動植物環(huán)狀RNA研究進(jìn)展與展望

孫銘陽 李永光 徐世強 梅 瑜 顧 艷 周 芳 李靜宇 王繼華*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點實驗室，廣州 510640；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 大豆生物學(xué)教育部重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北大豆生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室,哈爾濱 150030)

環(huán)狀RNA(Circular RNAs)是由前體mRNA經(jīng)反向剪切(Back-splicing, BS)產(chǎn)生的具有組織表達(dá)特異性的單鏈共價閉環(huán)RNA分子。其參與基因轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，普遍涉及生長發(fā)育、病理反應(yīng)、激素誘導(dǎo)及脅迫應(yīng)激等進(jìn)程[1]。早在二十世紀(jì)七十年代末，學(xué)者便已發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA，但當(dāng)時其被描述為類病毒的遺傳物質(zhì)[2]。直至1991年，Nigro等[3]報道，由抑癌候選基因“Deleted in colorectal cancer(DCC)”轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的前體mRNA在進(jìn)行可變剪切(Alternative splicing, AS)時，可產(chǎn)生由外顯子組成且定位于細(xì)胞質(zhì)的環(huán)形轉(zhuǎn)錄本。這是證明環(huán)狀RNA可由DNA轉(zhuǎn)錄的首篇報道。然而，因其無Poly(A)尾，環(huán)狀RNA無法被借助Oligo dT完成反轉(zhuǎn)錄的傳統(tǒng)高通量測序技術(shù)識別并與mRNA區(qū)別開來，導(dǎo)致其后續(xù)研究受限。RNase R是一類3’-5’特異性識別并降解線狀RNA的外切酶?？俁NA樣品經(jīng)RNase R處理后，可去除其中線性RNA的干擾，為環(huán)狀RNA的測序提供可靠模板。最近，針對環(huán)狀RNA的高通量測序技術(shù)及BS位點特異性識別工具(如circMarker)已成功研發(fā)并得到廣泛應(yīng)用[4]。環(huán)狀RNA特異性注釋軟件(如CIRIquant)已發(fā)現(xiàn)真核生物體內(nèi)大量存在的環(huán)狀RNA[5-6]。

部分環(huán)狀RNA可通過堿基互補配對結(jié)合miRNA并抑制其功能，稱為miRNA海綿。因部分miRNA參與人類癌細(xì)胞的擴散和轉(zhuǎn)移進(jìn)程，所以miRNA海綿已成為臨床研究熱點[7]。此外，臨床研究還發(fā)現(xiàn)一些可翻譯多肽或充當(dāng)?shù)鞍字Ъ艿沫h(huán)狀RNA，現(xiàn)已闡明它們在癌癥發(fā)展過程中的作用[8-9]。除在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮功能外，環(huán)狀RNA還可通過結(jié)合來源基因的DNA序列調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率[10]。雖然植物領(lǐng)域有關(guān)環(huán)狀RNA作用機理的研究還很少，但有學(xué)者在植物體內(nèi)過量表達(dá)特定環(huán)狀RNA后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系可抗逆境脅迫[11]?？梢?，動物和植物環(huán)狀RNA均體現(xiàn)出它們的應(yīng)用潛能。

生物標(biāo)志物是科技應(yīng)用的基礎(chǔ)。環(huán)狀RNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且表達(dá)于各類組織及細(xì)胞，具有生物標(biāo)志物的特征。臨床研究發(fā)現(xiàn)，其可作為診療癌癥的候選生物標(biāo)志物[12]。植物生物標(biāo)志物是作物遺傳改良的重要工具。Conn等[13]表明，擬南芥(Arabidopsisthaliana)的特定環(huán)狀RNA可成為目標(biāo)基因AS事件的候選生物標(biāo)志物。但若要將某環(huán)狀RNA確定為真正的生物標(biāo)志物并應(yīng)用于生產(chǎn)生活中，仍需廣泛且準(zhǔn)確的驗證數(shù)據(jù)作為支撐。目前，圍繞動植物環(huán)狀RNA的分子機理研究已得到深入開展，為解析它們在生命進(jìn)程中發(fā)揮的作用提供了大量實驗線索和判定依據(jù)。但截至如今，相對于動物環(huán)狀RNA系統(tǒng)性的研究，有關(guān)植物環(huán)狀RNA的功能驗證很少，且多數(shù)還停留在表型水平。若植物環(huán)狀RNA的研究能夠在借鑒動物研究經(jīng)驗的同時，根據(jù)自身特有或共有的性質(zhì)制定合理的試驗思路，將提高重大突破出現(xiàn)的可能性。鑒于此，本研究旨在對動植物環(huán)狀RNA的生成機制、剪切識別位點、發(fā)揮功能、研究手段和應(yīng)用潛力等方面進(jìn)行異同點比較，以期為植物環(huán)狀RNA研究提供參考。

1 環(huán)狀RNA的分類

環(huán)狀RNA主要來自基因區(qū)(少數(shù)位于基因間區(qū))，無5’帽和3’尾的共價結(jié)構(gòu)使其比線性RNA更加穩(wěn)定，半衰期更長[14]。通常將覆蓋基因區(qū)的環(huán)狀RNA劃分為三大類，即僅含外顯子的環(huán)狀RNA、僅含內(nèi)含子的環(huán)狀RNA及同時包含外顯子和內(nèi)含子的環(huán)狀RNA。無論在動物還是植物體內(nèi)，根據(jù)BS位點形成的位置，環(huán)狀RNA共細(xì)化為10種類型(圖1)：(1)外顯子型(僅含外顯子)；(2)外顯子-內(nèi)含子復(fù)合型；(3)內(nèi)含子型(僅含內(nèi)含子)；(4)內(nèi)含子-外顯子復(fù)合型；(5)非編碼區(qū)型；(6)非編碼區(qū)-外顯子復(fù)合型；(7)非編碼區(qū)-內(nèi)含子復(fù)合型；(8)基因間區(qū)型；(9)基因間區(qū)-基因區(qū)復(fù)合型；及(10)跨基因型。

1.外顯子型；2.外顯子-內(nèi)含子復(fù)合型；3.內(nèi)含子型；4.內(nèi)含子-外顯子復(fù)合型；5.非編碼區(qū)型；6.非編碼區(qū)-外顯子復(fù)合型；7.非編碼區(qū)-內(nèi)含子復(fù)合型；8.基因間區(qū)型；9.基因間區(qū)-基因區(qū)復(fù)合型；10.跨基因型1.Exon type; 2.Exon-intron type; 3.Intron type; 4.Intron-exon type; 5.Non-coding region type; 6.Non-coding region-Exon type; 7.Non-coding region-intron type; 8.Intergenic region type; 9.Intergenic-gene type; 10.Cross-genotype圖1 環(huán)狀RNA類型示意圖(修改自參考文獻(xiàn)[15])Fig.1 Types of circRNAs (Modified from reference [15])

2 環(huán)狀RNA生成機制的同源性和特異性

為形成僅包含外顯子的成熟體mRNA，真核細(xì)胞會識別前體mRNA內(nèi)含子兩側(cè)的特定堿基，對其進(jìn)行AS。真核生物AS事件是保守的，過程主要依賴RNA聚合酶II(Pol II)和U2蛋白，可使一種前體mRNA產(chǎn)生多種成熟體mRNA亞型[16]。除產(chǎn)生類型豐富的線性RNA外，當(dāng)外顯子的3′端與5′端反向相遇時，RNA連接酶可將其反向連接成環(huán)，形成僅包含或部分包含外顯子的環(huán)狀RNA。被切掉的內(nèi)含子呈套索結(jié)構(gòu)，經(jīng)進(jìn)一步修飾形成內(nèi)含子型環(huán)狀RNA[17](圖2)。

圖2 環(huán)狀RNA生物合成示意圖(修改自參考文獻(xiàn)[18])Fig.2 Biosynthesis of circRNAs(Modified from reference [18])

2.1 環(huán)狀RNA生成相關(guān)蛋白的同源性

部分動物RNA結(jié)合蛋白可充當(dāng)環(huán)狀RNA生成過程的激活物或抑制物。如quaking(QKI)蛋白可結(jié)合在外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子上，在外顯子的3′端和5′端反向接近時促進(jìn)成環(huán)[19]。有研究者在植物中鑒定出QKI的同源蛋白(QKI-like)，但其是否在植物環(huán)狀RNA生物發(fā)生過程中發(fā)揮功能仍有待驗證。已有研究表明，擬南芥QKI-like蛋白除參與前體mRNA的加工[20]，還響應(yīng)開花調(diào)節(jié)[21]、應(yīng)激反應(yīng)[22]及激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程[23]。經(jīng)氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，擬南芥QKI-like蛋白與動物QKI蛋白高度同源，可能參與植物環(huán)狀RNA的生成[19]。

2.2 外顯子型環(huán)狀RNA側(cè)翼序列的特異性

動物外顯子型環(huán)狀RNA的生成受兩側(cè)內(nèi)含子上的長重復(fù)序列、長反向互補序列及RNA結(jié)合蛋白等元件的調(diào)控[24-25]。植物外顯子型環(huán)狀RNA的側(cè)翼內(nèi)含子在接近時并不依賴長重復(fù)或長反向互補序列[26]。超過33%的擬南芥環(huán)狀RNA在距離BS位點4～11 nts的位置會出現(xiàn)至少兩段短反向互補序列，表明促進(jìn)植物環(huán)狀RNA生成的側(cè)翼元件可由多段短互補序列彌補序列長度上的不足[27]。此外，玉米(ZeamaysL.)轉(zhuǎn)座子及其反向互補產(chǎn)物可富集于BS位點的側(cè)翼并促進(jìn)生成環(huán)狀RNA[28]。根據(jù)側(cè)翼序列及其上結(jié)合分子的特性可得出結(jié)論，植物外顯子型環(huán)狀RNA的形成過程更傾向于部分相似或完全區(qū)別于動物外顯子型環(huán)狀RNA形成方式的其他調(diào)控機制。

3 環(huán)狀RNA剪切信號的多樣性及影響因素

3.1 動物環(huán)狀RNA的經(jīng)典型剪切信號

高等真核生物體內(nèi)積累最多的核蛋白復(fù)合體為催化剪切前體mRNA的U2依賴型剪切體，其可識別剪切位點5′端和3′端的經(jīng)典型剪切信號(GU-AG序列)，即動物環(huán)狀RNA的主要剪切信號。在特定序列被切掉的同時，RNA連接酶可催化兩端連接為成熟mRNA或環(huán)狀RNA。此外，部分動物環(huán)狀RNA可由非典型剪切位點(NN-NN)生成(由U2蛋白或小剪接體介導(dǎo))[29]。但在早期的環(huán)狀RNA高通量測序研究中，由非典型剪切信號產(chǎn)生的環(huán)狀RNA候選片段常被歸類為假陽性并被多數(shù)測算工具過濾掉，為相關(guān)分析帶來阻礙。

目前，KNIFE是最可靠的環(huán)狀RNA識別工具，其算法以統(tǒng)計學(xué)為基礎(chǔ)，僅針對環(huán)狀RNA的BS位點[30]。KNIFE已在動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)少數(shù)具有非典型剪切信號的環(huán)狀RNA，但大多數(shù)動物環(huán)狀RNA均由經(jīng)典型GU-AG信號剪切而來。

3.2 植物環(huán)狀RNA的差異剪切信號

多數(shù)植物環(huán)狀RNA側(cè)翼內(nèi)含子上均存在短互補或短重復(fù)序列，目前無法確定這些短序列是否與它們剪切信號的類型有關(guān)[29]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，不同的雙子葉植物之間或單/雙子葉植物之間環(huán)狀RNA的非典型剪切信號占比有所不同。如在雙子葉植物擬南芥中，99%的環(huán)狀RNA均形成于經(jīng)典型GU-AG識別信號[31]。而針對同為雙子葉植物黃瓜(CucumissativusL.)的一項研究顯示，只有少數(shù)(約11.7%)環(huán)狀RNA含有經(jīng)典型GU-AG剪切信號[32]。同時，在單子葉植物水稻(OryzasativaL.)中，超過90%的環(huán)狀RNA來自不同的非典型剪切信號，這與circseq_cup工具對水稻環(huán)狀RNA的鑒定結(jié)果一致[33]。由此可知，與動物相比，不同植物物種環(huán)狀RNA的剪切識別信號差異較大。

經(jīng)典或非經(jīng)典型剪切信號出現(xiàn)的頻率也受到不同預(yù)測工具、過濾標(biāo)準(zhǔn)和轉(zhuǎn)錄本測序程序的影響。雖然這些標(biāo)準(zhǔn)可單獨用于評估環(huán)狀RNA的數(shù)量和質(zhì)量，但未來仍需利用多種識別工具和過濾標(biāo)準(zhǔn)來分析同一份環(huán)狀RNA的測序結(jié)果，以此來減少或消除不同工具間的識別誤差。

4 動植物環(huán)狀RNA的功能研究進(jìn)展

通常情況下，外顯子型環(huán)狀RNA在生成后定位于細(xì)胞質(zhì)，內(nèi)含子型和復(fù)合型環(huán)狀RNA定位于細(xì)胞核。環(huán)狀RNA的主要功能為：(1)MiRNA海綿；(2)滾環(huán)式翻譯新型多肽；(3)形成環(huán)狀RNA-蛋白復(fù)合體調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程;(4)調(diào)控來源基因的轉(zhuǎn)錄水平。

4.1 MiRNA海綿

MiRNA是內(nèi)源短序列(21～24 nts)非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)，其抑制靶蛋白積累水平的功能可根據(jù)不同的堿基互補率分為：(1)在動物體內(nèi)結(jié)合靶mRNA和AGO蛋白來抑制肽鏈的合成(與靶mRNA之間的堿基互補率較低)；(2)在植物體內(nèi)與靶mRNA結(jié)合并借助AGO蛋白觸發(fā)RNA鏈的裂解(與靶mRNA之間的堿基互補率較高)[34]。隨研究深入，學(xué)者發(fā)現(xiàn)越來越多的環(huán)狀RNA具有miRNA海綿的功能[35]。環(huán)狀RNA與miRNA堿基互補配對后，通過抑制miRNA的活性，間接上調(diào)miRNA靶基因的蛋白積累[36]。

類似環(huán)狀RNA這類可吸附miRNA的轉(zhuǎn)錄本在動物界被稱作競爭性內(nèi)源RNA，在植物界被稱為模擬靶標(biāo)[37]。因不易被多數(shù)RNA外切酶裂解，環(huán)狀RNA的半衰期大于48 h[38]，而線性RNA半衰期不足20 h[39]。所以，環(huán)狀RNA作為miRNA海綿的優(yōu)點是它們在細(xì)胞內(nèi)高度穩(wěn)定。

4.1.1動物miRNA海綿的特征及研究進(jìn)展

2013年，有研究證實環(huán)狀RNA-CDR1as(或ciRS-7)上存在70多個同一miRNA(miR-7)的吸附位點。但這些結(jié)合位點并未顯示出較高的堿基互補率，互補區(qū)僅位于5’端種子區(qū)[40]。隨后，研究者在基因編輯小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一個環(huán)狀RNA與2種miRNA之間的互作關(guān)系，表明動物環(huán)狀RNA吸附的miRNA類型具多樣化[41]。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有關(guān)miRNA海綿的研究最為深入，2018—2020年最新研究結(jié)果見表1(影響因子>15.0)。

表1 miRNA海綿功能在臨床上的驗證研究進(jìn)展Table 1 Research of miRNA-sponge function verification in clinic

4.1.2植物miRNA海綿預(yù)測及驗證

與動物領(lǐng)域的研究類似，植物環(huán)狀RNA的功能研究也集中在miRNA海綿或調(diào)控miRNA通路的潛在作用上。PlantCircNet(http:∥bis.zju.edu.cn/plantcircnet/)是一類預(yù)測植物環(huán)狀RNA-miRNA-靶mRNA網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫，可對多來源數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)整合，形成可視化環(huán)狀RNA-miRNA-靶mRNA網(wǎng)絡(luò)圖，有助于識別環(huán)狀RNA的代謝效應(yīng)和潛在機制[63]。Liu等[64]假設(shè)mRNA和環(huán)狀RNA都是同一miRNA的靶標(biāo)，在葉片衰老過程中差異表達(dá)的環(huán)狀RNA、miRNA和靶mRNA中，發(fā)現(xiàn)其中任意兩種RNA之間的表達(dá)模式存在相反的情況，以此作為環(huán)狀RNA參與miRNA和靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的間接證據(jù)。有研究曾嘗試從植物中鑒定出吸附位點豐富的miRNA海綿。但截至目前，植物中并未出現(xiàn)類似CDR1as那樣擁有高密度miRNA結(jié)合位點的環(huán)狀RNA。與動物環(huán)狀RNA相比，預(yù)測為miRNA海綿的植物環(huán)狀RNA數(shù)量很少(約5%)，且它們的miRNA結(jié)合位點也相對較少[65]。雖然擬南芥研究發(fā)現(xiàn)了不同生長階段潛在的環(huán)狀RNA-miRNA-靶mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但由于缺乏實驗驗證，這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的可信度不高[64]。2018—2020年預(yù)測到植物環(huán)狀RNA-miRNA-靶mRNA網(wǎng)絡(luò)的最新研究見表2。

表2 預(yù)測環(huán)狀RNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)的植物研究Table 2 Plant research on prediction of circRNA-miRNA-mRNA networks

植物miRNA與環(huán)狀RNA之間的堿基互補率比動物更高，且主要功能為誘導(dǎo)靶RNA的斷裂[70]。雖然高互補率更有利于識別植物miRNA的靶基因，但裂解RNA的功能可能導(dǎo)致環(huán)狀RNA的斷裂。因此，植物miRNA海綿的驗證工作會比動物研究更加艱難，相關(guān)互作實驗進(jìn)展緩慢?？上驳氖牵珻LIP-seq技術(shù)已在植物中得到實現(xiàn)，可識別植物miRNA海綿[71]。通過針對不同RNA結(jié)合蛋白(如AGO蛋白)的CLIP-seq實驗，不難想到其中會活躍著環(huán)狀RNA。

4.2 翻譯新型多肽

經(jīng)典的cap依賴型蛋白翻譯機制需先識別mRNA的5’帽或3’尾，隨后啟動多肽合成。故缺乏5’帽和3’尾的閉合環(huán)狀RNA在早期被歸類為無法翻譯蛋白的ncRNA。但近期研究發(fā)現(xiàn)，動物環(huán)狀RNA可通過cap非依賴型蛋白翻譯機制的識別序列——內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(Internal ribosome entry sites, IRESs)來激活翻譯[72]，且翻譯過程可由N6-甲基腺苷RNA(m6A)修飾來推進(jìn)[73]。CircInteractome網(wǎng)站(https:∥circinteractome.irp.nia.nih.gov/)可檢測環(huán)狀RNA序列中潛在的IRESs序列，預(yù)測其可能生成的功能蛋白[74]。同時，某些環(huán)狀RNA可能含有無限開放閱讀框，允許肽鏈進(jìn)行滾動式無限延伸。Abe等[72]人工合成了一個具有無限開放閱讀框的環(huán)狀RNA分子，用以測試其在真核細(xì)胞中的翻譯能力；該環(huán)狀RNA上不含IRESs和m6A修飾，取而代之的是一段包含起始密碼子的Kozak consensus序列；結(jié)果顯示該合成環(huán)狀RNA可以進(jìn)行滾動式無限翻譯。由此可知，IRESs序列和m6A修飾并非環(huán)狀RNA啟動翻譯的必要因素。目前，環(huán)狀RNA的翻譯功能較為罕見。

由表3可知，部分人類環(huán)狀RNA翻譯產(chǎn)物的功能已在癌癥研究中得到驗證。如circ-FBXW7翻譯的多肽(FBXW-185aa)可抑制腦癌細(xì)胞的增殖[8]。FBXW-185aa可與去泛素化酶USP28相互作用，避免USP28與腫瘤發(fā)生關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子FBXW7α結(jié)合，破壞USP28誘導(dǎo)的c-Myc穩(wěn)態(tài)，阻止FBXWα誘導(dǎo)的降解反應(yīng)，在腦腫瘤治療過程中發(fā)揮積極作用。

表3 人類癌癥相關(guān)環(huán)狀RNA的翻譯蛋白和功能Table 3 Functions of proteins encoded by circRNAs in human cancers

雖已有研究指出擬南芥的特定環(huán)狀RNA存在特異性m6A修飾，但尚未有植物環(huán)狀RNA翻譯多肽的公開報道[85]。隨后續(xù)研究的深入，植物環(huán)狀RNA的翻譯功能也將得到注釋。

4.3 與蛋白結(jié)合并調(diào)控細(xì)胞進(jìn)程

環(huán)狀RNA的功能不止于吸附miRNA和編碼多肽，閉環(huán)結(jié)構(gòu)使其能夠穩(wěn)定地與功能蛋白結(jié)合。雖然目前未出現(xiàn)植物環(huán)狀RNA是否可與蛋白結(jié)合的報道；但臨床研究已證實，部分人類環(huán)狀RNA可作為分子支架與功能蛋白結(jié)合，協(xié)同調(diào)控疾病的發(fā)展。小鼠活體試驗表明，circ-Amotl1可作為PDK1蛋白和AKT1蛋白的支架，幫助它們在細(xì)胞核中移動和定位，減緩細(xì)胞凋亡，提高AKT心肌細(xì)胞的存活率，最終幫助治愈心肌炎[9]。同時，circ-Amotl1還可從細(xì)胞質(zhì)中募集信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和轉(zhuǎn)錄因子，保證它們與Dnmt3a啟動子穩(wěn)定結(jié)合，提高細(xì)胞的黏附率、遷移率和增殖率，促進(jìn)傷口愈合[86]。

對于疾病的治療，同一環(huán)狀RNA在不同組織內(nèi)發(fā)揮的功能未必都是積極的。如circ-Foxo3可作為p53蛋白和MDM2蛋白的結(jié)合支架來增強MDM2依賴型的p53泛素化，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，抑制癌癥擴散[87]。但circ-Foxo3的蛋白結(jié)合功能卻在治療心肌細(xì)胞衰老時發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用。心肌組織中的circ-Foxo3通過扣留抗衰老相關(guān)蛋白ID1和E2F1來加速心肌細(xì)胞衰老。敲除circ-Foxo3成為了保護(hù)心肌細(xì)胞的潛在治療方法[88]。因此，未來應(yīng)謹(jǐn)慎考慮將環(huán)狀RNA應(yīng)用于臨床治療，避免為患者帶來更大副作用。

其他人類環(huán)狀RNA的結(jié)合功能也不容忽視。Ⅲ類先天淋巴細(xì)胞(Group 3 innate lymphoid cells，ILC3)是腸道免疫系統(tǒng)中的負(fù)調(diào)控因子。位于細(xì)胞核的circ-Kcnt2可通過自身的過量表達(dá)來抑制ILC3的活性，維持腸道的免疫穩(wěn)態(tài)。內(nèi)在分子機理為：circ-Kcnt2可與核小體重構(gòu)脫乙酰酶(Nucleosome remodeling deacetylase，NuRD)復(fù)合物共同結(jié)合在促結(jié)腸癌發(fā)展的T細(xì)胞功能調(diào)控基因Batf的啟動子上；抑制Batf蛋白的表達(dá)；進(jìn)而減少白細(xì)胞間介素-17(Interleukin-17，IL-17)的積累；最終阻止ILC3的激活；幫助治療先天性結(jié)腸炎[89]。該研究在circ-Kcnt2缺失型突變小鼠的腸道中檢測到過量積累的ILC3及結(jié)腸炎加重的表型，反向證明了circ-Kcnt2的免疫保護(hù)作用。另一項研究指出，INK4基因座可編碼多個腫瘤抑制相關(guān)蛋白，而circANRIL及其亞型可通過募集polycomb蛋白抑制INK4蛋白的積累。適當(dāng)?shù)卣{(diào)整circANRIL及其亞型與polycomb蛋白的比例后，可使前者由INK4蛋白的抑制物轉(zhuǎn)化為激活物，幫助遏制癌細(xì)胞的擴散[90]。

4.4 調(diào)控來源基因的轉(zhuǎn)錄水平

上述環(huán)狀RNA的功能均處在轉(zhuǎn)錄后水平，關(guān)于環(huán)狀RNA在轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮作用的研究成果相對較少。

4.4.1動物環(huán)狀RNA調(diào)控來源基因轉(zhuǎn)錄的最新進(jìn)展

研究發(fā)現(xiàn)，特定的同時包含外顯子和內(nèi)含子的復(fù)合型環(huán)狀RNA可通過結(jié)合U1蛋白來調(diào)控來源基因的轉(zhuǎn)錄效率[10]。另外，由SMARCA5基因(參與DNA的損傷修復(fù))產(chǎn)生的環(huán)狀RNA(circSMARCA5)可與來源基因SMARCA5的DNA序列結(jié)合并形成R-loop結(jié)構(gòu)，最終致SMARCA5基因的15號外顯子暫停轉(zhuǎn)錄[91]。該研究顯示，無論將circSMARCA5在體外腫瘤組織中誘導(dǎo)還是在患病小鼠活體內(nèi)過量表達(dá)，均能檢測到乳腺癌細(xì)胞對藥物的顯著敏感性及癌細(xì)胞中SMARCA5轉(zhuǎn)錄本的下調(diào)。該結(jié)果為乳腺癌患者提供了全新的治療靶點。

4.4.2植物環(huán)狀RNA調(diào)控來源基因轉(zhuǎn)錄的主要成果

Conn等[13]更早地在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA的R-loop依賴型轉(zhuǎn)錄抑制功能。擬南芥SEPALLATA3(SEP3)基因的第6個外顯子形成的環(huán)狀RNA可通過形成RNA：DNA雜合R-loop結(jié)構(gòu)與SEP3基因的DNA序列緊密結(jié)合，最終暫停轉(zhuǎn)錄。該研究是環(huán)狀RNA參與轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的第一項成就。隨后，Cheng等[92]發(fā)現(xiàn)擬南芥基因AT5G37720的第1個內(nèi)含子形成的套索型環(huán)狀RNA也可競爭性調(diào)控來源基因的表達(dá)，同時影響擬南芥的生長發(fā)育。綜合動植物環(huán)狀RNA的研究進(jìn)展可知，三大類環(huán)狀RNA均可調(diào)控來源基因的轉(zhuǎn)錄效率。

最近，Philips等[93]為確定控制植物環(huán)狀RNA轉(zhuǎn)錄的主效基因，選用了轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)鍵基因CBP80、C2H2和FLK的T-DNA插入式擬南芥突變體進(jìn)行環(huán)狀RNA的積累水平分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以上三種突變體體內(nèi)積累的環(huán)狀RNA均顯著高于野生型；表明植物CBP80、C2H2及FLK基因是成熟mRNA外顯子能夠保持正確連接順序所不可缺少的管控基因；缺失其中任意一個均可導(dǎo)致常規(guī)轉(zhuǎn)錄本的剪切失調(diào)并促使環(huán)狀RNA的生成。由此可得，植物RNA的成環(huán)機制控制著線性轉(zhuǎn)錄本的積累。

5 環(huán)狀RNA功能驗證技術(shù)的研究述評

5.1 系統(tǒng)化的動物環(huán)狀RNA功能驗證方法

5.1.1反義寡核苷酸沉默技術(shù)

傳統(tǒng)的RNA干擾載體無法產(chǎn)生環(huán)形轉(zhuǎn)錄本，為環(huán)狀RNA特異性沉默增添了難度。反義寡核苷酸(Antisense oligonucleotide，ASO)是脫氧核苷酸短序列(15～20 nts)的類似物，可通過堿基互補配對結(jié)合目標(biāo)RNA，最終依賴RNase H降低其表達(dá)水平[94]。Song等[95]將特定ASOs轉(zhuǎn)染入果蠅體內(nèi)，提前終止了目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。并且，該研究在轉(zhuǎn)染針對BS位點設(shè)計的環(huán)狀RNA特異性ASOs時，實現(xiàn)了在沉默目標(biāo)環(huán)狀RNA的同時，不影響對應(yīng)線性mRNA積累水平。因此，BS位點特異性ASOs在未來可應(yīng)用于產(chǎn)生環(huán)狀RNA基因座的功能研究。

5.1.2短發(fā)夾RNA敲除技術(shù)

短發(fā)夾RNA(Short hairpin RNA，ShRNA)可通過瞬時轉(zhuǎn)染降低環(huán)狀RNA的表達(dá)水平。有研究利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法向小鼠眼窩皮層導(dǎo)入針對環(huán)狀RNA的shRNA后，成功靶向敲除目標(biāo)環(huán)狀RNA(表達(dá)水平降低40%)[96]。但該方法效率較低，有脫靶風(fēng)險。2020年，Pamudurti等[97]將shRNA技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化，在不改變來源基因mRNA積累水平的前提下，高效且特異性地沉默了果蠅的5個高表達(dá)環(huán)狀RNA。

其他的環(huán)狀RNA沉默技術(shù)也得以實現(xiàn)。如Xia等[98]通過敲除特定環(huán)狀RNA的側(cè)翼內(nèi)含子序列，沉默了該環(huán)狀RNA的轉(zhuǎn)錄。但該方法操作困難、效率低、不具廣泛性、不可用于組織特異性分析且無法同時分析順反式環(huán)狀RNA的功能，僅適用于單個環(huán)狀RNA的功能分析。隨干擾技術(shù)的不斷改進(jìn)，有關(guān)環(huán)狀RNA的研究成果將更加完善。

5.1.3MiRNA海綿的驗證方法

動物領(lǐng)域已建立成熟的miRNA海綿驗證體系，相關(guān)技術(shù)有：(1)利用環(huán)狀RNA特異性探針對樣品進(jìn)行pull-down實驗，分析沉淀成分；(2)對生物素化的野生型和miRNA突變體進(jìn)行miRNA的pull-down實驗，對比野生型和miRNA突變體內(nèi)捕獲環(huán)狀RNA的情況；(3)將環(huán)狀RNA與miRNA之間的互補區(qū)序列和突變堿基的互補區(qū)序列分別構(gòu)建到熒光素報告酶載體中，與目標(biāo)miRNA過表達(dá)載體分別共轉(zhuǎn)染動物細(xì)胞，觀察兩組熒光信號強弱以確定互補區(qū)域的沉默效率;(4)利用熒光定量PCR技術(shù)分析環(huán)狀RNA敲除前后的miRNA表達(dá)水平[42]。

5.1.4環(huán)狀RNA翻譯產(chǎn)物的驗證方法

質(zhì)譜分析、蛋白印跡技術(shù)和免疫熒光染色分析已應(yīng)用于環(huán)狀RNA蛋白產(chǎn)物的驗證。質(zhì)譜分析結(jié)合免疫共沉淀技術(shù)可確定環(huán)狀RNA蛋白產(chǎn)物與其他蛋白之間的互作關(guān)系[66-69]。同時，低表達(dá)環(huán)狀RNA的積累量幾乎無法被檢測到，驗證它們的功能十分困難。Mo等[99]構(gòu)建出一個內(nèi)含子介導(dǎo)的增強系統(tǒng)，成功將環(huán)狀RNA的表達(dá)水平提升5倍。該系統(tǒng)已識別部分先前未檢測到的環(huán)狀RNA，且發(fā)現(xiàn)它們具有翻譯功能。此外，該作者還構(gòu)建了一種多功能環(huán)狀RNA表達(dá)載體——pCircRNA-DMo，未來將成為環(huán)狀RNA生物發(fā)生和翻譯產(chǎn)物研究的重要工具。

5.2 有待開發(fā)的植物環(huán)狀RNA功能驗證手段

5.2.1培育環(huán)狀RNA過表達(dá)株系

植物環(huán)狀RNA功能研究仍停留于表型水平。了解環(huán)狀RNA的形成機制后，研究人員可根據(jù)特異性的側(cè)翼序列實現(xiàn)人為構(gòu)建促進(jìn)成環(huán)的植物環(huán)狀RNA過表達(dá)載體[25]。如已有研究成功在水稻的不同組織中過表達(dá)特定的環(huán)狀RNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該環(huán)狀RNA的來源基因mRNA積累水平顯著下降[26]。Zhang等[11]在擬南芥中過表達(dá)circGORK(來源基因功能為保衛(wèi)細(xì)胞外流鉀離子通道蛋白)后，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出ABA敏感性及耐旱性。Gao等[100]在擬南芥中過表達(dá)Vv-circATS1(來源基因功能為甘油-3-P?；D(zhuǎn)移酶)后，轉(zhuǎn)基因植株體現(xiàn)出耐寒性，然而將與Vv-circATS1序列相同的線狀RNA轉(zhuǎn)入擬南芥后，轉(zhuǎn)基因株系并不耐寒。這表明植物環(huán)狀RNA有區(qū)別于同源線性RNA的特異性功能。

5.2.2培育環(huán)狀RNA敲除株系

培育植物環(huán)狀RNA缺陷型株系也是其功能驗證的重要手段。因僅需一段20 nts的特異性片段即可實現(xiàn)基因敲除，CRISPR/Cas9技術(shù)可用于植物環(huán)狀RNA的功能研究。動物研究領(lǐng)域已利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功將一個可吸附miRNA的環(huán)狀RNA進(jìn)行特異性敲除，培育環(huán)狀RNA缺陷型突變體[101]。雖然CRISPR/Cas9已廣泛應(yīng)用于植物分子生物學(xué)研究，但其在植物環(huán)狀RNA領(lǐng)域的應(yīng)用還未見報道，相關(guān)細(xì)節(jié)仍需探索。

6 環(huán)狀RNA作為生物標(biāo)志物的應(yīng)用前景

6.1 臨床診斷生物標(biāo)志物的設(shè)想與現(xiàn)實之間的差距

目前，臨床仍缺乏有效檢測癌細(xì)胞的生物標(biāo)志物。環(huán)狀RNA穩(wěn)定且廣泛存在于各類組織和細(xì)胞中，具備生物標(biāo)志物的特性[102]。部分可作為食道癌和直腸癌候選生物標(biāo)記物的環(huán)狀RNA見表4(影響因子>4.0)，結(jié)果初步體現(xiàn)了環(huán)狀的臨床應(yīng)用價值。

表4 診療食道癌和直腸癌的環(huán)狀RNA候選生物標(biāo)志物Table 4 Candidate circRNA biomarkers for diagnosis ofesophageal and rectal cancer

雖然，環(huán)狀RNA作為臨床生物標(biāo)志物的優(yōu)勢明顯。但Rochow等[118]提出，部分環(huán)狀RNA在臨床標(biāo)本中并不穩(wěn)定，也會經(jīng)歷類似mRNA降解的分解過程，診斷時不可單純利用熒光定量PCR結(jié)果來判斷患者組織內(nèi)環(huán)狀RNA的積累水平。因此，未來需要對環(huán)狀RNA的降解機制進(jìn)行深入探究，用以得到更可靠的環(huán)狀RNA表達(dá)數(shù)據(jù)。

6.2 作物遺傳育種生物標(biāo)志物的新方向

生物標(biāo)志物是作物遺傳育種和實踐應(yīng)用的基礎(chǔ)，其可預(yù)測作物產(chǎn)品的質(zhì)量，評估植物對不同施肥條件的反應(yīng)，是監(jiān)測和優(yōu)化肥料供給的潛在農(nóng)藝工具[119]。雖然，植物環(huán)狀RNA作為生物標(biāo)記物僅為一個新的概念，但其具有半衰期長、不易降解、檢測手段簡便和序列特異性等優(yōu)點?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，由擬南芥SEP3基因產(chǎn)生的環(huán)狀RNA可作為MADS-box相關(guān)基因AS事件的候選標(biāo)志物[13]。今后植物環(huán)狀RNA功能的研究重點應(yīng)追隨動物環(huán)狀RNA的腳步，篩選可幫助推進(jìn)作物遺傳育種進(jìn)程的生物標(biāo)志物。

7 環(huán)狀RNA研究的問題與展望

環(huán)狀RNA普遍存在于真核生物體內(nèi)，參與生命進(jìn)程的各個階段[120]。學(xué)者在描述環(huán)狀RNA發(fā)揮功能時，相當(dāng)于身處另一個“平行世界”，概括其調(diào)控能力既具廣泛性又與線性RNA的作用機制完全不同[31]。雖然，有關(guān)環(huán)狀RNA的信息仍存在大量空白，但其無疑已成為分子生物學(xué)研究領(lǐng)域劃時代的標(biāo)志。

癌癥是威脅人類生命健康的障礙之首，而miRNA幾乎在所有人類癌癥細(xì)胞中差異表達(dá)。因此，環(huán)狀RNA作為miRNA海綿的功能得到了臨床研究的普遍關(guān)注。部分環(huán)狀RNA可通過吸附miRNA調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的耐藥性[121]。目前，將環(huán)狀RNA列為候選的疾病診斷標(biāo)志物所面臨的一個重要問題為：一些功能性環(huán)狀RNA具有豐富的空間表達(dá)特異性，在細(xì)胞的不同位置可發(fā)揮完全相反的作用。如位于癌細(xì)胞內(nèi)的hsa_circ_0000338可抑制癌細(xì)胞擴散，但當(dāng)其被分泌到細(xì)胞外時，hsa_circ_0000338可致癌[122]。因此，篩選環(huán)狀RNA作為生物標(biāo)記物的工作任重道遠(yuǎn)，更全面且穩(wěn)定的檢測數(shù)據(jù)是必不可少的。

與系統(tǒng)化的動物環(huán)狀RNA研究相比，植物環(huán)狀RNA的研究十分匱乏，多數(shù)還停留在測序和生物信息學(xué)預(yù)測階段。因植物miRNA特殊的裂解機制，miRNA海綿功能的驗證工作進(jìn)展緩慢。另外，有關(guān)植物環(huán)狀RNA的翻譯及蛋白支架功能的研究也尚未發(fā)表。筆者建議，與動物環(huán)狀RNA差異較大的生物發(fā)生機制及miRNA海綿功能均可成為植物環(huán)狀RNA研究的切入點；通過借鑒動物環(huán)狀RNA的研究手段；制定符合實際情況的實驗路線；根據(jù)它們在不同發(fā)育階段、逆境脅迫和激素刺激等條件的差異表達(dá)模式；由宏觀篩選細(xì)化到單個環(huán)狀RNA的功能驗證；最終確定它們參與上述條件中發(fā)揮的具體作用。本文僅從內(nèi)在分子發(fā)生機理到外在功能驗證等方面綜述了動植物環(huán)狀RNA最新研究成果之間的特異性和同源性，旨為植物環(huán)狀RNA的后續(xù)深入研究提供參考。