外周神經(jīng)脫髓鞘病變?cè)谔悄虿∩窠?jīng)病理性疼痛發(fā)生發(fā)展中的作用*

廖華寶 胡江建 張笑丹 黃瑞紫 宋學(xué)軍△

（1 南方科技大學(xué)疼痛醫(yī)學(xué)中心，深圳 518055；2 南方科技大學(xué)醫(yī)院圍術(shù)期醫(yī)學(xué)部，深圳 518055）

糖尿病、癌癥和心血管疾病位列我國(guó)乃至全球發(fā)病率最高的三大疾病，嚴(yán)重威脅人類健康。近年來(lái)，我國(guó)糖尿病患病率急劇上升，給社會(huì)發(fā)展帶來(lái)嚴(yán)重挑戰(zhàn)[1]。糖尿病神經(jīng)病 (diabetic neuropathy) 是糖尿病中晚期常見(jiàn)的并發(fā)癥。臨床上，近50%糖尿病病人伴隨神經(jīng)病變，其中有25%～50%病人會(huì)產(chǎn)生糖尿病神經(jīng)病理性疼痛 (diabetic neuropathic pain, DNP)[2]。DNP 癥狀包括針刺樣疼痛、灼燒感、痛覺(jué)過(guò)敏、痛覺(jué)超敏、自發(fā)痛、感覺(jué)缺失等。DNP的發(fā)生發(fā)展機(jī)制包括高血糖引起血管病變和神經(jīng)損傷。高血糖通過(guò)激活多元醇通路，造成山梨醇和果糖的大量堆積，形成胞內(nèi)高滲透壓，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞變性以及死亡。氧化應(yīng)激和氮化應(yīng)激產(chǎn)生大量活性氧和一氧化氮，增加血管通透性，促進(jìn)糖尿病疼痛發(fā)展。高血糖引發(fā)晚期糖基化終末產(chǎn)物 (advanced glycation end products, AGEs) 聚集以及線粒體功能障礙，引起血管和神經(jīng)病變[3,4]。神經(jīng)病變多體現(xiàn)在軸突功能異常、軸突再生障礙、纖維密度降低、脫髓鞘病變，以及膠質(zhì)細(xì)胞活性改變等。髓鞘是保護(hù)軸突，維持正常神經(jīng)傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[5]。在中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)中，髓鞘病變都會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能異常和缺失[5,6]。研究表明，外周神經(jīng)脫髓鞘病變是DNP 發(fā)生發(fā)展和維持的重要原因[6～8]。然而，針對(duì)DNP 的機(jī)制研究和臨床治療依然非常有限。傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痛藥對(duì)DNP 具有一定的療效[9～11]，但缺乏針對(duì)性，因此其效果有限。同時(shí)，這些藥物的使用受到安全性、成癮性和耐受等問(wèn)題限制。

在研究糖尿病及其疼痛機(jī)制時(shí)，必須注意到臨床上有一部分晚期糖尿病病人并不會(huì)出現(xiàn)明顯的疼痛癥狀[12]。同樣，在糖尿病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，并非所有高血糖個(gè)體都出現(xiàn)痛敏，但這一現(xiàn)象以及背后的機(jī)制在既往的研究中往往被忽視，直到最近證明并明確指出這個(gè)問(wèn)題[13]。在糖尿病疼痛模型中，與正常組相比，具有兩個(gè)變量—高血糖和疼痛。而糖尿病疼痛組與糖尿病非疼痛組之間，僅僅單一變量—疼痛，分析疼痛個(gè)體與非疼痛個(gè)體間的差異和關(guān)系，這對(duì)研究DNP的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制至關(guān)重要。本研究著重探討高血糖疼痛和高血糖非疼痛動(dòng)物，在外周神經(jīng)中的理化特性的差別及其對(duì)應(yīng)的臨床疼痛癥狀，為糖尿病疼痛的機(jī)制研究提供更精準(zhǔn)可靠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头治觥?/p>

方 法

1.藥物、試劑和儀器

鏈脲佐菌素（sigma，美國(guó)），vonFrey filament（Aesthesio，美國(guó)），共聚焦熒光顯微鏡（Nikon，日本），RNA 提取試劑(Total RNA miniprep kit, Axygen)，cDNA 合成試劑(AT311-03, Transgene)，MBP抗體 (ab40390, Abcam)，Alexa Fluor 488 (4412s, CST)，透射電子顯微鏡（日立，日本）。

2.動(dòng)物造模及分組

雄性C57BL/6 小鼠，體重20～25 g；雄性SD大鼠，體重220～250 g，購(gòu)買自廣東省醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心，SPF 環(huán)境飼養(yǎng)，自由進(jìn)食。本研究涉及的所有動(dòng)物操作，均嚴(yán)格遵循南方科技大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定（倫理批準(zhǔn)號(hào)SUSTC-JY2019144，SUSTC-JY2019095），由通過(guò)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作考核的人員參與執(zhí)行。禁食12 h 后，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射鏈脲佐菌素 (streptozocin, STZ)，小鼠連續(xù)注射5 天，每天40 mg/kg；大鼠單次注射，劑量為70 mg/kg。對(duì)照組注射溶劑枸櫞酸鈉緩沖溶液。最后一次注射記為第0 天，此后每周測(cè)量動(dòng)物空腹血糖，連續(xù)2 周血糖值高于13.8 mM（小鼠）[14]和16.7 mM（大鼠）[15]，即視為成功的糖尿病模型，并根據(jù)其痛閾是否降低，分組如下：糖尿病疼痛組 (STZ-pain)、糖尿病非疼痛組 (STZ-nonpain)和對(duì)照組 (Control)。第42天取材。

3.機(jī)械痛閾值

造模前1 天和造模后第7、14、21、28、35、42 天測(cè)試機(jī)械痛閾。動(dòng)物鼠置于金屬網(wǎng)架的透明格子中，適應(yīng)20 min，用vonFrey filament 測(cè)試。小鼠使用0.07 g～2 g 的纖維絲 (0.07 g、0.16 g、0.4 g、0.6 g、1.0 g、1.4 g、2.0 g)，從0.6 g 開(kāi)始使用。大鼠使用2 g～15 g 的纖維絲 (2 g、4 g、6 g、8 g、10 g、15 g)，從2 g 開(kāi)始，刺激動(dòng)物后足底中部2～3 s，出現(xiàn)快速縮足或舔足反應(yīng)，記為陽(yáng)性 “1”，反之，為陰性 “0”。兩次刺激之間至少間隔15 s。機(jī)械痛閾值計(jì)算在結(jié)果圖中換算成力學(xué)單位毫牛頓 (mN)。

4.免疫熒光染色檢測(cè)坐骨神經(jīng)髓磷脂堿性蛋白

小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，從心臟灌注0.1 M 的PBS 和4% PFA，取坐骨神經(jīng)置于4% PFA 中固定24 h，隨后置于30%蔗糖溶液脫水2 天，OCT 膠包埋組織并冰凍切片，切片厚度為20 μm，加入5%BSA（含0.3% TritonX-100）室溫封閉1 h，然后使用MBP 一抗(1:100)，4℃孵育過(guò)夜(> 18 h)，次日用0.1 M PBS 洗滌5 min×3 次，加入二抗Alexa Fluor 488 (1:500)，室溫孵育1 h。之后用0.1 M PBS洗滌5 min×3 次。封片劑封片。共聚焦顯微鏡下拍攝。

5.坐骨神經(jīng)mRNA 分析檢測(cè)

小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后，心臟灌注0.1 M 的PBS，取坐骨神經(jīng)，約1 cm 長(zhǎng)，用RNA 提取試劑盒提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用q-PCR 檢測(cè)MPZ, MAG 和SOX 10 的mRNA 表達(dá)水平。

6.坐骨神經(jīng)電鏡觀察

取坐骨神經(jīng)，在2.5%戊二醛固定液中4℃過(guò)夜；更換新的2.5%戊二醛，后固定4 h；0.1 M 的PBS 漂洗15 min×3 次；1% 四氧化鋨液固定2 h，PBS 漂洗15 min×3 次；乙醇和丙酮逐級(jí)脫水，每次10 min；置入環(huán)氧丙烷中30 min；純包埋液37℃浸透2～3 h；包埋劑中4℃下固化2～3 天；制成超薄切片（厚度50 nm）；最后依次用醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，各30 min，電鏡拍攝。統(tǒng)計(jì)各組的纖維厚度，髓鞘厚度以及g-ratio 值。g-ratio = 纖維內(nèi)徑/外徑，g-ratio 值越大，表示髓鞘越薄。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件統(tǒng)計(jì)并生成圖表，Image J 軟件統(tǒng)計(jì)免疫熒光的強(qiáng)度。所有計(jì)量數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±SEM)表示，行為數(shù)據(jù)采用two-way ANOVA 分析，Western blot、電鏡、Q-PCR 以及免疫熒光結(jié)果多組間的比較采用one-way ANOVA分析。P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. STZ 誘導(dǎo)血糖增高和機(jī)械痛閾值降低

腹腔注射STZ 后，小鼠體重增長(zhǎng)緩慢甚至下降（見(jiàn)圖1A），血糖逐漸升高，在第14 天達(dá)到峰值并趨于穩(wěn)定，第42 天，78%的小鼠發(fā)展成糖尿?。ㄒ?jiàn)圖1B，表1）。同時(shí)，第7 天起，部分小鼠機(jī)械痛閾顯著下降（即STZ-pain）；第14 天及之后，小鼠痛閾穩(wěn)定，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；至第42 天，約72%的糖尿病小鼠出現(xiàn)顯著機(jī)械痛敏，占總數(shù)56%（見(jiàn)圖1C，表1）。但仍然有28%的糖尿病個(gè)體痛閾不變 (STZ-nonpain)，占總數(shù)的22%（見(jiàn)圖1C，表1）。

在SD 大鼠實(shí)驗(yàn)中，同樣發(fā)現(xiàn)注射STZ 后第42天，95%動(dòng)物發(fā)展成糖尿病（見(jiàn)圖1D，1E，表1）。第12 天起，部分個(gè)體機(jī)械痛閾顯著下降 (STZ-pain)；第42 天，46%的糖尿病大鼠出現(xiàn)顯著痛敏，占動(dòng)物總數(shù)的43.8%，而54%的糖尿病大鼠的機(jī)械痛閾無(wú)顯著變化 (STZ-nonpain)，占動(dòng)物總數(shù)51.3%（見(jiàn)圖1F，表1）。這些結(jié)果表明，STZ 誘導(dǎo)的大小鼠糖尿病模型中，依然有相當(dāng)一部分動(dòng)物不出現(xiàn)明顯的疼痛行為學(xué)癥狀。

圖1 STZ 誘導(dǎo)的糖尿病模型機(jī)械痛閾值改變(±SEM)Fig. 1 STZ-induced hyperglycemia and mechanical hypersensitivity (±SEM)

表1 STZ 誘導(dǎo)糖尿病性高血糖和機(jī)械性疼痛發(fā)生率Table 1 Incidence of STZ-induced hyperglycemia and mechanical allodynia in rats and mice

2.糖尿病神經(jīng)病理性疼痛小鼠坐骨神經(jīng)脫髓鞘病變

髓鞘病變導(dǎo)致神經(jīng)功能異常和缺失，包括軀體感覺(jué)異常。對(duì)比糖尿病疼痛組(STZ-pain)和糖尿病非疼痛組(STZ-nonpain)小鼠的坐骨神經(jīng)纖維形態(tài)可知，STZ 誘導(dǎo)的糖尿病疼痛組(STZ-pain)的g-ratio值顯著大于對(duì)照組(Control)和非疼痛組(STZ-nonpain)，而STZ-nonpain 組坐骨神經(jīng)的形態(tài)無(wú)顯著變化（見(jiàn)圖2 A-C）。這些結(jié)果表明，糖尿病疼痛小鼠的坐骨神經(jīng)髓鞘厚度顯著低于對(duì)照組和糖尿病非疼痛組。在病理?xiàng)l件下，有髓鞘的傳入神經(jīng)纖維中，Aβ 和Aδ 纖維都參與傷害性信息的傳遞，特別是與機(jī)械痛敏密切相關(guān)[12]。在STZ-pain 組的坐骨神經(jīng)中，直徑小于5 μm 的纖維的g-ratio 值顯著升高，即髓鞘厚度顯著下降。而直徑在5 μm 以上的纖維的g-ratio 值沒(méi)有顯著變化。STZ-nonpain 組中，g-ratio值雖有微弱升高，但并不顯著（見(jiàn)圖2D）。

對(duì)各組坐骨神經(jīng)中的神經(jīng)纖維內(nèi)徑（髓鞘以內(nèi)的軸突直徑）、外徑（含髓鞘）以及髓鞘厚度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，各組纖維的平均內(nèi)徑無(wú)差別（見(jiàn)圖2E）。與對(duì)照組相比，STZ-nonpain 小鼠神經(jīng)纖維的外徑無(wú)顯著變化（見(jiàn)圖2F），髓鞘的絕對(duì)厚度降低，但仍顯著高于STZ-pain 組（見(jiàn)圖2G）。STZ-pain 組的外徑和厚度均顯著降低，且顯著低于STZ-nonpain 組（見(jiàn)圖2F，2G)。因此，STZ 誘導(dǎo)糖尿病后，機(jī)械痛敏小鼠的坐骨神經(jīng)發(fā)生顯著的脫髓鞘，但非疼痛個(gè)體無(wú)此病變。

圖2 STZ 誘導(dǎo)的糖尿病神經(jīng)病理性疼痛小鼠坐骨神經(jīng)脫髓鞘(±SEM)Fig. 2 STZ-induced demyelination of the sciatic nerves in STZ-pain mice (±SEM)

3. STZ 誘導(dǎo)的糖尿病神經(jīng)病理性疼痛模型的坐骨神經(jīng)髓鞘相關(guān)蛋白表達(dá)降低

髓鞘堿性蛋白 (myelin basic protein, MBP) 是一種富集在中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘膜蛋白，對(duì)髓鞘形成起著重要作用。免疫組化結(jié)果顯示，STZ 注射后第42 天，STZ-pain和STZ-nonpain 組的MBP 蛋白表達(dá)量均下調(diào)（見(jiàn)圖3A，3B）。與對(duì)照組相比，STZ-pain 組的MBP表達(dá)水平下降近41%，STZ-nonpain 組MBP 下調(diào)不足20%（見(jiàn)圖3B）。

髓鞘蛋白P0 (myelin protein zero, MPZ)是外周髓鞘的一種主要結(jié)構(gòu)組分，MPZ 基因的破壞會(huì)導(dǎo)致髓鞘形成減少和軸突的降解。髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin associated glycoprotein, MAG)在外周神經(jīng)系統(tǒng)中由施萬(wàn)細(xì)胞形成，它與髓磷脂和髓鞘上其他分子之間的相互作用為軸突長(zhǎng)期穩(wěn)定所必需。STZ 誘導(dǎo)的STZ-pain 小鼠坐骨神經(jīng)MPZ 和MAG 的mRNA 含量減少，而STZ-nonpain 組并無(wú)變化（見(jiàn)圖3C，3D）。SOX10 作為髓鞘的標(biāo)記分子，STZ 誘導(dǎo)高血糖及疼痛后，其mRNA 表達(dá)并未改變（見(jiàn)圖3E）。綜上結(jié)果表明，MBP 蛋白下降以及MPZ 和MAG 的mRNA 含量降低，與髓鞘的破壞呈正相關(guān)。

圖3 STZ 誘導(dǎo)的糖尿病神經(jīng)病理性疼痛小鼠的坐骨神經(jīng)中MBP、MPZ 和MAG 表達(dá)變化(±SEM)Fig. 3 STZ-induced alteration of expression of MBP, MPZ, and MAG in the sciatic nerves in STZ-pain mice (±SEM)

討 論

晚期糖尿病病人有明顯的血管病變和神經(jīng)病變，這些病變多發(fā)生于遠(yuǎn)端，尤其是四肢，并伴隨嚴(yán)重的疼痛，這類疼痛與神經(jīng)病變密切相關(guān)。同時(shí)，自發(fā)或STZ 誘導(dǎo)的糖尿病動(dòng)物模型中，有相當(dāng)比例動(dòng)物并沒(méi)有痛敏癥狀，這與臨床觀察病例情況是很相似的。既往有關(guān)DNP 的基礎(chǔ)研究中，常進(jìn)行簡(jiǎn)單的對(duì)照和治療組間的比較分析，忽略糖尿病中很多個(gè)體存在疼痛和無(wú)疼痛的差別。DNP 組與正常組之間存在諸如血糖濃度、痛閾等多種變量，使研究結(jié)果的分析復(fù)雜化，結(jié)論不夠明確或者模糊不清。本研究區(qū)分糖尿病鼠中疼痛和非疼痛個(gè)體，發(fā)現(xiàn)STZ 誘導(dǎo)的大小鼠糖尿病模型中，僅半數(shù)出現(xiàn)機(jī)械痛閾下降。小鼠糖尿病模型中，78%出現(xiàn)持續(xù)高血糖。但僅56%的個(gè)體高血糖并伴隨痛閾降低。大鼠糖尿病模型中，95%出現(xiàn)持續(xù)高血糖，只有43.8%痛閾下降，另51.3%痛閾不變。本研究大鼠和小鼠采用不同的STZ 注射方式，他們的高血糖發(fā)生率差別較大，這可能提示大鼠和小鼠對(duì)STZ 的反應(yīng)以及抵抗程度不同，其具體原因尚待探究。根據(jù)糖尿病動(dòng)物的痛閾差異，將動(dòng)物分成糖尿病疼痛和非疼痛個(gè)體，進(jìn)一步分析了其外周神經(jīng)的病變情況。

外周神經(jīng)系統(tǒng)中，施萬(wàn)細(xì)胞包裹著軸突，并形成髓鞘。已有報(bào)道糖尿病病人常伴隨有外周神經(jīng)損傷，例如軸突損傷、纖維缺失、髓鞘的降解。糖尿病性神經(jīng)病變更易損害感覺(jué)神經(jīng)，直到晚期才發(fā)生運(yùn)動(dòng)神經(jīng)（有髓鞘）和功能的損傷[16]，這揭示了無(wú)髓鞘的神經(jīng)纖維更易受到侵害損傷，最終導(dǎo)致軸突損傷甚至喪失。本研究分析了糖尿病疼痛和非疼痛個(gè)體的坐骨神經(jīng)髓鞘的變化，發(fā)現(xiàn)糖尿病疼痛組的髓鞘g-ratio 高于非疼痛組，髓鞘厚度降低；主要傳遞傷害性信息傳入的中小直徑纖維的髓鞘降低更加顯著。同時(shí)，糖尿病非疼痛組的神經(jīng)髓鞘并無(wú)顯著變化。為進(jìn)一步探討引起髓鞘改變的原因，檢測(cè)了與坐骨神經(jīng)髓鞘生成和維持相關(guān)的分子 (MBP, MPZ和MAG) 的表達(dá)情況。STZ 注射后第6 周，相比糖尿病非疼痛組，糖尿病疼痛組的MBP 蛋白下調(diào)，MPZ 和MAG 的mRNA 顯著下降，這與坐骨神經(jīng)脫髓鞘現(xiàn)象一致。MBP 等分子的表達(dá)減少可以引起施萬(wàn)細(xì)胞損傷，進(jìn)而引起髓鞘缺損和厚度降低。軸突失去髓鞘保護(hù)后，容易受到來(lái)自病變組織和血液中炎性因子和ROS 等分子的攻擊，導(dǎo)致軸突損傷甚至缺失[17]。同時(shí)，生理狀態(tài)下施萬(wàn)細(xì)胞參與葡萄糖代謝，產(chǎn)生乳酸，可以為軸突供能；高血糖狀態(tài)下，施萬(wàn)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量乳酸，引起軸突酸中毒，激活酸敏感通道和TRPV1 等，引起疼痛[18]。這些結(jié)果更加準(zhǔn)確地表明，外周神經(jīng)髓鞘的病變和缺失對(duì)DNP的發(fā)展和維持至關(guān)重要。

本研究并未深入探索脫髓鞘的關(guān)鍵分子機(jī)制和改善方案，以及在糖尿病疼痛的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中髓鞘的動(dòng)態(tài)變化，髓鞘的改變?cè)谔悄虿〉陌l(fā)生和發(fā)展階段的作用有待進(jìn)一步研究。治療糖尿病疼痛的藥物很多，包括5-羥色胺再攝取抑制劑、三環(huán)類抗抑郁藥、抗驚厥藥、嗎啡、以及辣椒堿等局部用藥。前四類為全身用藥，不良反應(yīng)多，而局部用藥不良反應(yīng)小?；谔悄虿∩窠?jīng)病及疼痛成因的復(fù)雜性，單獨(dú)用藥效果并不理想，現(xiàn)多應(yīng)用聯(lián)合用藥緩解和治療糖尿病疼痛。已知甲鈷胺、生長(zhǎng)因子、維生素等營(yíng)養(yǎng)類藥物可以促進(jìn)磷脂的合成，修復(fù)髓鞘，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)，緩解神經(jīng)病變和疼痛[19～21]。因糖尿病外周神經(jīng)病變多發(fā)生于四肢末端，可考慮局部用藥，促進(jìn)髓鞘再生和神經(jīng)修復(fù)。結(jié)合本研究結(jié)果，修復(fù)髓鞘是減輕DNP 的治本性有效策略。

綜上所述，本研究強(qiáng)調(diào)糖尿病疼痛個(gè)體和非疼痛個(gè)體的差別，將分析的變量控制為單一因素—痛覺(jué)異常，通過(guò)比較糖尿病疼痛組和非疼痛組的髓鞘特性，更精確地說(shuō)明了坐骨神經(jīng)脫髓鞘在DNP的發(fā)展和維持階段的重要作用，進(jìn)一步為DNP 的藥物研究和臨床治療提供理論依據(jù)。