芽孢桿菌處理對(duì)柑桔苗木黃龍病抑制效果

胡黨振 徐嬡媛 于夢(mèng)怡 姜 玲

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家果樹(shù)脫毒種質(zhì)資源室內(nèi)保存中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070)

柑桔黃龍病是毀滅性病害，迄今已有53個(gè)國(guó)家相繼報(bào)導(dǎo)了此病害[1-3]。在美國(guó)弗羅里達(dá)州柑桔黃龍病導(dǎo)致產(chǎn)量減半[2]，在巴西柑桔黃龍病導(dǎo)致3 800萬(wàn)株柑桔樹(shù)被毀[4-5]。在我國(guó)柑桔主產(chǎn)區(qū)，江西贛南柑桔黃龍病已累計(jì)造成約12億元經(jīng)濟(jì)損失[6]。柑桔黃龍病是韌皮部桿菌引起的病害，其病原是一種革蘭氏陰性菌CandidatusLiberibacter spp，分為3個(gè)種，包括亞洲種C.Liberobacter asiaticus(Las)、非洲種C.Liberobacter africanum(Laf)和美洲種C.Liberobacter americanus(Lam)，其中亞洲種為害柑桔最嚴(yán)重。由于韌皮部桿菌Las純化和培養(yǎng)難度大，因此，黃龍病病原學(xué)及致病機(jī)理研究進(jìn)展緩慢。目前柑桔黃龍病的防治主要采用挖除病樹(shù)、控制木虱傳播和培育無(wú)病苗木等方法。在全球氣候變曖的新形勢(shì)下，由于發(fā)生柑桔黃龍病與衰退病、黃脈病的復(fù)合侵染越來(lái)越多，對(duì)柑柑無(wú)病苗木的需要越來(lái)越大，迫切需要改進(jìn)脫毒技術(shù)，提高脫毒效率。

生防菌是指能夠控制病害發(fā)展的有益微生物，具有對(duì)環(huán)境友好、可持續(xù)發(fā)展的特點(diǎn)[7]。國(guó)內(nèi)外已有研究表明芽孢桿菌在植物病害的防控上有顯著的效果。芽孢桿菌主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、誘導(dǎo)、拮抗和促生等發(fā)揮生防作用，提高植株的抗病性[8-9]。常用作生防菌的種類主要有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)及多粘類芽孢桿菌(Paenibaci)等[10]。貝萊斯芽孢桿菌作為芽孢桿菌屬的一個(gè)新種，其次生代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌可產(chǎn)生廣譜抗性，能產(chǎn)生IAA、NH3和ACC脫氨酶等植物激素以及抗菌物質(zhì)和酶[11]。Kim等[12]從種植蘑菇的廢料中分離出貝萊斯芽孢桿菌M75，其基因組包含編碼各種非核糖體肽合成酶和聚酮化合物合成酶的操縱子。由于植物具有自身免疫系統(tǒng)，在病原菌侵染位點(diǎn)能發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)，使整株植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性(Systemic acquired resistance， SAR)或誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(Induced sstemic resistance， ISR)，誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性可以由非致病性根際微生物誘發(fā)植物抗病反應(yīng)[13,14]。從植物根際分離的貝萊斯芽孢桿菌大部分可以在植物根部定殖，對(duì)抑制病原菌起著重要作用[15]。據(jù)報(bào)道，植物生長(zhǎng)促進(jìn)(PGP)甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物也可以有效緩解不同類型的生物和非生物脅迫，但直接采用芽孢桿菌影響黃龍病病原的研究報(bào)導(dǎo)甚少[16]。本課題擬利用芽胞桿菌處理柑桔苗木，篩選對(duì)柑桔黃龍病有抑制作用的菌株，通過(guò)多次、高強(qiáng)度的處理及處理前后黃龍病病原的分子檢測(cè)，尋找控制和降低母本植株黃龍病病原滴度的方法，為提高后續(xù)脫除病原的效率打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采用一年生‘沃柑’(Citrus.reticulataBlanco)、‘沙糖橘’(C.reticulatacv. Shiyue Ju)、‘南豐蜜橘’(C.reticulatacv. Kinokuni)作為試材，苗木均隔離種植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物農(nóng)藥國(guó)家工程研究中心大棚內(nèi)。

1.2 菌株的分離、鑒定及結(jié)構(gòu)觀察

對(duì)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的生防復(fù)合菌進(jìn)行分離、純化，根據(jù)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》[17]，配置培養(yǎng)基，將生防復(fù)合菌用涂布和劃線的方法進(jìn)行多次分離和純化，分離到不同單菌落。對(duì)No.4單菌落進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)、細(xì)菌純培養(yǎng)鑒定和分類鑒定。細(xì)菌樣品的掃描電鏡觀察參考《掃描電鏡的微生物樣品制備方法》[18]。根系石蠟切片觀察參考《植物顯微技術(shù)指導(dǎo)書(shū)》[19]進(jìn)行，切片用奧林巴斯BX53型生物顯微鏡進(jìn)行觀察。對(duì)No.4 菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。將單菌落接種到LB培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，當(dāng)菌液的OD600 nm≈1時(shí)，取20 mL菌液加入高壓滅菌后的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基為1 kg米糠、1 kg麩皮、0.6 kg 淀粉、0.4 kg豆粕、15 g紅糖，按照m(培養(yǎng)基)∶m(水)=1∶1.3混合均勻。在32 ℃發(fā)酵8 d，每天攪拌1次。將培養(yǎng)物置于60 ℃干燥，使用800A型粉碎機(jī)(浙江省永康市)粉碎后待用。檢測(cè)活菌數(shù)約為100億個(gè)/g。

1.3 苗木管理及菌劑處理

供試苗木均為一年生嫁接苗，砧木為枳殼。苗木的生長(zhǎng)條件基本一致，每月每株苗施5 g復(fù)合肥，共施8 次。用200 mg/L聚-γ-谷氨酸(PGA)溶液(300 mL/株)和80 mg/L殼寡糖溶液(300 mL/株)每隔10 d灌根1次，共3 次。分別于2019年4月、5月、6月用海藻肥600倍稀釋液噴葉3次，上述管理作為基本管理措施，在處理和對(duì)照苗木上均同樣使用。No.4菌劑使用時(shí)用水稀釋后及時(shí)灌根。用量為0.5 L/株，每周1次?！指獭汀程情佟歼M(jìn)行菌劑灌根處理21次，操作方法為，1.6 g/L，3次；2.5 g/L，7次；5 g/L，11次。24 h后從4個(gè)方向采集葉脈，用液氮冷凍，待用； ‘南豐蜜橘’用菌劑灌根處理14次，具體操作時(shí)，用量是1.6 g/L，10次；2.5 g/L，4次，用量為0.5 L/株。對(duì)照植株全部用等量的清水灌根。采集葉脈和枝皮用液氮冷凍，分別磨樣，用于黃龍病分子檢測(cè)。

1.4 柑桔黃龍病的分子檢測(cè)

PCR檢測(cè)程序：冷凍樣品加液氮磨碎，用CTAB法提取植物總DNA。采用Bio-Rad(美國(guó))PCR儀進(jìn)行檢測(cè)，使用(OI1/OI2C)和(P400+/P400-)2對(duì)引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列(見(jiàn)表1)引物由上海生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)采用翊圣生物科技有限公司試劑盒。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，變性3 min，60 ℃，退火30 s，72 ℃, 延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)。用健康柑桔愈傷組織提取DNA作負(fù)對(duì)照，分別用質(zhì)粒pMD18-16S rDNA和質(zhì)粒pMD18T-P400做正對(duì)照。

表1 柑桔黃龍病檢測(cè)和抗病相關(guān)基因表達(dá)量分析所用引物Table 1 Primers used for the detections of Huanglongbing disease and disease-resistant genes

qPCR檢測(cè)程序：用Corbett RG 6000實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(德國(guó))進(jìn)行擴(kuò)增，細(xì)胞色素氧化酶基因COX作看家基因，柑桔黃龍病亞洲型核糖體蛋白基因rpLJ/rp1L作目的基因[20, 21]，引物見(jiàn)表1，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以健康愈傷組織為負(fù)對(duì)照，對(duì)目標(biāo)基因已測(cè)序比對(duì)的DNA樣品為陽(yáng)性對(duì)照。qPCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃變性3 min，94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸35 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)文獻(xiàn)[22]計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。負(fù)對(duì)照的2-ΔΔCT=1，當(dāng)待測(cè)樣品2-ΔΔCT>1，則樣品為陽(yáng)性，當(dāng)0<2-ΔΔCT<1則樣品為陰性。

1.5 植株抗性相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定

當(dāng)南豐蜜橘經(jīng)No.4菌劑處理后，在0、12、24、36 h時(shí)取樣，各3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。提取RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，cDNA作模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。測(cè)定PR1、HSP90、GST1、WRKY22、WRKY24、WRKY29和WRKY33的mRNA相對(duì)表達(dá)量，引物序列見(jiàn)表1。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃ 3 min，94 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，40 ℃ 10 s。每份樣品3次重復(fù)，數(shù)據(jù)用Excel 2016軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌菌株分離、純化和鑒定

從生防復(fù)合菌中分離出不同的單菌落，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)No.4菌落呈圓形，乳白色，半透明狀，邊緣整齊，表面光滑(圖1(a))；革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性(圖1(b))；掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌落為桿狀，有芽孢，聚合呈鏈狀，具圓端，大小為0.6 μm×(1.3～3.0)μm，有二分裂狀態(tài)(圖1(c))。

(a)菌落乳白色，半透明狀；(b)革蘭氏染色為陽(yáng)性；(c)掃描電鏡觀察(a) The colonies are opalescent and translucent; (b) Gram staining result is positive; (c) Scanning electron microscope observation圖1 No.4菌落形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of No.4 bacterial colonies

2.2 No.4菌落細(xì)菌純培養(yǎng)鑒定

對(duì)No.4菌株部分生理生化指標(biāo)進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示(表2)：該菌株可利用明膠酶分解明膠；能利用丙二酸鹽作為碳源；可在檸檬酸鹽培養(yǎng)基上生長(zhǎng)；葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)表明No.4菌落為發(fā)酵型；可以合成淀粉酶，利用淀粉。甲基紅試驗(yàn)結(jié)果為陰性。VP試驗(yàn)結(jié)果為陰性，表明該菌劑利用葡萄糖不能產(chǎn)生有機(jī)酸，能產(chǎn)生非酸性或中性末端產(chǎn)物。再結(jié)合其形態(tài)特征，初步鑒定No.4菌株為芽孢桿菌屬。

表2 No.4菌株部分生理生化指標(biāo)Table 2 The physiological and biochemicalindicators of strain No.4

2.3 No.4菌株16S rDNA和recA基因測(cè)序

對(duì)No.4菌株的16S rDNA和recA基因進(jìn)行序列分析，其16SrDNA片段測(cè)序后大小約為1 608 bp(附錄)，經(jīng)NCBI 序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，No.4菌劑與貝萊斯芽孢桿菌recA同源性達(dá)93%(圖2(a)和2(b))，且其生理生化指標(biāo)也符合芽孢桿菌屬特征，因此，推測(cè)該菌株為貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上數(shù)字為序列同源性的百分?jǐn)?shù)。The number in the phylogenetic tree is the percentage of sequence homology.圖2 No.4菌株16S rDNA和 recA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建Fig.2 Construction of phylogenetic tree of 16S rDNA and recA gene sequence of strain No.4

2.4 No.4菌劑處理前后韌皮部桿菌中目標(biāo)基因的檢測(cè)分析

對(duì)苗木的葉脈取樣后，利用qPCR檢測(cè)HLB病原，同時(shí)又采用(OI1/OI2C)和(P400+/P400-)2對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于病原在植株不同器官中分布和濃度是不穩(wěn)定的，為了減少檢測(cè)誤判，本研究采用3種方法，從而避免漏掉陽(yáng)性材料， 上述3種方法檢測(cè)中只要有一種表現(xiàn)陽(yáng)性，即認(rèn)為該植株為陽(yáng)性。結(jié)果表明：No.4菌劑處理的‘沃柑’植株，黃龍病陽(yáng)性率由處理前100%降至處理后的50%，對(duì)照植株陽(yáng)性率保持不變(表3)。No.4菌劑處理的‘沙糖橘’植株，其陽(yáng)性率由處理前的100%降至處理后的75%，對(duì)照陽(yáng)性率不變(表4)；‘沃柑’處理組植株植株長(zhǎng)勢(shì)茂盛，根部發(fā)達(dá)，新生根數(shù)量明顯多于對(duì)照組，根部褐變程度明顯改善(圖3(a)～(h))。沙糖桔苗木經(jīng)No.4菌劑處理后，根系發(fā)達(dá)，須根豐富，而對(duì)照苗木新根少，苗木長(zhǎng)勢(shì)弱，根系密度低(圖3(i)～(l))。

(a) No.4菌劑處理的沃柑植株；(b)對(duì)照植株；(c),(e)和(g)處理植株的根系；(d),(f)和(h)對(duì)照植株的根系；(i)和(k)No.4菌劑處理沙糖桔及其根部放大照片；(j)和(l)對(duì)照植株及其根部放大照片。A：(a) The ‘orah’ plant is treated by No.4 Bacillus agent; (b) Control; (c), (e) and (g) The roots of the control groups; (d), (f) and (h) The roots of control group; (i) and (k) ‘shiyue’ ju plant is treated by No.4 Bacillus agent and the enlarged photo of root; (j) and (l) The control plant and the enlarged photo of root.圖3 No.4菌劑處理對(duì)沃柑和沙糖桔根系的影響Fig.3 Effect on root growth condition after treatment by No.4 Bacillus agent in ‘orah’ and ‘Shiyue Ju’

2.5 No.4菌劑處理后南豐蜜桔黃龍病病原檢測(cè)結(jié)果和根部特征的變化

No.4菌劑處理前，通過(guò)qPCR方法，對(duì)南豐蜜桔葉脈和枝皮進(jìn)行黃龍病分子檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)供試材料均為陽(yáng)性；No.4菌劑處理后，黃龍病的陽(yáng)性率為66.7%，對(duì)照樣品處理前和處理后均為陽(yáng)性。

No.4菌劑處理后南豐蜜橘植株根系生長(zhǎng)旺盛，須根發(fā)達(dá)，根系褐變現(xiàn)象減輕(圖4(a)～(c))，對(duì)照苗木根密度小，褐變較重(圖4(d)～(f))，圖4(g)和4(h)為褐變根系放大照片。通過(guò)掃描電鏡觀察菌劑處理后‘南豐蜜橘’植株根部褐變部分與正常部分結(jié)構(gòu)差異，分析菌劑對(duì)根系生長(zhǎng)的影響。由(圖4(i)和4(j))可以看出，褐變部位根部表面粗糙，細(xì)胞呈磷片狀翹起，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞壁被破壞，韌皮部篩管有內(nèi)含物(圖4(m))。No.4菌劑處理后健康部位根部表面光滑完整，表皮細(xì)胞呈長(zhǎng)方形，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)無(wú)破損，韌皮部篩管表現(xiàn)正常(圖4(k),4(l)和4(n))。

經(jīng)No.4菌劑處理后，選取褐變根和表現(xiàn)正常的根制備石蠟切片，不管是處理組還是對(duì)照，褐變根的薄壁細(xì)胞均呈現(xiàn)不規(guī)則的空泡狀(圖4(o)和4(q))，而外觀表現(xiàn)正常的根，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)沒(méi)有遭到明顯的破壞(圖4(p))，但表皮細(xì)胞有開(kāi)裂癥狀(圖4(r))。

(a)～(c) No.4菌劑處理的植株;(d)～(f)對(duì)照植株;(g)和(h)褐變根放大照片;(i)～(n)菌劑處理后電鏡照片;(i)和(j)褐變部位根部表面;(k)和(l)健康部位根部表面;(m)褐變部位根部橫切面;(n)健康部位根部橫切面;(o)～(r)石蠟切片照片;(o)和(p)菌劑處理后橫切面;(o)褐變部位根面;(p)正常部位;(q)和(r)對(duì)照樣品中橫切面;(q)褐變部位;(r)正常部位。(a)-(c): No.4 Bacillus agent-treated plants; (d)-(f): Control plants; (g) and (h): Enlarged photos of browning roots; (i)-(n): Electron microscopy images; (i) and (j): The root surfaces of the browning parts; (k) and (l): The root surfaces of normal parts; (m): The transverse root section of browning part; (n): The transverse root sectionof of normal part; (o)-(r): Paraffin section photographs; (o) and (p): The transverse sections of the roots after treatment with No.4 Bacillus agent; (o): Browning part; (p): Normal part. (q) and (r): The transverse sections of the control; (q): Browning site; (r): Normal site.圖4 No.4菌劑處理南豐蜜橘苗木特征及根部顯微結(jié)構(gòu)觀察Fig.4 Morphological characteristics of ‘Nanfengmiju’ tangerine plants and microstructural observation after treatment by No.4 Bacillus agent

2.6 相關(guān)抗性基因表達(dá)量分析

分析qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖5)：南豐蜜桔菌劑處理組PR1基因和WRKY29基因mRNA表達(dá)水平低，且對(duì)照組高于處理組，菌劑誘導(dǎo)PR1基因和WRKY29基因下調(diào)表達(dá)；處理組HSP90轉(zhuǎn)錄水平0～36 h一直下調(diào)，但在0 h和36 h時(shí)比對(duì)照組表達(dá)水平高，在12和24 h時(shí)比對(duì)照組表達(dá)水平低。處理組GST1基因表達(dá)水平在12 h時(shí)達(dá)最低，之后有升高趨勢(shì)，在0和36 h時(shí)，表達(dá)量略高于對(duì)照組，表明菌劑誘導(dǎo)GST1基因表達(dá)具有一定效果；處理組WRKY22轉(zhuǎn)錄因子隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)量持續(xù)升高，在12和36 h時(shí)高于對(duì)照組，表明菌劑處理有助于提高WRKY22轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)豐度；處理組WRKY24轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量在12和36 h時(shí)有上升趨勢(shì)，并且在36 h時(shí)表達(dá)量高于對(duì)照組，表明菌劑處理能夠誘導(dǎo)植株WRKY24基因表達(dá)。處理組WRKY33轉(zhuǎn)錄因子在12 h時(shí)表達(dá)上調(diào)，之后表達(dá)量下降，在36 h時(shí)表達(dá)量高于對(duì)照組，表明菌劑處理能夠誘導(dǎo)植株WRKY33基因表達(dá)。

柱子上方小寫(xiě)字母不同時(shí)，說(shuō)明基因相對(duì)表達(dá)量的差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。Different lowercase letters at the top of the column indicate significant differences (P<0.05).圖5 No.4菌劑處理對(duì)植株抗性基因mRNA表達(dá)量影響Fig.5 Effect of strain No.4 on mRNA relative expression of plant resistance genes

3 討論與結(jié)論

本研究從復(fù)合菌分離出單菌落，經(jīng)發(fā)酵制備的No.4菌劑用于柑桔盆栽苗木灌根處理，探討了No.4菌劑對(duì)黃龍病的控制效果。

3.1 貝萊斯芽孢桿菌No.4菌劑可以影響韌皮部桿菌致病基因的表達(dá)

已有研究發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌在抑制多種植物病原體和促進(jìn)植物生長(zhǎng)方面具有重要作用，其產(chǎn)生的次生代謝物可引發(fā)植物誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性，從而增強(qiáng)植株的抵抗力[23-24]。如：B.velezensis5113可改善小麥在非生物脅迫下的存活率和耐受性[25]。本研究顯示‘沃柑’和‘沙糖橘’植株在貝萊斯芽孢桿菌No.4菌劑處理21次后，葉脈中病原關(guān)鍵基因的相對(duì)表達(dá)量分別下降到50%和75%，而在自然狀態(tài)下，植株不容易靠自身的抵抗力達(dá)到降低韌皮部桿菌病原基因的相對(duì)表達(dá)量的效果，因此，貝萊斯芽孢桿菌No.4菌劑的使用可能改善了根際環(huán)境，誘導(dǎo)柑桔植株的抗黃龍病能力。

3.2 貝萊斯芽孢桿菌No.4菌劑對(duì)抗性相關(guān)基因表達(dá)量的影響

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是高等植物特殊的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以響應(yīng)各種生物和非生物的脅迫[26]。WRKY33轉(zhuǎn)錄因子對(duì)脫落酸的生物合成具有負(fù)調(diào)控作用[27]。本研究發(fā)現(xiàn)WRKY33基因表達(dá)上調(diào)，推測(cè)菌劑處理后可通過(guò)上調(diào)WRKY33基因表達(dá)，進(jìn)而抑制脫落酸的合成，從而解除植株生長(zhǎng)限制，促進(jìn)植株生長(zhǎng)，進(jìn)而影響其它生理生化指標(biāo)。處理組WRKY22基因表達(dá)量持續(xù)上調(diào)，這提示W(wǎng)RKY22、WRKY33轉(zhuǎn)錄因子可能參與響應(yīng)貝萊斯芽孢桿菌的免疫應(yīng)答，通過(guò)促進(jìn)植株生長(zhǎng)，進(jìn)而提高植株的抗病性及抗逆性。GST1是一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[28]，可響應(yīng)病原物的入侵，在植物抗病育種中常用其調(diào)控抗性基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)在36 h時(shí)，處理組GST1基因的表達(dá)量要高于對(duì)照組，推測(cè)菌劑處理可能誘導(dǎo)了GST1啟動(dòng)子表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控了其它抗性基因的表達(dá)，提高了植株抗性，抑制病原物侵襲。

3.3 貝萊斯芽孢桿菌No.4菌劑能明顯減輕根部褐變

已有研究報(bào)道根系的破壞是黃龍病病原菌直接造成的，不是由于碳水化合物的缺乏[29]。通過(guò)根部嫁接可以傳播黃龍病[30]。根部腐爛是黃龍病病菌的直接危害癥狀[31]。因此，防治根部腐爛至關(guān)重要。本研究觀察到黃龍病為害的柑桔植株，根系發(fā)生褐變，內(nèi)、外表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，這些特征和已有研究的結(jié)論是一致[32]。No.4菌劑處理后新生的根部表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，使根系褐變明顯減少，并促生新根生長(zhǎng)，這些結(jié)果為如何緩解黃龍病造成的根系褐化及腐爛提供了新思路。因此，下一步可以通過(guò)剪除褐變部位根系，并用菌劑浸泡根部，促進(jìn)根系生長(zhǎng)，從根部降低或抑制病原，減輕地上部葉片黃化癥狀，降低或清除頂部莖尖所帶病原，為后續(xù)微芽嫁接提供適合的材料，有利于降低操作難度，既可提高成活率，又可提高脫毒效率。

此外，菌劑用量一定程度上影響植株的生長(zhǎng)和代謝。為了不影響柑桔苗木的正常生長(zhǎng)，本研究采用了逐步提高菌劑用量的方式對(duì)苗木進(jìn)行處理：當(dāng)苗木弱小時(shí)，菌劑用量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致植株死亡；用量過(guò)低，則達(dá)不到抑制病原的效果。在植株生長(zhǎng)發(fā)育階段，要加強(qiáng)肥水，促進(jìn)苗木健壯生長(zhǎng)，才能有針對(duì)性地設(shè)計(jì)菌劑使用劑量，避免因施用菌劑濃度過(guò)高，增量過(guò)猛，造成對(duì)苗木的傷害。

本研究從復(fù)合菌中分離出No.4菌株，并通過(guò)測(cè)序確定其分類地位為貝萊斯芽孢桿菌，該No.4菌株高強(qiáng)度的處理方式可以降低柑桔母本苗木韌皮部桿菌的病原滴度，促發(fā)新根，減少根系褐變現(xiàn)象的發(fā)生。本研究對(duì)于進(jìn)一步開(kāi)展莖尖微芽嫁接培育柑桔無(wú)病苗木有重要的指導(dǎo)意義，對(duì)于提高柑桔莖尖微芽嫁接的脫毒效果有著積極的作用。