N-乙酰半胱氨酸對(duì)納米細(xì)菌致大鼠腎結(jié)石形成的影響

方道成，陳立新，王 勇，唐春華，高 強(qiáng)，胡媛媛

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬松江醫(yī)院：1.泌尿外科；2.全科醫(yī)學(xué)科，上海 201600)

腎結(jié)石是一種常見(jiàn)的泌尿外科疾病，在歐洲發(fā)病率約5%～9%，亞洲1%～5%[1]。其發(fā)病率和復(fù)發(fā)率高，以草酸鈣結(jié)石最為常見(jiàn)[2]。既往人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是腎結(jié)石形成的重要環(huán)節(jié)[3]，但人們對(duì)于腎結(jié)石的具體形成機(jī)制仍未完全弄清，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌與腎結(jié)石的形成有著密切關(guān)系[4]，納米細(xì)菌可誘導(dǎo)腎小管氧化應(yīng)激，促進(jìn)腎結(jié)石的形成。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)作為臨床常見(jiàn)藥物，是谷胱甘肽合成前體，具有強(qiáng)抗氧化作用，可清除體內(nèi)已生成的自由基，干擾自由基的產(chǎn)生[5]。因此，本研究采用納米細(xì)菌建立了大鼠腎結(jié)石模型，研究NAC對(duì)納米細(xì)菌致大鼠腎結(jié)石形成的影響，旨在明確NAC對(duì)納米細(xì)菌致腎結(jié)石大鼠的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒、草酸(oxalic acid，Oxa)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自貴州國(guó)康生物制藥公司；PCR擴(kuò)增試劑盒及引物由上海生工生物工程有限公司提供；多功能酶標(biāo)儀(Bio-tech公司)；JH-722型分光光度計(jì)(上海度洋儀器有限公司)。

1.2 納米細(xì)菌分離培養(yǎng)收集2016年9月至2017年9月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬松江醫(yī)院實(shí)施泌尿外科手術(shù)的患者的腎結(jié)石標(biāo)本10例，排除感染、內(nèi)分泌疾病、多系統(tǒng)結(jié)石等患者，采集后置于-80 ℃冰箱保存。將保存的腎結(jié)石樣本去礦物質(zhì)處理(1 mol/L HCl，30 min)，然后采用PBS溶液進(jìn)行中和、洗滌，再碾碎、離心(20 000 r/min，40 min)后，經(jīng)濾膜過(guò)濾，收集濾液1 mL加入PMBI1640培養(yǎng)液(含10%熱滅活γ胎牛血清)，于pH為7.4的37 ℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2條件中培養(yǎng)，30 d換液1次。培養(yǎng)后棄上清中培養(yǎng)液，加生理鹽水、離心、去上清，加0.5 mL HCl(1 mol/L)，混勻，加入Tris中和、離心、去上清，加入配置納米細(xì)菌混懸液備用。采用16 s RNA特異性引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)鑒定納米細(xì)菌，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)凝膠電泳可見(jiàn)1 409 bp處出現(xiàn)目的條帶，確定納米細(xì)菌分離培養(yǎng)成功[6](圖1)。

M：Marker 2 000 bp；1：空白對(duì)照；2、3、4、5、6、7：不同標(biāo)本擴(kuò)增出的目的片段。

1.3 動(dòng)物造模與給藥SPF級(jí)SD(sprague dawley)雄性大鼠45只，體質(zhì)量均為180～220 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物合格證編號(hào)為01901214。通風(fēng)環(huán)境中、標(biāo)準(zhǔn)鼠糧喂養(yǎng)，飲用潔凈自來(lái)水。

將45只SD大鼠預(yù)飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為A組(空白組)、B組(對(duì)照組)和C組(實(shí)驗(yàn)組)3組，每組15只。B組和C組大鼠均經(jīng)以尾靜脈一次性注射納米細(xì)菌混懸液1 mL制備大鼠腎結(jié)石模型，A組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)組大鼠于第2日腹腔注射N(xiāo)AC[150 mg/(kg·d)]進(jìn)行干預(yù)，同時(shí)A組和B組腹腔注射等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)干預(yù)4周后，用代謝籠收集24 h尿液，處死小鼠，采集腎臟組織，備用。

1.4 HE染色觀察腎組織的病理變化取大鼠左腎，采用40 g/L多聚甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)的脫水、透明、包埋和切片，進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀察組織的病理變化以及腎組織中鈣鹽結(jié)晶形態(tài)和結(jié)晶量，并進(jìn)行鈣鹽結(jié)晶量化評(píng)分[6]。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法采集尿液，離心(3 000 r/min，20 min)，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)尿Ca2+含量，采用高錳酸鉀褪色法測(cè)定尿Oxa含量，嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。取右腎制成10%勻漿，用硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA；用黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD，嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色下腎組織的病理變化與A組相比，B、C兩組可見(jiàn)腎小管內(nèi)結(jié)晶沉積，且B組腎小管內(nèi)結(jié)晶沉積較C組明顯(圖2)。

A:腎組織內(nèi)無(wú)晶體沉積，未見(jiàn)明顯病理學(xué)改變；B:腎小管內(nèi)可見(jiàn)大量結(jié)晶形成；C:腎小管內(nèi)可見(jiàn)少量結(jié)晶沉積。

2.2 各組大鼠腎臟組織中鈣鹽結(jié)晶積分根據(jù)鈣鹽結(jié)晶量化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)得出A、B、C組積分平均值分別為1.00±0.00、3.80±0.86、2.33±0.61。3組間總體比較，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，進(jìn)一步行每?jī)山M間比較顯示：B、C組腎臟組織中鈣鹽結(jié)晶積分均高于A組，且B組高于C組(P<0.05，圖3)。

2.3 各組大鼠尿液生化指標(biāo)3組間總體比較，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，進(jìn)一步行每?jī)山M間比較顯示：與A組相比，B、C組尿液中Ca2+和Oxa水平較高(P<0.05)；與B組相比，C組尿液中，Ca2+和Oxa水平較低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠尿液Ca2+、Oxa水平比較

*與A組(空白組)比較，P<0.05；#與A組、B組(對(duì)照組)比較，P<0.05。

*與A組(空白組)比較，P<0.05；#與A組、B組(對(duì)照組)比較，P<0.05。

2.4 各組大鼠腎組織SOD、MDA水平3組間總體比較，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，進(jìn)一步行每?jī)山M間比較顯示：與A組相比，B、C組腎組織SOD水平較低、MDA水平較高(P<0.05)；與B組相比，C組腎組織SOD水平較高、MDA水平較低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腎組織SOD、MDA水平比較

SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛；*與A組(空白組)比較，P<0.05；#與A、B組(空白組)比較，P<0.05。

3 討 論

腎結(jié)石是泌尿外科常見(jiàn)的一種疾病，關(guān)于泌尿系結(jié)石形成的病因?qū)W有多種假說(shuō)，如Randall學(xué)說(shuō)、生物學(xué)說(shuō)等，年齡、肥胖、性別等都可影響結(jié)石形成，其具體發(fā)病機(jī)制尚未研究清楚，腎結(jié)石中以草酸鈣結(jié)石最為常見(jiàn)[7]。人們目前對(duì)于腎結(jié)石多注重其治療，而對(duì)疾病預(yù)防和降低復(fù)發(fā)卻未放在重心上，研究表明術(shù)后未予藥物干預(yù)的草酸鈣結(jié)石患者復(fù)發(fā)率明顯增高[8]，因此研究人員開(kāi)始關(guān)注降低腎結(jié)石的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率，以期降低患者痛苦。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)許多可降低腎結(jié)石生成的物質(zhì)，但臨床醫(yī)生希望能有一種價(jià)廉、有效、副作用少且易于獲取的藥物，因此一些臨床藥物，如NAC進(jìn)入到人們視線中。

納米細(xì)菌最早被芬蘭科學(xué)家所發(fā)現(xiàn)，其定義為一種能通過(guò)100 nm濾菌器原核微生物。研究發(fā)現(xiàn)，納米細(xì)菌存在于95%以上腎結(jié)石患者的尿液和結(jié)石中，具有獨(dú)特的礦化能力，可作為活性中心，粘附、侵入并破壞腎集合管的上皮細(xì)胞和腎乳頭細(xì)胞從而形成結(jié)晶核心，最終誘發(fā)結(jié)石形成[9]。相關(guān)研究表明納米細(xì)菌可利用自身礦化特性誘導(dǎo)結(jié)晶的形成，同時(shí)還可以損傷腎小管等腎臟結(jié)構(gòu)，兩者相互作用進(jìn)一步導(dǎo)致結(jié)石的形成，而且進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷與草酸鈣蓄積呈時(shí)間依賴(lài)性，從而損傷腎小管上皮細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致腎結(jié)石形成[4，10]。相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明對(duì)大鼠只需一次納米細(xì)菌尾靜脈注射即可成功造模，且與乙二醇、氯化銨灌胃造模所致腎結(jié)石成分一致，均為草酸鈣結(jié)石[6，11]。本次實(shí)驗(yàn)選用納米細(xì)菌造模大鼠腎結(jié)石模型，以便盡可能地模擬人體生理?xiàng)l件下結(jié)石形成條件。

NAC作為呼吸科的常用藥物，是一種含硫集化合物的谷胱甘肽的合成前體，在化痰、抗感染、治療慢性阻塞性肺疾病等方面有著良好的療效[12]。隨著對(duì)NAC的了解，研究者發(fā)現(xiàn)NAC有著抗氧化作用，可分為直接性抗氧化作用和間接性抗氧化作用，其直接作用是由于硫醇基與清除活性氧間互相作用，而間接抗氧化作用與其作為谷胱甘肽前體的作用有關(guān)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽濃度升高從而發(fā)揮抗氧化作用[13]。NAC是谷胱甘肽合成前體，具有調(diào)整基因的表達(dá)、抗細(xì)胞凋亡、抗血管生成等作用，谷胱甘肽是體內(nèi)一種含硫基最多的化合物，可作用于有機(jī)過(guò)氧基，發(fā)揮清除作用。NAC進(jìn)入體內(nèi)后可迅速脫去乙?；?yōu)榘腚装彼幔芙Y(jié)合活性氧使其失效，穩(wěn)定胞內(nèi)大分子物質(zhì)，穩(wěn)定細(xì)胞膜及胞內(nèi)膜相結(jié)構(gòu)，從而增進(jìn)谷胱甘肽的抗氧化功能[14]。相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NAC的抗氧化作用在保護(hù)心肌、腎臟組織、肝臟組織也可發(fā)揮作用[15-17]。SOD酶是體內(nèi)一種重要的氧自由基清除劑，能夠結(jié)合活性氧，當(dāng)活性氧增多過(guò)度破壞體內(nèi)氧化還原平衡時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而產(chǎn)生MDA，因此MDA的濃度可反應(yīng)體內(nèi)氧化程度。

本研究發(fā)現(xiàn)，納米細(xì)菌致腎結(jié)石大鼠腎臟組織中草酸鈣結(jié)石明顯增加，尿液中Ca2+、Oxa升高，經(jīng)NAC干預(yù)后，腎臟組織中草酸鈣結(jié)石明顯減少，尿Ca2+、Oxa顯著下降，腎組織中MDA下降、SOD上升。這提示NAC可能通過(guò)降低氧化應(yīng)激反應(yīng)而抑制腎結(jié)石的形成，這也與國(guó)內(nèi)臨床研究結(jié)果相符合[18]。當(dāng)然本研究仍有些許不足之處，首先是實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量較少，可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定誤差；其次對(duì)NAC的使用方法仍有待進(jìn)一步研究。但本研究為NAC在納米細(xì)菌致腎結(jié)石的應(yīng)用中提供了一定的理論支持。