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    基于全基因組測序篩選腰椎管狹窄癥易感基因突變位點

    2021-12-01 01:51:31SuriP,StanawayIB,ZhangY
    中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志 2021年7期
    關(guān)鍵詞:數(shù)據(jù)庫差異研究

    腰痛 (low back pain, LBP) 是美國公民就醫(yī)的第五大病因,也是致殘的主要原因。LBP 發(fā)病率高,社會影響大,但病因尚未明確。有效識別LBP 的遺傳易感因素將是探索發(fā)病機制和探究新療法的一種有效途徑。LBP 的廣義遺傳力高達40%,顯示其與遺傳因素密切相關(guān)。基于兩項全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)數(shù)據(jù)確定了LBP 相關(guān)易感基因突變位點,表明遺傳因素是LBP 的生物-心理-社會模式的基礎(chǔ),開啟了LBP 遺傳機制研究的大門。在醫(yī)學(xué)上LBP作為一種臨床癥狀,而非一項診斷。臨床上被普遍接受的兩種常用診斷分別為腰骶神經(jīng)根性疼痛或腰骶神經(jīng)根綜合征(LSRS)和腰椎管狹窄癥 (LSS),其他診斷缺乏診斷標準。因此,LBP 的研究多集中在“非特異性(原發(fā)性)腰痛”方向,并未考慮潛在的外周致病因素,忽略了與LBP 相關(guān)疾病的表型異質(zhì)性可能會降低通過GWAS 探索致病基因統(tǒng)計學(xué)效力。臨床上也可通過疾病特定的“內(nèi)在表型”進行診斷,例如公認的LSRS 和LSS 臨床綜合征。通常在病人自訴不清的情況下可在規(guī)范化臨床診療中通過電子病歷 (EHR) 關(guān)聯(lián)的遺傳生物庫數(shù)據(jù)進行診斷。該遺傳生物數(shù)據(jù)庫可提供病人及受試者較為全面的病史,進而實現(xiàn)更準確的疼痛表型分型。

    本項研究中,利用EHR 生物庫數(shù)據(jù)資源探討了LBP 和腰椎疾病的潛在遺傳學(xué)發(fā)病機制。首次發(fā)現(xiàn)LBP 相關(guān)易感基因突變位點,同時確定與LSRS和LSS 相關(guān)的易感基因突變位點,最后利用EHR生物庫數(shù)據(jù)進行GWAS 分析確定了LBP 和腰椎疾病相關(guān)的易感基因突變位點的表現(xiàn)型。

    1. 研究方法

    (1)概述:GWAS 被稱為“不可預(yù)知的”或“沒有假設(shè)的”基因篩選方法。對兩項獨立的來源于電子病歷、基因組學(xué)網(wǎng)絡(luò)和格伊辛格衛(wèi)生系統(tǒng)的GWAS 數(shù)據(jù)進行薈萃分析篩選易感突變基因,并在UKB 的獨立樣本中對篩選的有顯著差異的突變基因進行了體外驗證。

    (2)腰痛和腰椎疾病的分型:該研究嚴格按照EHR數(shù)據(jù)庫和國際通用疾病分類編碼第9版 (ICD-9)中對腰痛和腰椎疾病的定義將納入病例分為病例組和對照組。其中病例組包括:①需醫(yī)療干預(yù)的腰痛(LBP-HC 型);②腰骶神經(jīng)根綜合征(LSRS 型);③腰椎管狹窄癥(LSS 型);④腰椎源性神經(jīng)病理性疼痛(LSRS/LSS 型)。為確保所有觀察者的有效隨訪時間,納入年滿18 歲且規(guī)律接受醫(yī)療服務(wù)隨訪滿1 年的受試者。需醫(yī)療干預(yù)的LBP-HC 型病人臨床上伴或不伴有下肢神經(jīng)性疼痛,在疾病分類中屬于非特異性(原發(fā)性)腰痛,很難劃分到其他分型亞組中??苫贓HR 的層次化分類算法來區(qū)分LSRS 型和LSS 型,LSRS 型病人通常合并有坐骨神經(jīng)病變、梨狀肌綜合征、骶髂關(guān)節(jié)疼痛等癥狀;LSS 型病人主要表現(xiàn)為神經(jīng)源性跛行和腰椎管狹窄為主的癥狀。

    (3)基因分型:eMERGE 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)主要使用Illumina 平臺和Affymetrix 83 數(shù)組芯片技術(shù)對樣本進行基因分型。單核苷酸突變位點 (SNVs) 的檢測由密歇根基因插補網(wǎng)頁工具完成。所有受試者均簽署知情同意書,同時批準可獲取eMERGE3 數(shù)據(jù)庫信息。

    (4)疾病表型和基因分型的體外驗證:初步探索顯著差異的突變基因,隨后通過UKB 進行大樣本體外驗證,UKB 中研究人群與英國普通人群在疼痛發(fā)病率及相關(guān)社會人口和心理因素關(guān)系具有相似性。UKB 的腰骶神經(jīng)根綜合征(LSR-UKB)是指有一個或多個ICD-10 診斷編碼提示LSR 或“坐骨神經(jīng)痛”或“椎間盤突出/滑脫”的病例;將沒有ICD-10 診斷編碼提示LSR 和“坐骨神經(jīng)痛”或“椎間盤突出/滑脫”的病例劃分到對照組;LSS 和LSS/LSRS 型的對照組和病例組使用相似的方法進行分組。

    (5)統(tǒng)計學(xué)分析:參與者種族限于歐洲人群以便最大可能降低遺傳異質(zhì)性,其中三級親屬和近親參與者排除在外。在eMERGE3 數(shù)據(jù)庫樣本的GWAS 分析中,設(shè)置過濾閾值如下:次等位基因頻率 (MAF) < 0.005,插補系數(shù)r2< 0.3,哈迪溫伯格平衡檢驗 (HWE)P< 10-6,基因分型率 < 0.98,個體率 < 0.98。在Geisinger 數(shù)據(jù)庫樣本的GWAS 分析中,設(shè)置過濾閾值如下:MAF < 0.01、插補系數(shù)r2< 0.3或 < 0.4(根據(jù)陣列來確定),HWEP< 10-15,基因分型率 < 0.90,個體率 < 0.90。在PLINK 1.9 中,對性別、年齡、特異性位點和種族自1~10 進行了調(diào)整,并采用基因型加性模型對插補的SNVs 進行Logistic 回歸分析。通過設(shè)置SNVs 的濾過閾值進行了質(zhì)量控制,濾過參數(shù)如下:MAF < 0.01,插補系數(shù)r2< 0.03,HWEP< 10-6,BETA ≥10,SE ≤0或≥10,預(yù)期次等位基因計數(shù)≤100。

    薈萃分析使用METAL 軟件,P< 5×10-8作為在全基因組分析中具有統(tǒng)計學(xué)意義的標準。利用連鎖不平衡評分回歸方法計算遺傳性。根據(jù)文獻報道LBP 的患病率 (84%) 和因LBP 而尋求醫(yī)療干預(yù)比率(58%),推算普通人一生中因LBP 尋求醫(yī)療干預(yù)的患病率為48.7%,以此代表LBP-HC 的遺傳易感性。同樣,基于LSRS 和LSS 的患病率 (26%和11%) 進而估計LSRS 和LSS 和LSRS/LSS 的遺傳易感性。暫無關(guān)于以人群為基礎(chǔ)的LSRS/LSS 患病率數(shù)據(jù),因此推測其患病率略高于LSRS 的患病率 (29%)。為了量化疾病表型之間的總體共有遺傳因素,利用連鎖不平衡得分回歸計算了LBP-HC、LSRS 和LSS之間的基于SNV 的遺傳相關(guān)性 (rg),鑒于LSRS 和LSS 分型是LBP-HC 中的兩個亞組。使用圣克魯斯大學(xué)的基因組瀏覽器檢驗了全基因組范圍內(nèi)的重要SNVs 位點。通過LocusZoom 可視化方式來識別獨立的SNVs,同時使用全基因組復(fù)雜性狀分析軟件包的匯總數(shù)據(jù)聯(lián)合分析方法來檢測顯著變異的突變位點。為了鑒定已篩SNVs 位點的功能性,在GTEx 中對其進行檢測,并確定了與相鄰基因差異表達相關(guān)的變異。

    為了描述全基因組顯著SNVs 對其他性狀的潛在共有遺傳影響,使用Pheno Scanner 數(shù)據(jù)庫第2 版檢測了主要的SNVs 與其他性狀的關(guān)系 (P< 1×10-5),并在eMERGE3 中的主要SNVs 進行了全表型組關(guān)聯(lián)研究。PheWASs 能系統(tǒng)地檢測一種基因突變相關(guān)的所有表型。PheWAS 包含所有的eMERGE3 EA參與者的表型和"phecodes"定義的表型。研究了主要的SNV 和890 個具有至少2 個ICD 編碼的phecodes 之間的關(guān)聯(lián)性,P< 5.6×10-5(0.05/890)作為每個主要SNV 顯著性的閾值。

    體外研究驗證顯示有3 個SNVs 突變位點(rs12310519 [SOX5],rs7814941 [CCDC26/GSDMC]和rs3180 [SPOCK2/CHST3])與腰痛有關(guān)。另外一項研究發(fā)現(xiàn)一個與冰島人LSRS 相關(guān)的SNV (rs7831174),其所采用的篩選閾值為P< 0.05 (0.05/1)。

    2.結(jié)果

    (1)腰痛和腰椎疾病在eMERGE3 及Geisinger數(shù)據(jù)庫中的GWAS:薈萃分析研究顯示LBP-HC 的患病率為48.8%,LSRS 為19.8%,LSS 為7.9%,LSRS/LSS 為22.1%。全基因組水平研究顯示LBP-HC無顯著相關(guān)的SNV 位點,LBP-HC 的全基因組SNV遺傳率結(jié)果為觀測尺度遺傳力為3.1% (±0.5%),易感性尺度的遺傳力為4.9% (±0.8%)。

    LSRS 的SNV 遺傳率在觀察量表上為4.2%(±0.5%),在責(zé)任量表上為9.4% (±1.0%)。研究發(fā)現(xiàn)3 個突變位點與LSRS 顯著相關(guān)。差異最顯著的突變位點位于9 號染色體上NXNL2 基因(變異在5'402 KB 處)和C9orf47/S1PR3/SHC3 基因(變異在3'15 KB 處)區(qū)域間,該基因位點為rs146153280:C > G(G 等位基因比值比OR= 1.17,P= 2.1×10-9,G 等位基因頻率為0.04),其中基因C9orf47, S1PR3以及SHC3 彼此緊密排列和/或部分重疊。另2 個突變位點位于該區(qū)域rs146153280 兩側(cè),與之呈線性關(guān)系,但在以rs146153280 為主的條件性分析中并無顯著差異。

    研究顯示LSS 的觀測尺度遺傳力為2.2%(±0.5%),易感性尺度的遺傳力為8.0% (±2.0%)。研究發(fā)現(xiàn)4 個突變位點與LSS 顯著相關(guān)。其中差異最顯著的突變位點位于2 號染色體上AAK1 基因的5'端非編碼區(qū),該基因位點為rs13427243:G > A(A 等位基因OR= 1.10,P= 4.3×10-8,G 等位基因頻率為0.40)。這4 個突變位點位于基因GFPT1、NFU1 以及AAK1 片段上共計131, 465 對堿基,余3 個顯著差異突變位點與rs13427243 呈線性關(guān)聯(lián),但在以rs13427243 為主的條件性分析中并無顯著差異。

    LSRS/LSS的觀察尺度遺傳力為4.4% (±0.5%),易感性尺度的遺傳力為9.3% (±1.0%)。GWAS 結(jié)果顯示顯著突變位點與LSRS 型研究結(jié)果相同,均為位于9 號染色體上的rs146153280 (OR= 1.17,P=1.4×10-9)。另2 個突變位點在以rs146153280 為主的條件性分析中也無顯著差異。

    研究顯示腰痛與LSRS 的遺傳相關(guān)系數(shù) (rg) 為1.00,與LSS 的相關(guān)系數(shù)為0.86。LSRS 和LSS 的遺傳相關(guān)系數(shù)為0.67。

    (2)突變位點的基因型-組織表達 (genotypetissue expression, GTEx) 特征:LSRS 和LSRS/LSS的基因型-組織表達研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)與顯著差異基因突變位點(rs146153280)顯著相關(guān)的數(shù)量性狀位點(eQTL)。研究顯示LSS 型中的顯著差異突變位點rs13427243 在包括肌肉和神經(jīng)等20 種組織中在GFPT1 和NFU1 基因上具有顯著相關(guān)的表達數(shù)量性狀位點(P= 1.8×10-20-7.4×10-5)。

    (3)突變位點的表型特征:研究顯示與LSRS型相關(guān)的位于9 號染色體上的顯著差異位點rs146153280與蛋白Semaphorin-4D和C9orf47基因的表達顯著相關(guān)。與LSS 相關(guān)的位于2 號染色體上的差異位點rs13427243 與GFPT,NFU1和ANXA4的基因表達以及DNA 甲基化和組蛋白修飾表觀遺傳特征顯著相關(guān)。全表型關(guān)聯(lián)研究結(jié)果表明顯著差異突變位點在校正統(tǒng)計檢驗后發(fā)現(xiàn)與其他表型并無顯著關(guān)聯(lián)。

    (4)顯著突變基因的外部驗證:在UKB 中研究結(jié)果顯示LSRS、LSS 和LSRS/LSS 的患病率分別為5.8%、1.2%和6.4%,明顯低于在eMERGE/Geisinger 數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)的患病率 (19.8%、7.9%和22.1%)。上述在LSRS 和LSRS/LSS 疾病中發(fā)現(xiàn)的顯著差異突變位點rs146153280 在UKB 中未得到重復(fù)驗證。然而,LSS 相關(guān)差異突變位點rs13427243 在該數(shù)據(jù)庫中得到重復(fù)驗證 (OR= 1.11,P= 5.4×10-5)。

    (5)腰痛和腰骶神經(jīng)根綜合征相關(guān)顯著差異突變位點的外部驗證:在UKB 中得到驗證的LBP-HC相關(guān)顯著差異位點rs12310519:C > T (SOX5) (OR=1.05)在eMERGE/Geisinger 數(shù)據(jù)庫中同樣得到驗證(T 等位基因的OR= 1.05,P= 0.011)。此外,同樣在UKB 中得到驗證的LBP 相關(guān)顯著差異位點rs7814941: G > A (CCDC26/GSDMC) (OR= 1.04)在eMERGE/Geisinger 數(shù)據(jù)庫中也同樣得到驗證(A等位基因的OR= 1.03,P= 0.005)。但在UKB 中得到驗證的LBP 相關(guān)性突變位點rs3180 (SPOCK2/CHST3) (OR= 0.98,P= 0.09)在eMERGE/Geisinger數(shù)據(jù)庫中無法重復(fù)驗證。

    3. 討論

    本項GWAS 研究結(jié)果主要通過利用多中心的EHR 臨床數(shù)據(jù)來識別需醫(yī)療干預(yù)的LBP (LBP-HC)和兩種腰椎疾病 (LSRS和LSS) 相關(guān)的遺傳標志物。研究納入的樣本量超過10 萬,但全基因組分析未發(fā)現(xiàn)與LBP-HC 具有顯著關(guān)聯(lián)的基因突變位點。雖LSRS 和LSS 型參與者病例數(shù)相對較少,但全基因組研究新發(fā)現(xiàn)了與之相關(guān)的易感基因突變位點,包括LSS 相關(guān)的1 個易感突變位點及LSRS 相關(guān)的1個易感突變位點。隨后在UKB 中進行表型驗證,重復(fù)驗證了突變位點rs13427243 與LSS 的顯著關(guān)聯(lián)性,另外發(fā)現(xiàn)的突變位點未得到重復(fù)驗證。

    兩項研究均報告了LSS 相關(guān)遺傳位點(遺傳力67%~81%),但在全基因組分析中未證實存在易感突變位點。本研究證實LSS 相關(guān)顯著易感突變基因位點rs13427243: G > A [A 的OR= 1.10,P= 4.3×10-8]可在獨立樣本中重復(fù)驗證 (ORA = 1.11,P= 5.4×10-5),該位點主要影響GFPT1,NFU1和AAK1基因編碼,進而影響多種組織中GFPT1和NFU1的表達。目前AAK1抑制劑治療神經(jīng)痛的研究已通過動物實驗驗證,并完成了1 期臨床試驗,針對糖尿病周圍神經(jīng)痛的2 期臨床試驗正在進行中。LSS 是腰椎相關(guān)神經(jīng)性疼痛的常見病因,通過在人類GWAS 和以動物為模型的藥物研發(fā)方面的結(jié)果均顯示AAK1突變與LSS 相關(guān)。臨床上通常使用針對周圍神經(jīng)性疼痛的藥物(如加巴噴丁和普瑞巴林)來控制LSS 癥狀。如果將來AAK1抑制劑可安全有效地治療糖尿病周圍神經(jīng)痛,則可考慮AAK1抑制劑是否可用于治療LSS 引起的神經(jīng)病理性疼痛。GFPT1 基因可編碼谷氨酰胺-果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶-1,該限速酶在蛋白質(zhì)和脂質(zhì)糖基化過程中發(fā)揮重要作用。研究顯示GFPT1 基因的突變與先天性肌無力綜合征有關(guān),臨床表現(xiàn)為眼肌和延髓肌無力。NFU1基因編碼的蛋白質(zhì)在鐵硫簇生成過程中發(fā)揮重要作用,NFU1基因的突變可引起線粒體功能障礙綜合征。

    本項全基因組薈萃分析研究顯示在9 號染色體NXRS2與C9orf47基因之間區(qū)域中的突變位點rs146153280 與LSRS 和LSRS/LSS 表型顯著相關(guān)。但在UKB 中未得到重復(fù)驗證,可能因該數(shù)據(jù)庫中對腰椎疾病定義的差異而導(dǎo)致。但并未影響LSS 型中易感突變位點rs13427243 的驗證。UKB 中疾病的代碼主要來自住院系統(tǒng),代碼獲得途徑差異也造成獨立樣本重復(fù)驗證中的不一致結(jié)果。鑒于LSS 病人更多的接受住院手術(shù)治療,LSRS 病人更多的接受保守治療,所以實際納入的LSS病人數(shù)量較LSRS病人多。因此使用一致的疾病代碼對rs146153280 與LSRS 的關(guān)聯(lián)性進行重復(fù)驗證。

    本項全基因組薈萃研究結(jié)果驗證了已報道的LBP 相關(guān)易感基因位點:SOX5基因中的rs12310519 及CCDC26/GSDMC基因間區(qū)域中的rs7814941。這些突變位點在eMERGE/Geisinger 數(shù)據(jù)庫中和UKB 數(shù)據(jù)庫中均得到驗證,但另已報道的LBP 相關(guān)易感基因SPOCK2/CHST3未超過顯著性閾值,但具有一定關(guān)聯(lián)性。本研究同樣驗證了LSRS 表型中易感突變基因位點rs6651255 與需要減壓手術(shù)的腰椎間盤突出癥之間的關(guān)聯(lián)性,但在eMERGE/Geisinger 數(shù)據(jù)庫中關(guān)聯(lián)性相對小(C等位基因OR= 0.95)。研究已證實LBP-HC 易感突變基因位點rs12310519 和rs7814941 以及位于CCDC26/GSDMC區(qū)域的LBP-HC 易感突變基因位點rs7814941,通過GWASs 分析發(fā)現(xiàn)LBP 易感突變位點與該疾病嚴重程度同樣具有關(guān)聯(lián)性。本研究結(jié)果有效闡明了遺傳因素在腰椎疾病的發(fā)病機制方面的重要作用。

    本研究結(jié)果有效表明基于EHR 的特定腰椎相關(guān)診斷(如LSRS 和LSS)表型的個體變異的遺傳發(fā)現(xiàn)率更高,這一發(fā)現(xiàn)可在臨床上更好指導(dǎo)疾病型的診斷。在臨床上可有效對LBP 病人進行亞組診斷,同時提供個體化診治。例如,LSRS 或LSS 引起的頑固性神經(jīng)性下肢疼痛或肌無力的病人可優(yōu)選腰椎減壓手術(shù),但該術(shù)式不適用于下肢無神經(jīng)性癥狀/體征的軸性LBP 病人。同時,全基因組顯著突變基因關(guān)聯(lián)性分析顯示LSRS 和LBP 的遺傳力基本相同 (rg~1.0),LSS 和LBP-HC 的遺傳力高度相似(rg= 0.86),LSRS 和LSS 的遺傳力基本相同 (rg= 0.68)。LSS 與LBP 或LSRS 之間的遺傳力與已報道的不同部位的肌肉骨骼疼痛的遺傳力相似。例如,頸部疼痛和髖關(guān)節(jié)疼痛具有相似遺傳力 (rg= 0.83),頸部疼痛和膝關(guān)節(jié)疼痛具有相似遺傳力 (rg= 0.64),但全基因組研究發(fā)現(xiàn)LSRS 和LBP 的遺傳力關(guān)聯(lián)性更強。綜上所述,研究發(fā)現(xiàn)的易感突變位點與疼痛基因組學(xué)的研究結(jié)果一致,即遺傳因素在疼痛表型分類發(fā)揮重要決定作用,特定的疼痛表型對應(yīng)特定的遺傳因素。

    本研究存在一定局限性。首先LSRS 和LSS 臨床診斷代碼的差異。其中LSRS 或LSS 的診斷可通過影像學(xué)表現(xiàn)(如腰椎間盤突出或腰椎管狹窄),也可以通過該疾病的臨床綜合征診斷。因此脊柱疾病的分類越具體將直接影響研究結(jié)果的可靠性。本項全基因組研究發(fā)現(xiàn)的特定易感突變基因位點不一定是致病突變基因,僅代表增加該疾病風(fēng)險的可能。研究發(fā)現(xiàn)的位于基因GFPT1,NFU1和AAK1區(qū)域與LSS 相關(guān)的突變位點在多種組織類型的基因GFPT1和NFU1功能性eQTL 表達中發(fā)揮多種功能效應(yīng)。盡管未發(fā)現(xiàn)AAK1 基因表達與LSS 有顯著相關(guān)性,可能是由于組織范圍有限(不包括LSS 中央椎管的形態(tài)學(xué)特征)或樣本量有限影響。目前,雖研究已證實AAK1,GFPT1和NFU1中的突變位點與LSS 密切相關(guān),但具體作用機制仍未可知,推測可能是相鄰基因的差異表達產(chǎn)生一定的功能效應(yīng)。本研究結(jié)果可作為LSS 遺傳機制探索的開端,未來仍需進一步探索驗證突變位點與疾病的相關(guān)性。盡管本研究發(fā)現(xiàn)的基因突變位點與LSS 的關(guān)聯(lián)性較?。╮s13427243: G > A,初次發(fā)現(xiàn)時關(guān)聯(lián)性為 10%,驗證階段為11%),隨著對基因突變位點的進一步深入研究,預(yù)計遺傳效力會有所增加。本研究納入的對象為歐洲人群,研究結(jié)果具有一定種族局限性。

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