腐殖質(zhì)生理活性及其與化學組成關系的研究進展

宋鴿，POPOV Alexander Ivanovich，石峰

（1.黑龍江大學中俄學院，哈爾濱 150080；2.俄羅斯圣彼得堡國立大學地球科學研究所，圣彼得堡 199034；3.黑龍江大學生命科學學院，哈爾濱 150080）

腐殖質(zhì)（Humic substances，HS）是土壤有機質(zhì)（Soil organic matter，SOM）的主要組分，占SOM 總量70%，占土壤有機碳總量80%[1]，廣泛存在于自然水體、木炭、泥炭以及海洋沉積物中。SOM 在微生物作用下的腐殖化按其規(guī)模被認為是光合作用之后的第二大過程[2]，對土壤肥力及理化性質(zhì)具有重要作用。HS化學組成和官能團取決于提取物的起源、年齡、獲取提取物時氣候和環(huán)境條件等因素，因此HS 無嚴格恒定的化學組成，而分子量取決于提取方法[3]。傳統(tǒng)上將HS 分為3 類：溶于堿但不溶于酸的腐植酸（Hu?mic acid，HA），既溶于堿又溶于酸的富里酸（Fulvic acid，F(xiàn)A），既不溶于堿也不溶于酸的胡敏素（Humin，Hu）[4]。然而，此種分類方法無法提供HS 化學行為和分子結(jié)構(gòu)等信息[5]。

HS 研究有近200 年的歷史，其腐殖化作用區(qū)別于活細胞中由遺傳密碼控制合成生物大分子的過程，發(fā)生在生物體外，缺乏既定合成程序，合成產(chǎn)物也不同于前體形式化合物。此外，土壤腐殖化作用持續(xù)進行，終產(chǎn)物和中間產(chǎn)物混淆不清，加之HS 的分散性、來源的多樣性、形成環(huán)境的不確定性、形成途徑和穩(wěn)定條件的復雜性等限制了對HS 分子結(jié)構(gòu)的深入研究[6]。HS 生理學活性一直以來都是科研人員研究的熱點，近年來，越來越多的學者試圖揭示HS生理活性與其化學組成、性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)的相關性，但由于上述瓶頸問題，至今關于生理活性機制的研究仍停留在理論假設階段。本文結(jié)合已報道的研究成果，綜述了HS 化學組成和結(jié)構(gòu)特征、生理活性及其作用機制，并探討了HS化學組成與其生理活性的相關性，旨在為HS生理學效應的深入研究及農(nóng)業(yè)應用提供理論參考。

1 HS化學組成和結(jié)構(gòu)特征

土壤腐殖化作用受多種因素的影響，如微生物群、溫度、濕度、土壤化學組成和物理結(jié)構(gòu)，以及參與腐殖化作用有機分子的異質(zhì)性等[7]。HS 形成途徑因原始材料不同存在不同假說，如木質(zhì)素假說、多酚假說、細胞自溶假說等。竇森等[6]認為功能相似但結(jié)構(gòu)各異的HS是由四類生物分子單體——木質(zhì)素、糖類、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)經(jīng)縮合轉(zhuǎn)化而成，形成的HS 不是前體分子的簡單加和，而是前體材料發(fā)生了新的生物化學反應，形成了特殊化學組合比例、特殊化學結(jié)合方式，甚至是形成了某種有機化學結(jié)構(gòu)未知的化合物，表現(xiàn)為HS特異性。HS化學組成具有不確定性，不同來源HS、相同來源不同分子量HS 片段都有著不同的化學組成。無論HS起源如何，HS高分子化合物間存在一系列共有化學基團，如表1[8]所示。

表1 HS共有化學基團[8]Table 1 Common HS chemical groups[8]

HS 是多分散和多功能有機化合物的混合物，是由異類分子單糖、脂肪酸、多肽、脂肪鏈和芳香環(huán)通過隨機氧化、聚合、疏水作用（如范德華力，π-π，CHπ）、電荷轉(zhuǎn)移和氫鍵等形成的超分子聚合物[9-10]，Ste?venson[11]提出了經(jīng)典HA 結(jié)構(gòu)模型，除了芳香環(huán)或脂肪族結(jié)構(gòu)，還包括多肽和碳水化合物。Orlov 等[12]認為HA 結(jié)構(gòu)單元包含不可水解芳香環(huán)核心骨架結(jié)構(gòu)和可水解的由糖類、脂類和蛋白質(zhì)等組成的外圍結(jié)構(gòu)，整個大分子結(jié)構(gòu)單元的組成和結(jié)構(gòu)具有可變性，該模型能夠解釋HS氧化還原、酸性和光學性質(zhì)，但是由于缺乏分子種類信息，因此無法得出HS 參與過程機制的結(jié)論。Popov 等[13]認為HS 是具有內(nèi)部疏水區(qū)和外部親水區(qū)的膠束結(jié)構(gòu)。Dmitrieva 等[14]認為HS 由芳香環(huán)和脂肪鏈組成，包含極性基團（含O、S、N 官能團）和非極性基團。Nardi 等[15]認為，外部親水區(qū)由極性基團組成，內(nèi)部疏水區(qū)由植物大分子組成。由于分子間相互作用非常弱，可利用凝膠色譜分離HS，在不同pH 值下，有機酸處理可改變親水疏水平衡，破壞膠束結(jié)構(gòu)，使膠束分解成不同的小聚集體。這些聚集體可能會重新形成膠束，膠束化和分解可能會無限期地進行[15-16]。然而膠束結(jié)構(gòu)假設沒有考慮凝膠色譜分離過程中非體積排除效應對分餾結(jié)果的影響，即HS 在低pH 下與凝膠的氫鍵結(jié)合，以及在高pH 與離子強度下的靜電相互作用，因此HS 膠束結(jié)構(gòu)模型也遭到了質(zhì)疑[17]。HS 超分子結(jié)構(gòu)的假設目前被普遍接受。HS實際上是由不同分子大小但相似化學結(jié)構(gòu)的納米級超分子締合而成[18]。HS 超分子結(jié)構(gòu)能夠解釋一系列化學行為[19]，如金屬腐植酸鹽熱行為很難通過將HS視為大分子聚合物來解釋，而將HS視為超分子組裝體則完全可以理解[19-20]，同樣，在HS和Fe離子互作過程中，F(xiàn)e 含量較低，HS 分子自組織成致密結(jié)構(gòu)，F(xiàn)e 含量增加，HS 膠體的重排明顯減少，因此HS 和Fe離子互作導致HS網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的重排與亞穩(wěn)態(tài)膠體的碰撞速率之間的競爭[19，21]。研究證實，隨著Fe含量的增加，HA 逐漸與Fe 形成絡合物，HA 分子量降低，與Fe絡合破壞了穩(wěn)定HS構(gòu)象結(jié)構(gòu)的疏水鍵，迫使HS超分子結(jié)構(gòu)變成較小的聚集體，但構(gòu)象穩(wěn)定性更高，實驗結(jié)果支持HS 超分子結(jié)構(gòu)模型[19，22]。Piccolo[23-24]將FA定義為較小親水分子締合物，其包含較多的酸性官能團，使得FA 在任何pH 溶液中保持分散狀態(tài)，而HA主要由疏水化合物（聚亞甲基鏈、脂肪酸和類固醇化合物）組成[18]，由于疏水作用的存在，其在中性pH 值下保持穩(wěn)定。Cao 等[18]近期研究認為，HS 具有天然生物大分子（蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素以及微生物代謝產(chǎn)物等）中不存在的特殊結(jié)構(gòu)特征。HS 超分子結(jié)構(gòu)特征包括C=O基團在高度取代芳香族化合物和高度共軛體系的脂肪族化合物中的分布，以及C—O 烷基鏈的存在[18，25]。HS 頑固性和不溶性被認為與脂肪烴的存在有關[18]。HS 長鏈分子在水溶液中呈球狀結(jié)構(gòu)[26-27]，其中疏水HA 朝向分子內(nèi)部，親水FA 朝向外部[28]。HS 超分子結(jié)構(gòu)由高分子量和低分子量有機物組成[29]，并隨著有機物和轉(zhuǎn)化時間的不同，以及土壤性質(zhì)和類型的改變而具有不同的結(jié)構(gòu)[18]。HS 在水溶液中形成穩(wěn)定的兩性聚集體，可將其視為“假分子”，據(jù)此確定其理化性質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)和功能組成、分子量和反應能力。HS作為線性或分支鏈狀聚合物在空間結(jié)構(gòu)上存在一定程度的構(gòu)象折疊，提高其對微生物降解的穩(wěn)定性，延長其在土壤中的循環(huán)周期，同時也確保SOM水平和土壤肥力。

目前，傅里葉紅外光譜（FTIR）、核磁共振（NMR）以及熱裂解氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（Py-GC/MS）等技術能夠提供HS 化學組成和結(jié)構(gòu)等方面信息，但由于研究技術和方法的限制，HS 分子內(nèi)部立體骨架結(jié)構(gòu)尚未明確。HS 作為天然存在的高分子化合物，除了堿溶性、暗色、相對分子量較高、異質(zhì)性、膠體性質(zhì)等共性外[6，28]，其HS化學組成和分子結(jié)構(gòu)至今還存在諸多爭議。爭議的焦點為：①HS 來源與化學組成的相關性。植物組織是HS 形成的主要原料，木質(zhì)素可能構(gòu)成了HS 芳香族成分，而角質(zhì)和木栓質(zhì)形成了脂肪族結(jié)構(gòu)[30]。此外，煤中所含HA和FA的化學成分在不同煤層之間和煤層之內(nèi)有所不同，煤炭礦床的形成受植被類型、植被在空間和時間上的變化，以及土壤和環(huán)境條件的影響，所有這些因素都會影響煤化學性質(zhì)（如芳香度）和無機成分（即灰分）的數(shù)量和質(zhì)量，并導致HS 化學組成的變化。研究還證實，各種固體化石燃料中HS含量不同，HS的組成和數(shù)量取決于化石燃料的碳化階段、巖相組成以及氧化度等[31]。外界環(huán)境因素的不可控導致不同來源HS 化學組成的差異，進而轉(zhuǎn)化為HS 與植物互作機制的差異。②HS 分子是否存在“結(jié)構(gòu)獨特性”。HS 是一類物質(zhì)，在化學組成和結(jié)構(gòu)特征方面與前體物質(zhì)不同。腐殖化過程中，新的生化反應在不同的前體物質(zhì)（包括動物、植物和微生物）之間，發(fā)生二級合成。Kleber 等[32]認為二級合成是不可證明的，因為堿提取無法將二級合成產(chǎn)物與其他可電離的有機物分開，而且在二級合成中會形成特殊的化學組合或特殊比例的化合物，以及未知化合物的某些化學結(jié)構(gòu)，即HS“結(jié)構(gòu)獨特性”。異質(zhì)性只是“結(jié)構(gòu)獨特性”的一部分。由于技術限制和HS的異質(zhì)性，科學家一直未找到“結(jié)構(gòu)獨特性”的證據(jù)[33]。此外，元素分析（C、H、O）和酸性官能團的測定數(shù)據(jù)表明，不同土壤HA和FA相對類似[34]。雖然這種簡單的相關性不基于任何分子層面，但要考慮將HS 視為具有特定性質(zhì)的化學實體，而不是非特異化合物的復雜混合物[23-24]。③HS形成和穩(wěn)定機制。HS的異質(zhì)性反映了HS 形成途徑和穩(wěn)定機制的復雜性。由于HS 異質(zhì)性和外界環(huán)境條件的影響，HS 的組成和結(jié)構(gòu)極其復雜[33]，而且微生物在腐殖化過程中的作用觀點尚未統(tǒng)一，這些都是限制HS 生物化學研究的重要原因。④Hu、HA 和FA 形成順序。HA 在木質(zhì)素蛋白理論和微生物合成理論中比FA形成得早，而FA在微生物多酚理論和木質(zhì)素多酚理論中形成得早[12]。上述均可能影響土壤中HS 形成，但其在不同土壤中參與程度不同或重要性不同[33]。⑤土壤中是否存在HS。有研究認為HS是由植物和動物殘留物在微生物作用下分解形成的異質(zhì)有機混合物，在土壤中不存在，通過現(xiàn)代分析技術無法在土壤中檢測到HS，而且HS合成中涉及的礦物質(zhì)和酶與自然系統(tǒng)無關[35-36]。研究者還提出了一種土壤連續(xù)體模型（Soil continuum model，SCM），該模型將HS視為逐步分解有機化合物的連續(xù)體[36-37]，因而能夠很好地解釋HS 的異質(zhì)性，但HS 不存在的觀點尚未得到學術界的認可。土壤系統(tǒng)中，在苯環(huán)和吡咯環(huán)參與形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)的基礎上[38]，形成了具有隨機性質(zhì)的HS 大分子和超分子系統(tǒng)，它們在固體顆粒表面形成了穩(wěn)定的雙層兩親性質(zhì)膜。當土壤中SOM 的轉(zhuǎn)化達到平衡狀態(tài)、SOM 的組成和結(jié)構(gòu)參數(shù)不變時[38]，氧化自由基聚合過程逐漸被HS 的片段更新過程所取代。在環(huán)境因素發(fā)生劇變情況下，SOM系統(tǒng)開始朝著新平衡狀態(tài)轉(zhuǎn)化。HS作為有機實體在土壤系統(tǒng)中發(fā)揮多種功能，上述問題的存在限制了HS生物化學的深入研究，然而正是HS化學組成和理化性質(zhì)的多樣性、分子結(jié)構(gòu)的復雜性，才使其在植物-土壤系統(tǒng)中發(fā)揮多樣的信號作用和營養(yǎng)功效。

2 HS生理活性及其作用機制

HS 作為天然高分子含氮化合物，是生物體外最穩(wěn)定的具備生物學活性的有機物形式之一。HS 可以通過改良土壤結(jié)構(gòu)、孔隙度來調(diào)節(jié)土壤微生物群落，間接影響植物生長發(fā)育[39-41]。HS 生理活性使其復雜的化學組成和特異的化學性質(zhì)能夠直接參與細胞內(nèi)的生物化學和生物物理學代謝過程，如光合作用、細胞發(fā)育、激素合成和信號轉(zhuǎn)導等，促進植物生長發(fā)育。HS 在土壤中礦化速率較慢，理論上不適宜作為植物營養(yǎng)的直接來源，因此HS 生理活性似乎與HS 營養(yǎng)含量無關，而與HS 促進營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和運輸，以及參與調(diào)節(jié)與細胞生長發(fā)育相關的植物激素信號傳導密切相關。

2.1 HS促進礦質(zhì)元素的吸收

植物根系能夠吸收HS，不同分子量HS 影響效果不同，低分子量HS促生效果較為明顯[42-43]，HS能夠促進種子萌發(fā)和生長發(fā)育[44]，其中對根的促生作用尤為明顯[45-46]。研究表明，HS突出特點是能夠促進根毛形成和側(cè)根發(fā)育[47-49]，增加根系對水分和營養(yǎng)元素的吸收面積。

HS促進植物細胞對無機營養(yǎng)元素的吸收[50-53]，如N、P、K、S、Fe、Mn、Cu、Zn 等。Baldotto 等[54]研究發(fā)現(xiàn)HS 使菠蘿（Ananas comosus）葉片中N、P、K、Ca 和Mg含量分別增加52%、71%、50%、58%和59%。HS 影響植物對離子的選擇性吸收，該過程受HS 來源和濃度、植物種類以及培養(yǎng)環(huán)境組分和pH 值等影響[55-56]。Kim 等[57]和Hita 等[58]認為HS 通過提高土壤微生物的活性增強細胞對礦質(zhì)元素的吸收利用。硝酸鹽是植物生長發(fā)育過程中的主要無機氮源。Vaccaro 等[59]比較了不同濃度（0、1、5 mg·L-1，以C 計）HA 對玉米（Zea mays）幼苗氮代謝和氨基酸代謝的影響，結(jié)果表明，1 mg·L-1HA 處理的幼苗根長和鮮質(zhì)量與對照差異不顯著，5 mg·L-1HA 處理表現(xiàn)出負生長，1 mg·L-1HA處理葉片中可溶性蛋白含量高于空白對照7%，硝酸還原酶（NR）和亞硝酸還原酶（NiR）活性分別增加10%和12%，谷氨酰胺合成酶（GS）和NADH 依賴性谷氨酸合成酶（NADH-GOGAT）活性分別增加11%和64%，而游離氨基酸天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、異亮氨酸（Ile）和賴氨酸（Lys）含量增加10%～13%，因此HA 通過增加可溶性蛋白含量和氨基酸合成促進硝酸鹽代謝。HS 能夠促進植物對的吸收利用[60-62]，其作用機制研究結(jié)論不一。Nardi 等[63]認為穿過細胞質(zhì)膜依靠的是H+-ATPase 與有利的H+電化學梯度相偶聯(lián)，而蛋白質(zhì)組學研究證實HS 與高親和及低親和轉(zhuǎn)運蛋白對的吸收之間不存在相關性，因此HS 對吸收的影響不是直接影響該物質(zhì)的主動運輸，而是通過降低根表pH 值，促進了同向運輸[64]。P 元素是細胞內(nèi)磷脂、核酸和酶等組成的必需元素。Urrutia 等[65]研究證實HS 可促進植物細胞對P 元素的吸收，HS 通過形成金屬橋與磷酸鹽相互作用，將根際土壤不溶性磷酸鹽轉(zhuǎn)變成可溶形式。Gerke[66-67]的研究印證了上述結(jié)論，HS 與正磷酸鹽（P）通過Fe（Ⅲ）或Al（Ⅲ）橋形成的絡合物普遍存在于土壤中。土壤HA 競爭性吸附P 元素形成HA-Fe（Al）-P 復合物，P 可以通過有機酸陰離子或HS 酸化被激活，提高生物可利用性。K+是高等植物普遍需要的一價陽離子，是植物細胞代謝不可缺少的元素。HS 促進根細胞對K+的吸收利用，作用機制一方面類似細胞對的吸收轉(zhuǎn)化，由H+-ATPase 在細胞膜上產(chǎn)生有利的電化學梯度，促進K+轉(zhuǎn)運[68]，另一方面K+也可與HA 絡合位點相互作用，但由于化學鍵的高度離子性，金屬結(jié)合的穩(wěn)定性較低，目前HA 對K+吸收轉(zhuǎn)運機制尚未明確，仍有待進一步研究。

此外，HS是兩性分子，其分子結(jié)構(gòu)中親水區(qū)和疏水區(qū)能夠增強HS 與細胞膜的親和性，影響細胞膜的滲透性和流動性，促進細胞對礦質(zhì)元素的吸收。HS分子結(jié)構(gòu)中的酸性官能團，能夠與微量元素（如Fe、Mn、Cu、Zn 等）形成螯合物，轉(zhuǎn)變成能夠被植物細胞吸收利用的形式，促進細胞對微量元素的吸收利用。研究證實，土壤中微量元素（如Zn、Mn、Cu 等）稀缺時，HS作用效果更為明顯[5]。近期研究證實，HA能夠促進Fe2+吸收和同化，其作用機制是HA 能夠誘導編碼Fe3+螯合物還原酶和Fe2+轉(zhuǎn)運蛋白基因CsFRO1和CsIRT1的表達，而且HA 組成中羧基（—COOH）和酚羥基（Ar—OH）能夠絡合Fe2+，促進Fe2+的吸收和轉(zhuǎn)化[69-70]。HS 也可作為轉(zhuǎn)運載體[71]，直接參與細胞膜內(nèi)外離子跨膜運輸。

2.2 HS類激素活性

HS 類激素活性一直都是研究人員關注的焦點。研究發(fā)現(xiàn)，不同來源HA和低濃度吲哚-3-乙酸（IAA）（10-10mol·L?1和10-15mol·L?1）均能夠誘導側(cè)根增殖，促進根的伸長，激活細胞質(zhì)膜H+-ATPase、液泡膜H+-ATPase 和H+-PPases[61，72]。IAA 響應報告基因DR5：：GUS在對HS 響應研究中也證實HS 的IAA 活性，外源施加HS 能夠誘導DR5：：GUS在側(cè)根中的表達[73-75]。此外，HS 對IAA 作用的特定分子靶標具有誘導作用，HS 能夠誘導早期IAA 響應基因IAA5和IAA19的表達，并誘導質(zhì)膜H+-ATPase 的應答[76]。研究表明，除了IAA 活性外，HS 還具有其他植物激素的活性，如赤霉素（GA）、細胞分裂素（CK）和多胺（PA）等[77-78]。

HS 自體組成是否包含類激素，現(xiàn)有研究結(jié)論存在爭議。Canellas 等[79]認為HS 自身不包含植物激素。游離于土壤或附生于植物根際的促生細菌（Plant growth promoting rhizobacteriam，PGPR）是激素來源之一。作用機制是PGPR 分泌的生物活性小分子（如IAA）包埋在HS 超分子結(jié)構(gòu)疏水區(qū)，植物根系分泌的有機酸（主要是檸檬酸）分解HS 超分子結(jié)構(gòu)，IAA 等被釋放出來作用于細胞質(zhì)膜H+-ATPase，將細胞內(nèi)H+泵出細胞外，H+泵送降低了質(zhì)外體pH，激活了細胞壁松散酶，使細胞壁松動、細胞體積膨脹。H+質(zhì)外體分泌由陽離子的反向泵入補償，此種方式確保在細胞伸長期間內(nèi)部膨壓保持在恒定值，作用機制如圖1[77]所示。HS 作為根際土壤信號分子，能夠引起土壤微生物群產(chǎn)生激素，刺激根系生長發(fā)育。此外，HS還能夠增加內(nèi)源植物激素的水平，Elmongy 等[80]將不同濃度（0、0.5、1、2、5 mg·L?1）HA 添加到杜鵑花（Rhododen?dronsubgenusTsutusi）外植體培養(yǎng)基中，結(jié)果表明，1 mg·L-1和2 mg·L-1HA 處理培養(yǎng)56 d 后，根長、根數(shù)和生根率明顯增加，植物內(nèi)源激素IAA 和GA 水平顯著升高，尤其是在根發(fā)育的起始階段（培養(yǎng)7 d），1 mg·L-1和2 mg·L-1HA 處理IAA 含量分別為72.57、70.21 ng·g?1（鮮質(zhì)量），GA含量比對照增加56.6%和52.5%。García 等[81]研究證實，HS 促生作用與內(nèi)源激素IAA、乙烯（ETH）、NO 和脫落酸（ABA）濃度增加密切相關。此外，Moscolo 等[82]認為HS 本身包含類激素組分，免疫測定等方法檢測到不同來源（如堆肥、土壤、有機廢物等）HS 分子均具有類似IAA 活性組分。植物根系分泌的有機酸可分解HS 超分子結(jié)構(gòu)，由于HS 來源和化學組成的多樣性、分子結(jié)構(gòu)的非均一性，以及有機酸作用部位的隨機性，HS 超分子結(jié)構(gòu)能夠釋放出多種類型小分子片段，與細胞質(zhì)膜上的受體結(jié)合誘導不同的生理生化反應。HS 分子結(jié)構(gòu)域的組合和拆分，以及不同活性分子的動態(tài)釋放可以解釋HS 具有IAA、GA、CK 和PA 等多種植物激素的活性。

圖1 HS類生長素物質(zhì)以活性形式（～A）激活質(zhì)膜上的H+-ATPase[77]Figure 1 Auxin-like substances present in HS in active form（～A）activates H+-pumping ATPase at plasma membrane[77]

HS類激素活性組分作為誘導因子影響植物生理代謝，作用途徑和機制尚未明確。Trevisan 等[83]采用cDNA-AFLP 技術研究HS 對擬南芥（Arabidopsis thali?ana）初級代謝和生長發(fā)育相關基因表達的影響，利用160個基因組合引物，鑒定出133個基因參與HS與植物互作，序列分析結(jié)果表明HS 作用后大量基因參與擬南芥生長發(fā)育和代謝調(diào)節(jié)，以及RNA 轉(zhuǎn)錄和代謝等，RT-PCR 進一步分析了32 個HS 調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄組水平上HS通過復雜的基因轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡調(diào)節(jié)生理代謝，而且HS 的促生作用與類激素活性相關，涉及IAA 非依賴性信號傳導途徑的參與。HS 通過多方面機制發(fā)揮促生作用，在H+-ATPase 激活的同時，類激素活性還能夠激活轉(zhuǎn)錄因子和蛋白代謝，觸發(fā)細胞分裂和生長[5]。HS類激素活性影響細胞呼吸作用。Canellas 等[84]研究發(fā)現(xiàn)，HS 處理玉米葉片后總碳水化合物含量減少50%，當葡萄糖和果糖含量降低時，淀粉含量增加。HS 影響糖酵解（Glycoly?sis）和三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cycle，TCA）關鍵酶活性，分子量越小作用效果越好，原因是HS分子柔性構(gòu)象易于擴散進入細胞[85]。Shah等[5]研究與上述結(jié)論一致，認為低分子量HS 能夠作為類激素物質(zhì)（IAA，GA 或細胞因子等）促進植物生長發(fā)育。HS 的IAA 活性能夠調(diào)節(jié)根系C、N 代謝，IAA 極性運輸?shù)母眨约坝傻叵孪虻厣系霓D(zhuǎn)運等[86]，HS 生理活性除了與IAA 信號傳導途徑相關外，HS 還參與其他的一些獨立互補途徑，這些途徑與和Fe2+運輸吸收密切相關[15]。

2.3 HS介導信使NO的作用

信使NO 是參與許多植物生理過程（如根生長、側(cè)根形成、細胞凋亡、防御代謝等）的重要生物活性分子[87]。Zandonadi 等[72]研究指出，20 mg·L-1（以C 計）HA 處理影響玉米幼苗初生根和側(cè)根形態(tài)變化，初生根長度大于對照但差異不顯著，側(cè)根數(shù)量增加2.5倍，在幼苗側(cè)根特定部位誘導NO 的出現(xiàn)[88-89]，產(chǎn)生機制可能是HS 酸化胞內(nèi)環(huán)境，提高NO 還原酶活性，誘導NO 合成[90]。Cordeiro 等[91]研究了在0.5 mmol·L?1和5 mmol·L?1N-NO3水平下HA 和NO 供體（SNP）促進羅勒（Ocimum basilicum）毛狀根生長的機制，結(jié)果表明，在0.5 mmol·L?1N-NO3水平下，3 mmol·L?1（以C 計）HA 和100 μmol·L?1SNP 促進毛狀根生長，NO 和活性氧（Reactive oxygen species，ROS）水平增加，而NO 清除劑（cPTIO）的使用抑制了毛狀根的生長，降低了NO和ROS 水平，說明HA 依賴信使NO 和ROS 促進根系生長。NO作用于細胞質(zhì)膜參與調(diào)節(jié)多條胞內(nèi)代謝途徑，如圖2 所示。HS 小分子片段進入細胞轉(zhuǎn)變成氨基酸、核苷酸、單糖等結(jié)構(gòu)單元，參與合成生物大分子，調(diào)節(jié)與生長發(fā)育相關基因的表達[92]。NO 分子能夠激活細胞質(zhì)膜H+-ATPase[93-94]，研究認為，IAA 和NO 濃度的增加是HS 激活質(zhì)膜H+-ATPase 的必要條件[76]。Carcía 等[95]研究還證實，HS 作用于根部后H2O2和濃度增加，同時清除酶活性增強，而NO 能夠清除胞內(nèi)ROS[96]，降低ROS 毒害作用。此外，胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS 靶向作用于細胞膜Ca2+通道，使Ca2+細胞內(nèi)流，促進側(cè)根生長[75]。HS 作用產(chǎn)生的NO 能夠與激素互作，參與根和莖生長發(fā)育的調(diào)節(jié)。在根系中，HS通過激活根細胞中NO、IAA 和ETH 聯(lián)合調(diào)節(jié)的信號通路誘導側(cè)根形成，同時ABA 濃度增加[94]，水通道蛋白被激活，促進根系水力傳導率和莖、葉的生長。HS對莖生長發(fā)育的調(diào)節(jié)與IAA、NO 和ABA 信號傳導途徑相關，這些信號分子通過相關受體蛋白調(diào)節(jié)H+-ATPase 活性[97]。此外，NO 信號分子還能夠協(xié)同其他信號分子激活細胞防御代謝。NO 穿越細胞膜，在胞內(nèi)H2O2參與下，誘導合成水楊酸（Salioylic acid，SA），SA 和NO 協(xié)同作用誘導防御基因表達，提高抗氧化酶活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)HS 在根細胞中觸發(fā)ROS 信號，HS 通過NO 和抗氧化酶調(diào)節(jié)胞內(nèi)ROS 穩(wěn)態(tài)，介導根系發(fā)育和形態(tài)結(jié)構(gòu)，因此HS 對根表型的影響具有激素和ROS 依賴性[98-99]?？傊?，HS 通過NO 分子激活H+-ATPase 并參與多條激素信號傳導，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，如IAA-NO-ETH、IAA-NO-ABA、ROS 和Ca2+信號等[100]。

圖2 HS通過信使NO分子激活細胞質(zhì)膜H+-ATPase和相關生理代謝過程Figure 2 HS activates the cytoplasmic membrane H+-ATPase and related physiological metabolic pathways through messenger NO molecule

3 HS化學組成與其生理活性的關系

HS 是超分子膠體簇，穿過植物細胞壁的概率非常小，研究認為HS 僅作用于細胞膜，HS 生理活性與其在細胞膜上的局部靶向和非靶向作用相關[101]，激活細胞內(nèi)代謝過程。還有研究指出HS組分能夠穿透根部質(zhì)外體和表皮細胞，但至今尚未有明確定論[102]。采用14C同位素標記HA和FA的研究發(fā)現(xiàn)，在HS 和豌豆（Pisum sativum）根系最初作用的3 h 內(nèi)，HA 和FA大量地結(jié)合在細胞壁上，18 h 后HA 和FA 轉(zhuǎn)變成了植物細胞內(nèi)可溶性組分，且HA 仍主要結(jié)合在細胞壁上，而FA 更多地進入細胞內(nèi)[103-104]，可能是由于大量氫鍵和疏水作用的存在使HS 同細胞壁組分有效結(jié)合，吸附在細胞表面，F(xiàn)A 分子量相對較小能夠轉(zhuǎn)運進入細胞。目前關于HS 化學組成、理化性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)與生理活性的相關性已有一些研究成果，如表2所示。

表2 HS化學組成、性質(zhì)、分子結(jié)構(gòu)與生理活性的相關性Table 2 The correlation of chemical composition，properties and molecular structure of HS with physiological activity

3.1 官能團—COOH 和—OH 活性位點對生理活性的影響

HS 由多樣的化學官能團組成，包括—COOH、Ar—OH、醇羥基（R—OH）、—C=O—、—NH2、甲氧基（CH3O—）等，具有酸性、親水性、界面活性、陽離子交換能力、螯合-絡合作用及吸附分散能力等[113]，能夠參與細胞膜內(nèi)外多種生化反應。不同來源HS生理活性的差異是由其分子組成中官能團組成和含量的差異決定的。研究證實，土壤HS 分子量較大，—COOH含量較低，Ar—OH 含量較高，而水體HS 酸性基團較多，分子量較小，芳香基團、Ar—OH、CH3O—含量和C/N較低，—COOH含量較高[114]。土壤HS組成中低分子量組分生理活性較大，原因是遷移率較高，易擴散進入細胞，而高分子組分易吸附在細胞壁上，阻礙其他營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞，因此高分子量HS 組分生理活性較低，但也有研究認為高分子量HS 能夠促進根細胞分化[63]。HS 分子量與其生理活性相關性研究存在爭議，Muscolo 等[108，115]認為低分子量HS 組分（<3 500 Da）具有IAA 活性，高分子量HS 組分（>3 500 Da）對植物根系沒有任何影響。Scaglia等[109]認為HS生理活性似乎與分子量相關性不大，而與HS化學組成、性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)密切相關。Filatova 等[116]研究認為，HS 分子量與化學組成相關，隨著分子量的減小，H 和N 元素含量降低，O 元素和—COOH 含量增加，氧化度和環(huán)狀結(jié)構(gòu)比例、年齡和順磁性中心濃度增加，而高分子量組分富含脂肪酸、多糖、多肽，而且光敏生色團濃度較低，因此分子量和生理活性的相關性還需深入研究。HS 各組分分子量按照Hu-HA-FA 順序逐漸減小，元素組成中O 含量依次增加，C 和N 含量依次減小，酸度和陽離子交換能力增強。研究證實FA 生理活性相對較大[117]，不僅是因為FA 分子量相對較小，更可能是因為含氧量及酸性官能團含量較高。HS官能團分布于整個超分子結(jié)構(gòu)，其中含氧官能團是重要基團，如—COOH、—OH、—CH3O—、—C=O—等，在FA組成中幾乎所有的氧元素都分布在含氧官能團中，而且FA 酸性含氧基團中—COOH、—OH 和—C=O—含量較高[118]。HA 分子結(jié)構(gòu)中—COOH、—OH 是主要化學官能團，HA 多種功能歸因于組成中—COOH、Ar—OH，它們是發(fā)生吸附、絡合、螯合、離子交換和光降解等活性作用的位點，OH/OOH 能夠去質(zhì)子化，絡合金屬元素[119]，增強與細胞膜的靶向作用，激活H+-ATPase[106-109]，改善植物生長和營養(yǎng)狀況。因此，官能團—COOH 和—OH 活性位點的作用與生理活性密切相關。

3.2 醌基的電子傳遞對HS生理活性的影響

HS作為胞外電子穿梭體可以作為微生物電子受體和難溶金屬氧化物電子供體，參與生物地球化學的氧化還原過程，如重金屬由難溶的氧化態(tài)向相對易溶的還原態(tài)轉(zhuǎn)化。HS傳遞電子能力取決于分子組成中Ar—OH和醌基，其中醌基含量越高，傳遞電子能力越強[120]。研究證實，不同來源和年齡的HA 供給電子和接受電子的能力不同，13C NMR 分析結(jié)果表明，水體HA 包含電子供體較多，電子受體較少[121-122]。在土壤環(huán)境中，電子供體（如葡萄糖、有機酸、乙酸、H2等）在腐殖質(zhì)還原菌（Humic-reducing bacteria，HRB）作用下將電子傳遞給氧化態(tài)HS，醌基得到電子被還原，轉(zhuǎn)變?yōu)榘膈?，半醌通過不同機制產(chǎn)生ROS，如圖3[119]所示。在O2存在下，半醌產(chǎn)生超氧離子，在超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）作用下轉(zhuǎn)化為H2O2。通過與過渡金屬（芬頓反應）或過氧化氫（哈巴華茲反應）反應產(chǎn)生OH·，OH·能夠積極參與細胞內(nèi)氧化還原反應，調(diào)節(jié)胞內(nèi)ROS 穩(wěn)態(tài)，參與細胞內(nèi)信號傳導，而且自由基可以摻入各種有機和無機分子，包括氨基酸、肽、糖、木質(zhì)素等[66]，調(diào)節(jié)植物根系的形成和發(fā)育。此外，半醌還能將電子傳遞給可還原金屬氧化物，自身又轉(zhuǎn)變成醌基，準備參與下一輪氧化還原反應，因此醌基以循環(huán)往復方式作為氧化還原反應的催化劑，參與土壤中重金屬元素的生物地球化學循環(huán)，提高金屬元素生物可利用性和植物根系的生長發(fā)育。此外，Ar—OH 能夠與醌基通過氧化還原反應相互轉(zhuǎn)化，酚類化合物具有類激素活性，能夠增加植物光合色素，提升蒸騰速率和CO2同化作用等[9]，因此醌基的電子傳遞也是影響HS生理活性的重要因素。

圖3 醌的氧化還原循環(huán)[119]Figure 3 Redox cycle of quinone[119]

3.3 HS親水疏水平衡對HS生理活性的影響

HS 是膠體分散系統(tǒng)，具有表面活性和表面電荷特性，反映在相界面處HS 的親水疏水平衡和靜電相互作用[13]。Piccolo[23]發(fā)現(xiàn)親水/疏水比影響它們在環(huán)境中的反應。HS親水和疏水性是由分子表面化學官能團決定的，HS在溶液中處于親水疏水動態(tài)平衡，極性基團—OH、—COOH、—C=O 等決定親水性，烴類或芳香烴類決定疏水性。HS球狀結(jié)構(gòu)易于通過細胞壁孔隙，影響細胞膜的結(jié)構(gòu)，增強細胞膜的流動性和滲透性。烴類或芳香族片段決定的疏水性能夠促進HS 與細胞質(zhì)膜的融合，—OH、—COOH、—C=O 決定的親水性更易于其與細胞膜發(fā)生靶向作用，激活質(zhì)膜H+-ATPase[78，106]。HS 超分子結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性由分子內(nèi)和分子間的疏水作用、范德華力、氫鍵等決定，HS 親水疏水動態(tài)平衡受到周圍環(huán)境pH 的影響，pH 值升高，疏水作用減弱，反之，疏水作用增強。在堿性溶液中，HS 超分子結(jié)構(gòu)分子內(nèi)和分子間氫鍵和范德華力被破壞、—COOH 和R—OH 被去質(zhì)子化，導致負電荷基團相互排斥，使得分子結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)分散狀態(tài)。在酸性溶液中，HS 非共價鍵（如范德華力、π-π 和CH-π）等被破壞，使得分子逐漸變小。在pH<3的情況下，溶液中—COOH 數(shù)量增加，—COOH 質(zhì)子化促使分子內(nèi)部和分子間氫鍵數(shù)量增加，呈現(xiàn)卷曲結(jié)構(gòu)[9]，HS 分子結(jié)構(gòu)取決于溶液離子強度和pH，HS 分子結(jié)構(gòu)、化學基團空間排列影響其在細胞膜上擴散難易程度，研究證實，HS引起細胞膜去極化和膜電阻的變化，以及膜結(jié)構(gòu)的重排[15]。因此，HS 親水疏水平衡是影響其分子結(jié)構(gòu)的重要因素之一，而且其與HS 生理活性的相關性受到外界環(huán)境pH的影響。

4 結(jié)論與展望

4.1 結(jié)論

HS 是土壤中穩(wěn)定的膠體分散系統(tǒng)，穩(wěn)定性是由其結(jié)構(gòu)單元分解和合成的動態(tài)平衡來決定，受環(huán)境因素的調(diào)控。HS超分子結(jié)構(gòu)是目前被普遍接受的結(jié)構(gòu)模型。綜合國內(nèi)外相關研究進展，對HS 生理活性及其作用機制總結(jié)如下：

（1）HS 可通過促進根毛形成和側(cè)根發(fā)育、激活H+-ATPase 產(chǎn)生有利的電化學梯度以及自身酸性官能團的螯合作用等促進植物對礦質(zhì)元素的吸收利用。

（2）HS 具有類激素活性，植物根際促生細菌（PGPR）分泌物或HS 自體組分IAA 能夠激活細胞質(zhì)膜H+-ATPase，HS 還能夠增加內(nèi)源植物激素水平，促進植物生長發(fā)育。

（3）HS 通過介導信使NO 激活質(zhì)膜H+-ATPase，清除HS 與細胞作用產(chǎn)生的活性氧（ROS），HS 通過NO 和抗氧化酶調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ROS 穩(wěn)態(tài)，介導根系發(fā)育和形態(tài)結(jié)構(gòu)。

（4）HS生理活性與化學組成密切相關，其中官能團—COOH 和Ar—OH 活性位點的作用、醌基的電子傳遞以及HS 親水疏水平衡是影響HS 生理活性的重要因素。

4.2 展望

（1）鑒于HS 生物化學研究的復雜性以及生理活性研究中存在的諸多問題，未來的研究工作重點是采用現(xiàn)代分析技術研究HS分子結(jié)構(gòu)，探究HS形成途徑和穩(wěn)定機制，明確不同HS組分具備生理活性的“共性結(jié)構(gòu)原件”，探索“共性結(jié)構(gòu)原件”生理活性作用機制。

（2）HS 通過IAA 和NO 等信使分子介導細胞內(nèi)多條信號傳導途徑，其中防御信號傳導途徑與促生作用發(fā)生交叉反饋的調(diào)節(jié)機制、HS 介導ROS 穩(wěn)態(tài)機制以及微生物介導的醌基參與細胞質(zhì)膜內(nèi)外電子傳遞等機制仍需進一步研究。

（3）未來可借助基因組學、蛋白質(zhì)組學和代謝組學技術，明確HS 對細胞內(nèi)物質(zhì)和能量代謝相關基因表達的調(diào)節(jié)機制，通過代謝輪廓對比和相關代謝通路關鍵代謝產(chǎn)物的定性和定量分析，明確關鍵代謝產(chǎn)物變化規(guī)律，為HS 生理活性機制的深入研究及農(nóng)業(yè)應用提供理論參考。