外源硒對川黨參生長的影響及其可能作用機制

周武先，劉翠君*，段媛媛，張美德，艾倫強，魏海英，張雅娟

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，湖北 恩施 445000；2.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000；3.恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，湖北 恩施 445000）

硒（Selenium，Se）是人體必需的微量營養(yǎng)元素，日常攝入適量的硒對維持身體健康具有重要作用，缺硒容易引發(fā)心腦血管疾病、克山病以及大骨節(jié)病等[1]。大量的科學(xué)研究表明，外源施用適量的硒肥有利于促進作物生長，增強植物的抗逆境脅迫能力[2-4]，提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[5-6]。通過硒生物強化獲得富硒植物資源是生產(chǎn)富硒農(nóng)產(chǎn)品的安全有效途徑，因此研究外源硒對植物生長發(fā)育的影響及適宜的施硒方式對推進我國硒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義[7]。

川黨參（Codonopsis tangshenOliv.）為桔?？贫嗄晟俦局参?，其干燥根是黨參藥材的主要來源之一，具有生津養(yǎng)血、補中益氣和降血壓等功效。2018 年1月，國家衛(wèi)生健康委員會食品司將黨參列入既是食品又是中藥材物質(zhì)目錄，意味著黨參不再僅以藥品和保健品的形式存在，未來也將更多以食品形式出現(xiàn)，這將有利于黨參的綜合開發(fā)和利用，能夠激發(fā)和帶動黨參產(chǎn)業(yè)發(fā)展。目前關(guān)于植物硒生物強化的研究報道較多，Li等[8]的研究表明，通過外源噴施硒肥可顯著增加藍莓漿果中的硒含量，達到生產(chǎn)富硒藍莓食品的目的。Wang等[9]的研究表明，在含硒營養(yǎng)液中水培龍須菜可以增強其抗氧化能力，生產(chǎn)富硒龍須菜。Zhu等[10]的研究表明外源噴施硒肥可改善番茄的營養(yǎng)品質(zhì)，生產(chǎn)富硒番茄。

目前關(guān)于黨參硒方面的研究主要集中在硒化黨參多糖的藥理作用[11-12]，且試驗材料多為黨參（Co?donopsis pilosula（Franch.）Nannf.），川黨參的硒生物強化研究仍未見報道。黨參作為藥食同源藥材，具有廣闊的市場消費前景，生產(chǎn)富硒黨參可以進一步提高其經(jīng)濟價值，因此開展川黨參硒生物強化研究具有重要意義。本研究通過對川黨參噴施不同濃度硒肥，探索外源硒對川黨參產(chǎn)量、品質(zhì)、硒形態(tài)及其部分根際土壤養(yǎng)分的影響，分析川黨參生理生態(tài)變化與根際土壤養(yǎng)分變化的潛在關(guān)系，試圖從土壤的角度揭示外源硒對川黨參生長的影響及其可能作用機制，并對其作用效果進行綜合評價，為川黨參富硒栽培提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐，推動富硒川黨參產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為1 年生黨參幼苗，購自湖北省恩施市板橋鎮(zhèn)新田村農(nóng)戶，經(jīng)湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所鑒定為川黨參（Codonopsis tangshenOliv.）。亞硒酸鈉（Na2SeO3）作為硒源，購自成都艾科達化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗地概況

試驗地點設(shè)置在恩施市板橋鎮(zhèn)新田村湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所黨參規(guī)范化栽培示范基地（30°32′15″N，109°12′44″E，海拔1 735 m），屬于亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，年平均氣溫10.8 ℃，年平均降雨量1 100 mm，無霜期200 d 左右。試驗地土壤為泥質(zhì)頁巖發(fā)育的黃棕壤，耕層土壤容重為1.15 g·cm-3，pH 為4.52，硒含量0.15 mg·kg-1，有機質(zhì)29.25 g?kg-1，堿解氮130.39 mg?kg-1，速效磷28.18 mg?kg-1，速效鉀188.94 mg?kg-1。

1.3 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)置6 個硒肥處理，分別為噴施0（CK）、25、50、100、200、400 g?hm-2硒肥（以硒元素計），硒肥為亞硒酸鈉水溶液。由于黨參葉片表面有短絨毛和蠟質(zhì)，容易造成硒肥溶液淋失，因此加入0.1%吐溫80作為表面活性劑。每個處理三個重復(fù)（小區(qū)），每個小區(qū)5 m2，各硒肥處理每平方米分別噴施12.5、25、50、100、200 mg?L-1硒肥溶液200 mL，對照處理噴施等體積的清水。2017 年11 月將試驗地進行翻耕，施入3 000 kg?hm-2有機肥（pH=7.80，有機質(zhì)≥45%，N+P2O5+K2O≥5%）和750 kg?hm-2復(fù)合肥（N+P2O5+K2O≥45%）作為基肥，翻耕均勻，肥料施用一周后，將健康且大小一致的一年生川黨參幼苗進行移栽，保持種植密度一致，種植行株距為25 cm×10 cm，田間管理統(tǒng)一參照當?shù)剞r(nóng)戶習(xí)慣模式進行。川黨參于蕾期（2018年6 月）和花期（2018 年7 月）分別噴施一次不同濃度的硒肥。2018年9月采用釘耙現(xiàn)場測產(chǎn)采收（避免傷及根莖），使用抖根法收集川黨參的根際土壤，陰干后用于檢測土壤理化性質(zhì)。黨參根莖帶回實驗室清洗干凈后測定其形態(tài)特征，50 ℃烘干后測定其總硒、無機硒、炔苷和多糖含量。

1.4 檢測項目及方法

川黨參根長采用直尺進行測量；莖粗使用游標卡尺（MNT-150）測定。每個小區(qū)按五點取樣法隨機取20株川黨參，采用3 kg級樂祺電子秤（LQ-C30002）稱質(zhì)量，然后計算出每個小區(qū)的單株鮮質(zhì)量。各處理小區(qū)的川黨參全部挖出，使用30 kg級金旺電子秤（HY-809）稱質(zhì)量測產(chǎn)。川黨參總硒含量參照《食品安全國家標準食品中硒的測定》（GB 5009.93—2017）進行檢測；無機硒含量參照《湖北省食品安全地方標準富有機硒食品硒含量要求》（DBS 42/002—2014）進行檢測。川黨參有機硒含量=總硒含量-無機硒含量。參照胡佳棟等[13]的方法測定川黨參多糖和炔苷含量。蒽酮?濃硫酸法測定川黨參總糖含量；3，5?二硝基水楊酸（DNS）法測定還原糖含量。多糖質(zhì)量濃度=總糖質(zhì)量濃度-還原糖質(zhì)量濃度。采用高效液相色譜法測定黨參炔苷，色譜條件：Agilent C18 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相水∶乙腈=75∶25；流速1 mL·min-1；柱溫為室溫（25 ℃）；檢測波長為267 nm；進樣量20 μL。

川黨參根際土壤養(yǎng)分檢測指標包括有機質(zhì)、堿解氮、速效磷和速效鉀含量，參考鮑士旦[14]的《土壤農(nóng)化分析》進行測定。有機質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化還原滴定外加熱法測定；堿解氮含量采用NaOH 堿解擴散法測定；速效磷含量采用0.03 mol?L-1NH4F 和0.025 mol?L-1HCl 浸提-鉬藍比色法測定；速效鉀含量采用醋酸銨浸提-火焰光度計法測定。

參照周武先等[15]的方法計算川黨參對外源硒處理的生理生長響應(yīng)指數(shù)（Physiology and growth re?sponse index，PGRI）以及不同硒處理對川黨參生理生長影響的綜合效應(yīng)（Comprehensive effect，CE）。即：

式中：C為對照值；T為處理值。PGRI>0，表示對某一生理生長指標具有促進作用；PGRI=0，表示沒有影響；PGRI<0，表示具有抑制作用，絕對值的大小表示作用強度。

式中：CE 使用對應(yīng)處理下川黨參生理生長等正向指標的PGRI 算術(shù)平均值表示。CE>0 表示具有促進作用，值越大表明促進作用越強；CE=0 表示沒有影響（相對）；CE<0表示具有抑制作用，絕對值越大表明抑制作用越強。n表示生理生長指標的個數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007、SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和單因素方差分析（One-way ANOVA），采用新復(fù)極差法（Duncan）進行多重比較（α=0.05）。利用Pearson 法對川黨參生理生長性狀及其根際土壤理化性質(zhì)進行相關(guān)性分析。采用Canoco 5.0 軟件對川黨參生理生長性狀的影響因子進行RDA 排序。采用Origin 8.5作圖，圖表中數(shù)據(jù)均為平均值±標準差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同硒處理對川黨參根莖形態(tài)和產(chǎn)量的影響

從表1 可以看出，不同硒處理對川黨參的根長無顯著影響。相比于CK，100 g?hm-2和200 g?hm-2的硒肥處理可顯著增加川黨參莖粗，增幅分別為12.4%和13.6%。200 g?hm-2的硒肥處理顯著增加了川黨參的單株鮮質(zhì)量和產(chǎn)量，增幅分別為15.6%和9.7%。由此可見，噴施200 g?hm-2的硒肥處理可顯著促進川黨參的生長。

表1 不同硒肥處理對川黨參根莖形態(tài)和產(chǎn)量的影響Table 1 Effects of different Se treatments on root length，root diameter，fresh weight and yield of C.tangshen

2.2 不同硒處理對川黨參品質(zhì)的影響

由圖1 可知，與CK 相比，25、50、100 g?hm-2和200 g?hm-2硒肥處理均顯著增加川黨參的多糖含量，分別增加了2.9、2.2、3.5 和3.6 個百分點。100、200 g?hm-2和400 g?hm-2硒肥處理顯著增加了川黨參的炔苷含量，增幅分別為27.1%、37.6%和36.5%。綜上可知，100 g?hm-2和200 g?hm-2硒肥處理對川黨參多糖和炔苷合成均有促進作用，是提升川黨參品質(zhì)的適宜施硒量。

圖1 不同硒肥處理對川黨參多糖和炔苷含量的影響Figure 1 Effects of different Se treatments on polysaccharide and lobetyolin content of C.tangshen

2.3 不同硒處理對川黨參硒形態(tài)的影響

如圖2 所示，隨著外源噴施硒肥濃度的增加，川黨參的無機硒、有機硒和總硒含量顯著增加，且川黨參的無機硒、有機硒和總硒含量與外源噴施硒肥的濃度存在顯著的線性關(guān)系（P<0.001）。使用y表示川黨參硒含量，x表示外源噴施硒肥的濃度。川黨參無機硒含量與外源噴施硒肥濃度的函數(shù)關(guān)系為y=0.004 2x+0.019 1（r=0.979 1，P<0.001）；川黨參有機硒含量與外源噴施硒肥濃度的函數(shù)關(guān)系為y=0.017 2x+0.088（r=0.981 9，P<0.001）；川黨參總硒含量與外源噴施硒肥濃度的函數(shù)關(guān)系為y=0.021 4x+0.107（r=0.983 3，P<0.001）。外源噴施25 g?hm-2硒肥時，川黨參總硒含量最低，為0.174 mg?kg-1；外源噴施400 g?hm-2硒肥時，川黨參總硒含量最高，為0.947 mg?kg-1。噴施50～200 g?hm-2硒肥處理時，川黨參總硒含量為0.28～0.53 mg?kg-1，有機硒占總硒的比例為80.1%～83.6%，均達到《湖北省食品安全地方標準富有機硒食品硒含量要求》（DBS 42/002—2014）富硒農(nóng)產(chǎn)品的標準。從圖2還可以看出，隨著外源噴施硒肥濃度的增加，川黨參有機硒占比逐漸增大，在噴施硒肥為200 g?hm-2時達到最高，為83.6%，隨后有機硒占比開始下降。所有硒處理的川黨參有機硒比例均顯著高于CK處理。綜上可知，外源噴施硒肥的濃度不僅對川黨參硒含量具有決定性作用，同時對川黨參硒形態(tài)也會產(chǎn)生影響。

圖2 不同硒處理對川黨參硒形態(tài)的影響Figure 2 Effects of different Se treatments on selenium speciation of C.tangshen

2.4 不同硒處理對川黨參部分根際土壤養(yǎng)分的影響

如圖3 所示，不同外源硒處理對川黨參根際土壤有機質(zhì)和速效磷含量無顯著影響。外源噴施100、200 g?hm-2硒肥可顯著增加川黨參根際土壤堿解氮和速效鉀含量，增幅分別為10.1%、13.3%和9.6%、17.4%。由此可知，外源噴施硒肥不僅影響川黨參的生理生長，而且對其根際土壤養(yǎng)分含量也有影響。

圖3 不同硒處理對川黨參部分根際土壤養(yǎng)分的影響Figure 3 Effects of different Se treatments on partial rhizospheric soil nutrients of C.tangshen

2.5 不同硒處理對川黨參產(chǎn)量和品質(zhì)影響的綜合效應(yīng)

產(chǎn)量和品質(zhì)是決定中藥材經(jīng)濟價值的主要因素，因此本研究選取產(chǎn)量、多糖和炔苷（三者權(quán)重相同）作為評價外源硒對川黨參生長作用效果的考核指標。從表2 可以看出，川黨參對不同硒處理的生理生長響應(yīng)指數(shù)不同，不同硒處理對川黨參產(chǎn)量、多糖和炔苷影響的綜合效應(yīng)也存在差異。外源噴施25～400 g?hm-2硒肥對川黨參生長的影響總體表現(xiàn)為促進作用，但隨著噴施硒濃度的提高，促進效果先增強后減弱，其中200 g?hm-2硒肥處理對川黨參生長的促進效果最強，CE 達到0.48。說明噴施適量硒肥對川黨參生長具有較好的促進效果，過量噴施硒肥會導(dǎo)致促生效果減弱。

表2 不同硒處理對川黨參產(chǎn)量和多糖、炔苷含量的綜合效應(yīng)Table 2 The comprehensive effects of different Se treatments on the yield，polysaccharide and lobetyolin content of C.tangshen

2.6 川黨參生理生長性狀和根際土壤養(yǎng)分的相關(guān)性和冗余分析

從表3 可知，川黨參單株鮮質(zhì)量、產(chǎn)量與根際土壤堿解氮和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)。川黨參無機硒和有機硒含量與總硒含量呈極顯著正相關(guān)。川黨參多糖與根際土壤堿解氮和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)。川黨參炔苷含量與總硒含量及根際土壤速效鉀含量呈極顯著正相關(guān)。由此可知，川黨參的生理生長性狀與根際土壤養(yǎng)分存在密切聯(lián)系。

表3 川黨參生理生長性狀與總硒和根際土壤養(yǎng)分的相關(guān)性分析（r）Table 3 Pearson correlation coefficients between physiological and morphological traits,total selenium and rhizospheric soil nutrients of C.tangshen（r）

川黨參的生理生長性狀與部分根際土壤養(yǎng)分的RDA分析見圖4，第1排序軸解釋了變量的73.05%，第2排序軸解釋了變量的18.42%，前兩個排序軸解釋了變量的90%以上，說明前兩個主成分可以充分反映各項因子的變異程度。土壤養(yǎng)分因子按照變量貢獻率從大到小依次表現(xiàn)為堿解氮（61.5%，P=0.002）>速效鉀（59.2%，P=0.002）>速效磷（17.0%，P=0.258）>有機質(zhì)（8.7%，P=0.660），這表明根際土壤堿解氮和速效鉀含量是影響川黨參生理生長性狀的主要土壤養(yǎng)分因子。

圖4 川黨參生理生長性狀和部分根際土壤養(yǎng)分的冗余分析Figure 4 The redundancy analysis of physiological and morphological traits and partial rhizospheric soil nutrients of C.tangshen

3 討論

硒是一種天然的微量元素，對于植物的生長發(fā)育一般表現(xiàn)為雙重作用，具有低濃度促進、高濃度抑制的作用效果[16]。本研究結(jié)果表明，噴施200 g?hm-2的外源硒肥可顯著促進川黨參生長，增加其產(chǎn)量；當噴施400 g?hm-2硒肥時，這種促進效果會大大減弱。這與Hawrylak-Nowak 等[17]研究的硒對黃瓜生長影響和Zhu 等[5]研究的硒對輪葉黨參生長影響的結(jié)果類似。大量的研究表明，外源噴施硒肥可有效改善作物品質(zhì)。Zhu等[10]的研究表明，在番茄花期葉面噴施1 mg?L-1硒酸鈉溶液（以Se 元素計，1 mg?株-1）可提高番茄可溶性糖、氨基酸和維生素C 等營養(yǎng)成分含量。Zhu等[6]通過對葡萄葉面噴施氨基酸螯合硒肥（Cu+Fe+Mn+Zn+B≥100 g?L-1，有機硒≥60 g?L-1，在幼果期和果實膨大期共噴施三次，每次間隔10～15 d）500 倍液，發(fā)現(xiàn)外源硒肥提高了葡萄可溶性糖、可溶性蛋白和維生素C等營養(yǎng)成分含量，降低了葡萄有機酸含量。王清華等[18]發(fā)現(xiàn)在冬棗果實膨大期噴施45 mg·L-1亞硒酸鈉溶液（以Se 元素計，27 mg?株-1），可顯著提升冬棗可溶性糖、維生素C和總黃酮等營養(yǎng)成分含量。本研究結(jié)果顯示，在川黨參蕾期和花期葉面噴施100～200 g?hm-2外源硒肥可顯著提高川黨參多糖和炔苷含量，說明葉面噴施適量硒肥可有效改善川黨參品質(zhì)。

有研究表明，通過外源噴施硒肥可以提升谷類作物的硒含量。例如，Deng 等[19]對水稻噴施75 g?hm-2硒肥，使稻米硒含量達到0.41 mg?kg-1。Galinha 等[20]對小麥噴施100 g?hm-2硒肥，使小麥硒含量達到2 mg?kg-1。Wang 等[21]對玉米噴施200 g?hm-2硒肥，使玉米硒含量達到1.6～1.8 mg?kg-1。相比于其他研究，本研究設(shè)置的硒肥濃度雖然較高，但即使在川黨參兩個生育時期分別噴施一次25～400 g?hm-2硒肥，川黨參的硒含量也僅為0.17～0.95 mg?kg-1。相比于谷類作物，川黨參的硒富集能力較弱，這可能是由于川黨參葉片有短絨毛和蠟質(zhì)，容易造成硒肥溶液流失且不易被川黨參吸收，也可能與不同種類的植物硒富集特性存在差異有關(guān)。以往的研究表明，相比于無機硒，有機硒對人體來說相對更加安全，且生物可利用性更高[22]。有機硒在谷類作物中占總硒的比例較大，一般高達80%[19，23]，而有關(guān)中藥材有機硒比例的報道較少。本研究結(jié)果表明，川黨參中的硒主要以有機硒形態(tài)存在（有機硒>70%），且有機化程度與噴施的外源硒濃度密切相關(guān)，當Se≤200 g?hm-2時，隨著噴施硒肥濃度的提高，川黨參有機硒比例逐漸上升；當Se=400 g?hm-2時，川黨參有機硒比例下降，這與王清華等[24]研究的噴施不同濃度硒肥對沾化冬棗硒形態(tài)影響的結(jié)果類似，可能是由于川黨參中的無機硒含量快速增加導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化為有機硒的能力不足。

植物和土壤是陸地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，兩者相輔相成、相互影響。根際土壤是指受植物根系活動及其分泌物影響，在物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)上不同于其他土體的微域土區(qū)[25]。存在于植物根際能夠促進植物生長的細菌被定義為植物根際促生菌[26]。部分植物根際促生菌具有固氮和活化礦質(zhì)營養(yǎng)元素的功能[27]。外界環(huán)境變化可能會影響作物的生理代謝過程，致使植物根系分泌物成分發(fā)生改變，同時影響植物根際促生菌活性，進而引起一系列生物化學(xué)變化。根際土壤養(yǎng)分作為植物養(yǎng)分吸收的直接來源，其養(yǎng)分含量的變化直接影響作物的生理代謝過程，進而影響作物生長[28]。本研究結(jié)果表明，對川黨參噴施100～200 g?hm-2硒肥可顯著提高其根際土壤堿解氮和速效鉀含量，這與周武先等[29]前期發(fā)現(xiàn)葉面噴施適量硒肥可提高白術(shù)根際土壤速效鉀含量的研究結(jié)果存在類似之處，可能是由于外源噴施硒肥引起川黨參根系分泌物發(fā)生變化，刺激了根際土壤中具有固氮和解鉀功能的植物根際促生菌的生長，從而增加了根際土壤中堿解氮和速效鉀含量，但其具體原因還有待進一步研究。相關(guān)性分析結(jié)果表明，川黨參產(chǎn)量和多糖含量與根際土壤堿解氮和速效鉀含量呈顯著正相關(guān)，炔苷含量與速效鉀含量呈極顯著正相關(guān)。RDA 分析也表明，堿解氮和速效鉀含量是影響川黨參生理生長的主要環(huán)境因子，這表明提高根際土壤堿解氮和速效鉀含量可能是外源噴施硒肥提升川黨參品質(zhì)的重要原因之一。在實際生產(chǎn)過程中，外源噴施適量硒肥可作為生產(chǎn)富硒川黨參及提高川黨參產(chǎn)量、品質(zhì)的有效途徑。

4 結(jié)論

（1）在川黨參蕾期和花期噴施適量硒肥可提高其產(chǎn)量及多糖、炔苷含量，且以噴施100～200 g?hm-2硒肥效果最佳。

（2）川黨參中的硒主要以有機硒形態(tài)存在（有機硒>70%），且有機硒占比隨著外源硒肥濃度的升高呈現(xiàn)先增大后減少的變化趨勢。

（3）川黨參作為藥食同源藥材，是一種良好的硒生物強化候選材料，外源噴施50～200 g?hm-2硒肥時，川黨參總硒含量可達到富硒農(nóng)產(chǎn)品標準，有機硒占比為80.1%～83.6%。