 000 r/min離心15 min，取上清液于紫外分光光度計(jì)上590 nm測(cè)定光密度OD值，OD值越低，代表抑制血管通透性越強(qiáng)。

1.6 醋酸扭體實(shí)驗(yàn) 選取雄性小鼠50只，稱體質(zhì)量，隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型組，跌打萬(wàn)應(yīng)膏高、中、低劑量組，對(duì)照組。模型組不用藥，其他組按體質(zhì)量腹部外用給藥3 d（給藥劑量同“1.4”）。末次給藥60 min后，各組小鼠均腹腔注射0.5%醋酸0.1 mL/10 g，觀察15 min內(nèi)小鼠的扭體反應(yīng)次數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（x±s）表示。組間比較先檢驗(yàn)各組數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，若不符合正態(tài)分布則采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠耳郭腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 見(jiàn)表1。與模型組相比，各組腫脹度均有明顯降低（P<0.05或P<0.01），說(shuō)明對(duì)照組及跌打萬(wàn)應(yīng)膏各劑量組均能緩解小鼠耳部腫脹。跌打萬(wàn)應(yīng)膏中劑量組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，兩者療效相當(dāng)，低劑量組、高劑量脹度數(shù)值顯著高于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明低劑量組與高劑量緩解小鼠耳部腫脹療效不如對(duì)照組。

表1 各組小鼠耳腫脹程度比較（±s）

表1 各組小鼠耳腫脹程度比較（±s）

注：與模型組比較，?P<0.05，??P<0.01；與對(duì)照組比較，△P<0.05。下同。

組別模型組對(duì)照組跌打萬(wàn)應(yīng)膏低劑量組跌打萬(wàn)應(yīng)膏中劑量組跌打萬(wàn)應(yīng)膏高劑量組n 10 10 10 10 10腫脹度（mg）7.76±2.32 3.85±1.67**4.66±2.18*△3.12±2.27**4.79±2.25*△腫脹抑制率（%）-50.38±5.58 39.98±4.73△59.79±5.67 38.27±4.68△

2.2 各組小鼠毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 見(jiàn)表2。與模型組相比，各組OD值均有明顯差異（P<0.05或P<0.01），說(shuō)明均能抑制小鼠毛細(xì)血管通透性。跌打萬(wàn)應(yīng)膏中劑量組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，兩者療效相當(dāng)，低劑量組、高劑量組OD數(shù)值顯著高于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明低劑量組與高劑量抑制小鼠毛細(xì)血管通透性不如對(duì)照組。

表2 各組小鼠毛細(xì)血管通透性抑制情況及扭體次數(shù)比較（±s）

表2 各組小鼠毛細(xì)血管通透性抑制情況及扭體次數(shù)比較（±s）

組別模型組對(duì)照組跌打萬(wàn)應(yīng)膏低劑量組跌打萬(wàn)應(yīng)膏中劑量組跌打萬(wàn)應(yīng)膏高劑量組n 10 10 10 10 10 OD值0.72±0.16 0.44±0.15**0.62±0.14*△0.44±0.15**0.62±0.17*△扭體次數(shù)（次/15 min）28.55±2.73 10.32±2.47**22.62±2.13*△8.85±2.36**11.65±2.52*△

2.3 各組小鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較 見(jiàn)表2。與模型組相比，各組扭體次數(shù)均有明顯差異（P<0.05或P<0.01），說(shuō)明均能抑制小鼠毛細(xì)血管通透性。跌打萬(wàn)應(yīng)膏中劑量組與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，兩者療效相當(dāng)，低劑量組、高劑量組扭體次明顯多于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明低劑量組與高劑量抑制小鼠扭體反應(yīng)療效不如對(duì)照組。

3 討 論

急性軟組織損傷一種常見(jiàn)的骨科疾病，以皮膚下組織，包括肌肉、韌帶、筋膜、肌腱、滑膜、脂肪、關(guān)節(jié)囊外周神經(jīng)和血管，但不包括骨折或脫位中的一系列急性挫傷或撕裂為特征［4］。這些組織受到外來(lái)或內(nèi)在的不同致傷因素的作用，造成組織急性破壞和組織生理功能的暫時(shí)紊亂而產(chǎn)生損傷。主要臨床表現(xiàn)為局部疼痛、腫脹、青紫瘀斑、肢體活動(dòng)障礙等［5］，給患者的生活和工作帶來(lái)了很大的不便。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)則認(rèn)為軟組織損傷系創(chuàng)傷引起的急性無(wú)菌性炎癥，其病理基礎(chǔ)是外部因素導(dǎo)致局部皮膚、肌肉、微小血管的破損，甚至可導(dǎo)致肌纖維、膠原纖維的損傷，損傷局部毛細(xì)血管的血管壁通透性的升高，大量的血管內(nèi)液體滲出到組織，從而導(dǎo)致?lián)p傷處的肢體及關(guān)節(jié)處的皮膚腫脹，隨著組織的充血和壞死，體內(nèi)代謝失衡紊亂，人體內(nèi)的炎癥因子被激活，產(chǎn)生大量的炎癥因子，由此加重了損傷局部的炎癥反應(yīng)，從而刺激局部神經(jīng)末梢導(dǎo)致疼痛［6-7］。有些炎癥因子如PGE2還能使血管的通透性增加，從而引發(fā)組織腫脹，形成惡性循環(huán)加重病情的進(jìn)展［8］。如果治療不及時(shí)，將會(huì)逐漸形成程度不同的纖維組織增生及炎性粘連，最后導(dǎo)致受損組織的攣縮和變性［9］，成為慢性軟組織損傷。目前西醫(yī)治療本病的主要方法一般采取RICE（Rest制動(dòng)休息、Ice冷敷、Compression加壓包扎、Elevation抬高患肢）原則及藥物治療，但往往療效不佳［10］。

中醫(yī)學(xué)將急性軟組織損傷歸屬于“筋傷”范疇［11］，所謂的筋，是指人體的皮膚、淺筋膜、肌腱、肌肉、韌帶、腱鞘、滑膜囊、關(guān)節(jié)囊、椎間盤及周圍神經(jīng)、血管等相關(guān)軟組織，各種因素造成上述“筋”發(fā)生損害的統(tǒng)稱為“筋傷”［12］。筋傷在《醫(yī)宗金鑒·正骨心法要旨》中被定義為“跌打損傷之癥狀……多有瘀血，一般情況下內(nèi)損傷而皮不破”?！端貑?wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》云“氣傷痛，形傷腫”“瘀結(jié)不散，則為腫為痛”?！夺t(yī)宗金鑒》記載“損傷之癥，腫痛者乃瘀血凝結(jié)作痛也”。皆指因外力強(qiáng)烈作用而引起的氣血凝滯等病癥，根據(jù)中醫(yī)學(xué)對(duì)該病發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，治法則多采用“結(jié)者散之，逸者行之，留者攻之”，多采用活血化瘀、消腫止痛的治則［13］。

中藥外用治療急性軟組織損傷，在我國(guó)歷史悠久，藥療效確切、藥力可直達(dá)病所，避免對(duì)胃腸道刺激及避免肝臟的首過(guò)效應(yīng)［14］，而且大多價(jià)格低廉、使用方便，很容易為人民大眾所接受［15］。跌打萬(wàn)應(yīng)膏是清代上駟院綽班處傳承下來(lái)的一種專門治療跌打損傷的外用藥膏，沿用至今已有上百年的歷史，自1955年開(kāi)始在我院使用至今已有六十余年歷史，主用于跌打損傷，外傷瘀血等，臨床效果顯著［16］。中藥外治法在急慢性筋傷的臨床治療也日益引起研究者們的關(guān)注，但其作用機(jī)制目前仍在不斷的探索之中［17］。

二甲苯所致的小鼠耳腫脹試驗(yàn)以及毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)是目前常用的急性軟組織損傷模型［18］。小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)中，二甲苯作為化學(xué)致炎劑，能引起P物質(zhì)釋放，導(dǎo)致局部毛細(xì)血管通透性增加及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，使組織液外滲，造成耳部急性滲出性炎性水腫［19］。毛細(xì)血管通透性實(shí)驗(yàn)將致炎劑醋酸注入小鼠腹腔內(nèi)能引起血管內(nèi)皮細(xì)胞自身的損傷以及組胺、5-羥色胺、緩激肽、前列腺素等的釋放，這些炎癥介質(zhì)造成腹腔組織毛細(xì)血管擴(kuò)張、通透性增加［20］。扭體實(shí)驗(yàn)是考察動(dòng)物急性軟組織損傷模型所致疼痛的一個(gè)重要實(shí)驗(yàn)。將醋酸注射到小鼠腹腔后，醋酸可刺激臟器及軀體痛覺(jué)感受器，可引起皮下細(xì)胞壁以及膈下臟器的炎癥反應(yīng)，小鼠因疼痛而出現(xiàn)以扭體為表現(xiàn)的行為變化，扭體次數(shù)越多則疼痛強(qiáng)度越大［21］。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，跌打萬(wàn)應(yīng)膏各劑量組及雙氯芬酸二乙胺乳膠劑均可抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹及毛細(xì)血管的通透性，而且能減少小鼠因疼痛所致的扭體次數(shù)。但在本研究中，跌打萬(wàn)應(yīng)膏高劑量組及低劑量組的療效不明顯，并沒(méi)有出現(xiàn)預(yù)想的量效正比關(guān)系，分析其原因考慮為高劑量組中由于生藥粉含量最高而致藥膏偏于干硬，當(dāng)涂抹于小鼠耳部及腹部時(shí)貼敷性不佳，加上小鼠活動(dòng)，藥膏易于脫落，從而影響藥物的吸收及藥效的發(fā)揮，低劑量療效不佳考慮為生藥粉含量低，經(jīng)吸收后未能達(dá)到有效血藥濃度而致療效欠佳。中劑量組療效最佳，與雙氯芬酸二乙胺乳膠劑相比無(wú)明顯差異，表明其均具有良好的消腫、抗炎、鎮(zhèn)痛的作用，為臨床應(yīng)用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)及科學(xué)理論。