美洲黑楊×大青楊染色體制片優(yōu)化及核型分析

馬曉雨，劉煥臻，孫國語，易嘉欣，李開隆

（東北林業(yè)大學 林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

楊樹是楊柳科Salicaceae 楊屬Populus高大喬木、具有生長快、分布廣、品種多、易雜交、易改良、易無性繁殖等優(yōu)良特點，在工業(yè)用材、環(huán)境綠化、生態(tài)防護和科學研究等領域發(fā)揮著重要作用。在楊樹細胞遺傳學研究中，染色體形態(tài)結構是最穩(wěn)定的細胞學特征之一[2]，染色體的觀察也是細胞遺傳學主要的研究內容。染色體制片技術是觀察染色體的基礎技術，完善的染色體制片方案可以為楊樹的倍性鑒定、種間關系和系統(tǒng)分類等提供良好的技術支撐。

早在20世紀20年代，Blackburn 研究發(fā)現(xiàn)歐洲黑楊P.nigra染色體數(shù)目為2n=38。Kesara 等對兩個地區(qū)歐洲山楊P.tremula染色體數(shù)目的研究結果也為38 條[3]。1978年我國學者對小青楊P.pseudo-simonii根尖染色體的制片技術進行了初步的研究，優(yōu)化了楊樹染色體根尖壓片技術[4]。2004年陳成彬等對三倍體毛白楊P.tomentosa和三倍體黑楊核型進行了比較分析，發(fā)現(xiàn)不同品種楊樹核型有顯著差異[5]。2015年尹麗莎等對滇楊P.yunnanensis的染色體制片技術進行了優(yōu)化[6]。近年來，已有一些染色體制片技術進行楊樹染色體行為觀察和倍性鑒定的研究，但由于楊樹屬于小染色體植物，且染色體數(shù)目較多，為楊樹染色體制片增加難度，從而導致制片效果欠佳；并且不同楊樹品種的最佳染色體制片方案也有所差異：毛白楊雜種三倍體莖尖采用V(濃HCL)∶V(乙醇)=1∶1 的混合液解離15 min 染色體制片效果較好[7]；山海關楊P.deltoides‘Shanhaiguan’×新疆楊P.albavar.pyramida根尖解離采用1 mol/L 的鹽酸60℃下解離10 min 能夠得到用以鑒定其倍性的染色體圖片[8]。目前關于美洲黑楊×大青楊雜交品種染色體制片優(yōu)化的研究未見報道，且缺乏從染色體制片到核型分析的系統(tǒng)研究。本研究從根尖長度、預處理方法和解離方式3 個染色體制片主要影響因素分析比較，優(yōu)化美洲黑楊P.deltoides×大青楊P.ussuriensis染色體制片技術，提高染色體制片效果，并進行系統(tǒng)的核型分析，為楊樹系統(tǒng)發(fā)育和遺傳育種等方面提供一定的細胞學水平的理論依據(jù)和技術基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為美洲黑楊×大青楊組培苗的根尖。母本美洲黑楊采自遼寧省金城原種場，父本大青楊采自黑龍江省青山種子園。

1.2 試驗方法

1.2.1 根尖培養(yǎng)和取材

嫩葉經(jīng)0.1%氯化汞消毒，剪成1 cm2大小接種于分化培養(yǎng)基（MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA）中，待幼苗生長高度達3 cm 時接種于生根培養(yǎng)基（1/2MS+0.3 mg/L IBA）中，待根生長分別達到0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 cm 時，于9:00—10:00 剪取粗壯嫩根，取其根尖分別置于飽和對二氯苯溶液中0℃處理1 h，每個長度取20 條根尖。

1.2.2 預處理

預試驗發(fā)現(xiàn)根發(fā)育至1.5 cm 時，其根尖分生區(qū)細胞分裂最為活躍，采用0.2%秋水仙素、飽和對二氯苯和兩者1∶1 混合液3 種試劑分別對發(fā)育至1.5 cm 新生根的根尖進行預處理，于0℃下，分別處理1、2、3 h，每種預處理取20 條根尖。

1.2.3 固定

預處理后的根尖用蒸餾水沖洗3 次，轉入現(xiàn)配的卡諾氏固定液（無水乙醇∶冰乙酸=3∶1）中4℃固定24 h。固定后，蒸餾水洗凈根尖，置于70%乙醇中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 染色體制片

采用1 mol/L 鹽酸酸解法，根據(jù)以往研究顯示，酸解法在60℃或25℃下能夠取得較好解離效果[14,22]。本研究分別在25℃下酸解12、14、16、18 min，60℃下酸解6、8、10、12 min。酸解后蒸餾水沖洗5次，無菌濾紙吸干根尖表面水分，切取根尖分生區(qū)置于載玻片上，用卡寶品紅染液染色9 min，然后進行常規(guī)壓片，并用奧林巴斯（BX43）進行鏡檢。

1.2.5 核型分析

40 倍物鏡下，統(tǒng)計中期分裂細胞及分散相較好細胞所占比例；100 倍油鏡下，選取30 個以上染色體形態(tài)及分散良好分裂相進行染色體計數(shù)。選取5 個染色體形態(tài)輪廓清晰且無重疊的細胞進行核型分析。利用Adobe Photoshop 7.0.1 對染色體進行配對，迅捷CAD 編輯器進行染色體長度測定，Excel 2010 進行數(shù)據(jù)匯總和核型參數(shù)的計算。按李懋學等所提核型標準進行分析[9]；著絲粒位置命名方式參照Levan 的方法[10]；核型模式圖按喬永剛等提出的方法[11]進行繪制。

2 結果與分析

2.1 染色體制片技術的優(yōu)化

2.1.1 不同根發(fā)育長度對制片效果的影響

隨著根長度的增加，中期細胞和適合核型分析的中期細胞所占比例均呈先增加后減少的趨勢（表1）。在根生長至1.5 cm 時，中期細胞占比和適合核型分析的細胞占比均達到最高，分別為1.69%和15.56%；根長達0.5 cm 時，適合核型分析的細胞占比最低，為6.23%；根長達2.5 cm 時，中期細胞占比最低，僅為0.68%。結果表明，在根發(fā)育過長或過短時取樣，制片效果均較差，因此，選擇根長至1.5 cm 時進行取樣，能夠獲得較多中期分裂相，利于核型分析。

表1 不同根長對制片效果影響Table 1 Effect of different root length on chromosome preparation

2.1.2 不同預處理試劑對制片效果的影響

本研究采用3 種不同試劑0℃下對根尖進行預處理，對不同試劑和預處理時間下制片效果進行統(tǒng)計（表2）。結果顯示，對二氯苯飽和水溶液處理效果最好，中期細胞總占比達到7.54%，且其中，預處理2 h 時染色體制片效果最佳，中期細胞比例為3.26%，得到的染色體形態(tài)輪廓清晰且分散良好，長度適宜（圖1E）；其次采用混合液（對二氯苯飽和水溶液∶0.2%秋水仙素溶液=1∶1）和0.2%秋水仙素溶液進行預處理時，得到的中期細胞總占比相差不多，分別為3.63%和3.43%，且其中，0.2%秋水仙素溶液預處理1 h 時，獲得的染色體清晰，分散較好，長度適宜；相同試劑預處理下，預處理時間過長均會對染色體形態(tài)產(chǎn)生一定影響，出現(xiàn)輪廓模糊，粘連拖尾等情況（圖1C、F，圖1I）。綜合上述結果，選擇對二氯苯飽和水溶液作為預處理試劑，0℃下預處理2 h，能夠獲得較多的中期細胞，且染色體形態(tài)最好，是本研究中的最佳預處理方案。

圖1 不同預處理方式對制片效果的影響Fig.1 Effect of different pretreatment methods on chromosome preparation

表2 不同預處理方式對制片效果的影響Table 2 Effect of different pretreatment methods on chromosome preparation

2.1.3 不同解離溫度和時間對制片效果的影響

圖2為不同解離溫度和時間下鏡下染色體制片效果，結果顯示，不同解離時間和解離溫度對染色體制片有顯著影響。60℃下解離6 min 時，細胞質著色，有細胞壁殘留，染色體形態(tài)不清晰，且重疊較多不分散（圖2A）；解離8 min 時，細胞質著色較淺，無細胞壁殘留，染色體部分粘連，形態(tài)清晰（圖2B）；解離10 min 時，幾乎無雜質殘留，對比度高，染色體形態(tài)清晰，分散良好（圖2C）；解離12 min 時，染色體分散性好，但由于解離過度導致細胞破裂，染色體丟失（圖2D）。綜上，60℃下解離10 min 時，染色體制片效果最佳。

25℃下解離12 min 時，細胞質著色，細胞壁殘留，染色體形態(tài)模糊堆疊（圖2E）；解離14 min 時，細胞質著色，少量細胞壁殘留，染色體形態(tài)較清晰，但粘連重疊較多（圖2F）；解離16 min 時，無雜質，對比度高，染色體形態(tài)清晰且著色效果好，但分散性一般（圖2G）；解離18 min 時，對比度高，染色體形態(tài)清晰著色效果好，分散性良好（圖2H）。綜合不同解離時間和溫度對染色體制片影響的結果，60℃解離10 min 和25℃解離18 min 均能達到較好染色體制片效果。

圖2 不同解離溫度和時間對制片效果的影響Fig.2 Effect of different acidolysis time and temperature on chromosome preparation

2.2 染色體核型分析

通過對美洲黑楊×大青楊雜種的染色體核型參數(shù)（表3）和中期分裂相、核型及其模式圖（圖3）分析，結果表明：核型公式為2n=2x=38=32m+6sm，其中16 對為中部著絲點染色體，3 對為近中部著絲點染色體，在第3 對染色體短臂上附有隨體；染色體相對長度在1.35%～4.37% 之間，臂比值在1.05%～1.87% 之間，著絲點指數(shù)在34.88%～48.76% 之間，染色體相對長度組成為2n=8L+10M2+10M1+10S；最長染色體與最短染色體相對長度之比為3.24，沒有臂比值大于2 的染色體，核型不對稱系數(shù)為56.61%，為1B 核型。

圖3 美洲黑楊×大青楊染色體中期分裂相（A）、核型圖（B）及模式圖（C）Fig.3 Metaphase map (A)、karyogra (B) and idiogram (C) of P.deltoides × P.ussuriensis chromosome

表3 美洲黑楊×大青楊雜種染色體核型參數(shù)?Table 3 Parameters of chomosome karyotype of P.deltoides × P.ussuriensis

3 結論與討論

3.1 討 論

3.1.1 不同根長度對制片效果的影響

植物染色體制片是植物細胞學的基礎技術之一，影響染色體制片效果的因素較多，其中取材、預處理方式和解離條件是較為關鍵的影響因素[12]。植物根尖分生區(qū)細胞分裂旺盛、細胞壁較薄，且根尖易培養(yǎng)、不受外界環(huán)境限制，是最為常用的染色體制片材料，其中根尖長度對中期分裂相的數(shù)量有著顯著影響[13]。根尖細胞分裂活躍性的差異不僅取決于不同的植物根尖特征，也會因同一植物不同根尖培養(yǎng)方式而有所區(qū)別。構樹Broussonetia papyrifea種子的胚根長度達1.0 cm時，其根尖有絲分裂指數(shù)最高，根過長或過短得到的分裂相均較少[14]；人參Panax ginseng組培苗誘導根尖長至2 cm，水培根尖長至1 cm，種子根尖長至1.5 cm 時，中期分裂相較多[15]；小青楊種子胚根伸長至0.5 cm 時取其根尖，能夠得到較好制片效果[4]。正常土壤中生長的根在水培條件下，不易產(chǎn)生根冠，根尖分生區(qū)細胞得不到保護，在試驗處理過程中易受損或丟失。本研究對組培苗新生根進行取材，根尖生長環(huán)境更加穩(wěn)定，得到的根尖結構完整。取材時發(fā)現(xiàn)，隨根長度的增加，根尖逐漸變細，根長為0.5 cm 時，根尖形態(tài)短粗，難以截取分生區(qū)部分；根長達2.5 cm 時，根尖形態(tài)細長，根尖分生區(qū)，處理時易折斷，導致制片效果不佳；根長度1.5 cm 時，根尖粗細均勻，長度適宜，此時取樣得到的中期分裂相細胞最多，染色體制片效果最好，這一結果與已有滇楊[16]和金盞菊[17]的相關研究結果一致。

3.1.2 不同預處理試劑對制片效果的影響

預處理方式是決定染色體制片質量的關鍵因素，該過程目的是破壞紡錘體的形成，阻止細胞繼續(xù)分裂而使其停在中期，增加中期分裂相的出現(xiàn)概率[13]。目前常用的預處理試劑主要有8-羥基喹啉、秋水仙素、飽和對二氯苯水溶液。預處理試劑和預處理時間因試驗材料不同而有所差異。山楊P.davidiana經(jīng)0.002 mol/L 的8-羥基喹啉處理4～5 h 能夠獲得較好制片效果[18]；桉樹Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis經(jīng)過0.2%秋水仙素處理2 h 取得的制片效果最好[19]；滇楊在0℃下用對二氯苯飽和水溶液處理1 h 獲得的染色體圖像清晰，著色最好[6]。染色體大小是固定因素，它決定了預處理時間的長短，由于楊樹染色體較小，預處理時間不宜過長，一般1～2 h為宜，同時，預處理時間也會因為不同植物品種的耐藥性而有所差異[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，采用對二氯苯飽和水溶液0℃下處理2 h，獲得中期分裂相最多，染色體制片效果最好，這一結果與前人對滇楊的最佳預處理溫度和試劑一致，但最佳處理時間不同?？赡苡捎诒狙芯克妹乐藓跅睢链笄鄺畹挠H本均為適宜北方生長環(huán)境的楊樹品種，而滇楊雖與大青楊同為青楊派，但主要分布于川、黔、滇等南方地區(qū)，可見生長環(huán)境與品種的差異是決定最佳預處理方式的關鍵因素，本研究也為黑楊派和青楊派及北方楊樹品種染色體制片和觀察提供了具有一定針對性的技術參考。

3.1.3 不同解離溫度和時間對制片效果的影響

常用解離方法有酶解法和酸解法，其目的是軟化和分解細胞壁，便于壓片和染色體觀察[21]。解離時間的掌控是染色體制片中十分重要的一步，時間過短，細胞壁和細胞質殘留，染色體不易分散，染色效果不佳；時間過長，導致細胞破裂，染色體受損或丟失。不同材料最適解離方法也所不同，張俊等[22]對萱草屬Hemerocallis植物根尖染色體制片技術進行研究時發(fā)現(xiàn)，同一解離液和解離溫度下，不同萱草屬的植物其解離時間也有一定差異，總結得出1 mol/L 的HCl 在60℃下解離7～8 min為宜；響葉楊P.adenopoda在鹽酸∶乙醇=1∶1 的解離液中常溫下解離25 min 可以獲得較好的染色體制片效果[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，美洲黑楊×大青楊雜種的根尖采用1 mol/L 的HCl 在60℃下解離10 min 和25℃下解離18 min 均能獲得清晰且分散性好的染色體圖像，該結果與構樹[14]、橡膠草[24]等研究結果一致。

3.1.4 染色體核型分析

染色體核型分析是細胞遺傳學的基本技術之一[25]，包括染色體數(shù)目統(tǒng)計和染色體形態(tài)結構分析，其在植物起源、分類和演化研究中占有重要位置。本研究首次對美洲黑楊×大青楊進行核型分析，得出其染色體數(shù)目38 條，染色體基數(shù)為19，為二倍體，該結論與已有的關于楊樹染色體的研究結果相吻合[26]。染色體核型為2n=2x=38=32m+6sm，這與已研究的楊樹其他品種核型有一定差異，例如河北楊P.hopeinsis染色體核型為2n=26m+6sm+6st[27]；小青楊染色體核型為2n=27m+6sm+4st+1t[28]，這種差異可能與楊樹品種、生境和染色體制片方法的不同有關。也可能因為種間的雜交使染色體核型發(fā)生變異[29]，但本研究結果顯示美洲黑楊×大青楊的大多數(shù)染色體均為中部著絲點染色體和近中部著絲點染色體，該結果與前人研究結果相符。植物的進化趨勢是由對稱向不對稱發(fā)展，說明核型不對稱系數(shù)越大，植物的進化程度越高，在已有的楊樹核型報道中，歐洲山楊、大葉楊P.lasiocarpa、小葉楊P.simonii、箭桿楊P.nigravar.thevestina、胡楊P.euphratica核不對稱系數(shù)分別為65.79%、62.33%、61.36%、58.14%、63.03%[30]。本研究結果顯示美洲黑楊×大青楊核不對稱系數(shù)為56.61%，在楊樹品種中屬于核型較對稱的原始類型，說明其起源相對較早。本研究對美洲黑楊×大青楊染色體制片技術進行了優(yōu)化，對其染色體形態(tài)結果進行了分析，為楊樹品種間親緣關系、倍性鑒定、優(yōu)良品種的選育等方面提供了細胞學上的技術支持。以往研究表明雜交可使染色體核型發(fā)生變異，本研究僅對美洲黑楊×大青楊核型進行了分析，與其親本核型間差異還未做進一步研究。今后可以對親本美洲黑楊和大青楊核型進行研究并與已有雜種核型進行比較分析，為楊樹雜交后代變異研究提供細胞學上的理論依據(jù)。

3.2 結 論

優(yōu)化的美洲黑楊×大青楊染色體制片方案為：取1.5 cm 長根的根尖，用對二氯苯飽和水溶液在0℃下預處理2 h，卡諾氏固定液固定24 h 后，在1 mol/L 鹽酸60℃下酸解10 min 或25℃下酸解18 min，最后用卡寶品紅染液染色9 min。核型分析得出：美洲黑楊×大青楊染色體數(shù)目為2n=38，基數(shù)為19，為二倍體，核不對稱系數(shù)為56.61%，核型屬于較原始的對稱類型。