舒芬太尼對(duì)大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦損傷的保護(hù)作用

周有東 馬金陽(yáng) 黃 松 胡火軍 符常濤 袁 高 郭金滿 汪 雷

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是多種因素引起的腦卒中的一個(gè)亞型，主要原因是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂，病死率高[1]。SAH后腦損傷指SAH后發(fā)生的一系列病理生理過(guò)程，包括顱內(nèi)壓增高、腦血流量和腦灌注壓降低、血腦屏障受損、急性血管痙攣、腦水腫、神經(jīng)炎癥及神經(jīng)元凋亡等[2]。研究發(fā)現(xiàn)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累和氧化應(yīng)激反應(yīng)與SAH后腦損傷和繼發(fā)性缺血性神經(jīng)功能障礙密切相關(guān)[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，SAH后抗氧化相關(guān)酶減少，脂質(zhì)過(guò)氧化物增加，與不良預(yù)后密切相關(guān)[4]。有研究應(yīng)用舒芬太尼治療腦出血[5]。本研究探討舒芬太尼對(duì)大鼠SAH后腦損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組60只健康成年雄性SD大鼠，7～8周齡，體重250～500 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，許可證號(hào)[SCXK（魯）2019-0003]。該研究經(jīng)本院動(dòng)物醫(yī)學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，符合中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物制度科學(xué)研究審查委員會(huì)關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)指南。60只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和舒芬太尼組，每組20只。

1.2 動(dòng)物模型建立及干預(yù) 參考文獻(xiàn)[6]報(bào)道的方法制作SAH模型。SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，結(jié)扎右側(cè)頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，剪斷頸外動(dòng)脈。4-0尼龍縫合線沿頸外動(dòng)脈引入頸內(nèi)動(dòng)脈，直到感覺(jué)阻力（約18 mm），然后將縫合線再推進(jìn)約1 mm穿透動(dòng)脈，迅速撤出縫合線，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，縫合切口。假手術(shù)組僅將縫合線引入頸動(dòng)脈分叉處感覺(jué)阻力時(shí)，拔出縫合線，不穿透動(dòng)脈。舒芬太尼組造模后6 h，尾靜脈注射舒芬太尼溶液，5μg/kg，1次/d，連續(xù)3周；假手術(shù)組和模型組尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.3 神經(jīng)功能評(píng)估 造模后1、2、21 d參考文獻(xiàn)[7]報(bào)道的方法，采用改良神經(jīng)嚴(yán)重性量表（modified neurological severity scale，mNSS）評(píng)分評(píng)估神經(jīng)功能。評(píng)分范圍0～18分，其中完全正常、無(wú)神經(jīng)功能缺損評(píng)分為0分，意識(shí)喪失或死亡評(píng)分為18分。

1.4 腦水腫測(cè)定 末次神經(jīng)功能評(píng)估結(jié)束后，每組取5只大鼠采用干濕重比法測(cè)定腦組織含水量。大鼠深度麻醉后，斷頭處死，迅速分離損傷灶半球腦組織，用濾紙吸干表面水分，稱其重量為濕重；然后，置于105℃烤箱內(nèi)24 h后稱其重量為干重。腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.5 TUNEL染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡 末次神經(jīng)功能評(píng)估結(jié)束后，每組取5只大鼠參考文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法進(jìn)行TUNEL染色。腦組織進(jìn)行常規(guī)切片，PBS清洗，TritonX-100通透，嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）說(shuō)明進(jìn)行操作。隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡（×400）視野觀察，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.6 EILSA測(cè)定氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)指標(biāo) 末次神經(jīng)功能評(píng)估結(jié)束后，每組取5只大鼠采用參考文獻(xiàn)[9]報(bào)道的方法測(cè)定氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)指標(biāo)。鼠深度麻醉后，斷頭處死，迅速左側(cè)大腦半球組織放入無(wú)菌生理鹽水中，勻漿后離心（12 000轉(zhuǎn)/min離心20 min），取上清液。按照EILSA檢測(cè)試劑盒（武漢賽培生物科技有限公司）說(shuō)明操作，檢測(cè)上清液腫瘤壞死因子-α（tumor neceosis，factor alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷光甘肽過(guò)物氧化酶（glutathione peroxidase，GHS-px）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的含量。

1.7 免疫印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 末次神經(jīng)功能評(píng)估結(jié)束后，每組取5只大鼠采用參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道的方法檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。提取腦組織總蛋白，使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取40μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶TBST封閉1 h，然后加入一抗[Nrf2（1:500），HO-1（1:500），NF-kB p65（1:500），BCL-2（1:500），cleaved-caspase-3（1:500）；美國(guó)Invitrogen公司]4℃孵育過(guò)夜，TBST沖洗4次，室溫下加入二抗（1:1 000）。ECL試劑盒顯影并拍照。采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析，以GAPDH作為內(nèi)參對(duì)照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行分析；定量資料以±s表示，用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 舒芬太尼對(duì)大鼠SAH后神經(jīng)功能的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠mNSS評(píng)分顯著增高（P＜0.001 ）。與模型組相比，舒芬太尼組大鼠mNSS評(píng)分顯著降低（P＜0.01 ）。見(jiàn)圖1。

圖1 舒芬太尼對(duì)大鼠SAH后神經(jīng)功能的影響

2.2 舒芬太尼對(duì)大鼠SAH后腦含水量的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦含水量顯著增高（P＜0.001 ）。與模型組相比，舒芬太尼組大鼠腦含水量顯著降低（P＜0.01 ）。見(jiàn)圖2。

圖2 舒芬太尼對(duì)大鼠SAH后腦含水量的影響

2.3 舒芬太尼對(duì)大鼠SAH后神經(jīng)元凋亡的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠神經(jīng)元凋亡率顯著增加（P＜0.001 ）。與模型組相比，舒芬太尼組大鼠神經(jīng)元凋亡率顯著降低（P＜0.001 ）。見(jiàn)圖3。

圖3 舒芬太尼對(duì)大鼠SAH后神經(jīng)元凋亡的影響

2.4 舒芬太尼對(duì)大鼠SAH后氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高（P＜0.01 ），SOD和GSH-Px水平顯著降低（P＜0.01 ）。與模型組相比，舒芬太尼組大鼠腦組織MDA、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著降低（P＜0.01 ），SOD和GSH-Px水平顯著增高（P＜0.01 ）。見(jiàn)圖4。

圖4 舒芬太尼對(duì)大鼠SAH后氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)的影響

2.5 舒芬太尼對(duì)大鼠腦組織BCL-2、Nrf2、HO-1、NF-kB p65及cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織BCL-2、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05 ），NF-kB p65和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05 ）。與模型組相比，舒芬太尼組大鼠腦組織BCL-2、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05 ），NF-kB p65和cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05 ）。見(jiàn)圖5。

圖5 舒芬太尼對(duì)大鼠SAH后氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

SAH后腦損傷常伴有神經(jīng)元凋亡和腦水腫，這是造成神經(jīng)功能缺損的主要原因[11]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究集中于揭示腦損傷的分子機(jī)制。研究表明SAH后，腦組織發(fā)生多種病理性改變，包括腦缺血、血腦屏障破壞、腦水腫和細(xì)胞凋亡[12]。有研究發(fā)現(xiàn)，caspase抑制劑可以減少SAH后皮層細(xì)胞凋亡和基底膜caspase蛋白表達(dá)，改善神經(jīng)行為功能和腦水腫[13]。caspase-3活化是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵步驟，但是卻可以被BCL-2阻斷。本研究發(fā)現(xiàn)舒芬太尼明顯降低大鼠SAH后腦組織含水量、神經(jīng)元凋亡率以及cleaved-caspase-3的表達(dá)水平，明顯增高BCL-2蛋白表達(dá)水平。這提示舒芬太尼可能提高抑制caspase-3，緩解腦水腫，減少神經(jīng)元凋亡。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，神經(jīng)炎癥在SAH后腦損傷的發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用，抗炎治療有益于改善SAH[14，15]。在SAH早期，小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活可以分泌炎癥因子，加重腦損傷，因此抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活可減輕SAH后腦損傷[16，17]。NF-kB是細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)，一旦被激活，促進(jìn)炎癥因子大量釋放，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。另外，SAH會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生過(guò)多的活性氧和活性氮，包括羥自由基、超氧化陰離子、過(guò)氧化氫、一氧化氮和過(guò)氧亞硝酸鹽，消耗了酶促和非酶促抗氧化劑防御系統(tǒng)[18]，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷[19]。本研究發(fā)現(xiàn)舒芬太尼明顯抑制大鼠SAH腦組織NF-kB p65表達(dá)，顯著降低炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平以及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA水平，顯著增加抗氧化劑SOD和GSH-Px水平。這提示舒芬太尼對(duì)大鼠SAH后氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

有研究表明在SAH大鼠模型中，苦豆堿通過(guò)Nrf2-ARE途徑減少氧化應(yīng)激損傷，改善神經(jīng)功能[20]。Nrf2是抗氧化劑，能夠調(diào)控細(xì)胞氧化損傷，而HO-1是Nrf2-ARE信號(hào)通路下游重要的抗氧化與解毒蛋白，對(duì)SAH后腦損傷具有減輕氧化應(yīng)激損傷和抑制細(xì)胞凋亡的作用[21]。本研究發(fā)現(xiàn)舒芬太尼顯著降低大鼠SAH腦組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)；因此，我們推測(cè)舒芬太尼可能通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路緩解SAH誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，舒芬太尼對(duì)SAH后腦損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能其抗細(xì)胞凋亡、抗氧化應(yīng)激和抗炎癥反應(yīng)等作用有關(guān)。