小米多糖分離純化及抗氧化活性研究

范三紅 李 蘭 張錦華 賈槐旺 白寶清

(山西大學生命科學學院1，太原 030006)(特色植物資源研究與利用山西重點實驗室；山西大學2，太原 030006)

小米的營養(yǎng)比較豐富，含有蛋白質[1]、脂肪[2]、淀粉[3]、維生素和礦物質[4]等多種營養(yǎng)成分。同時，小米有健脾胃、促進消化、補血健腦和降血壓等功效[5]。

多糖類化合物是由至少十個單糖組成的的高分子聚合物，并有降血糖[6]、抗氧化[7]、抗凝血[8]、抗腫瘤[9]和免疫調節(jié)[10]等重要的臨床作用。目前，多糖較為常見的的提取方法有水提醇沉法[11]、酶法[12]、超聲波輔助堿提法[13]、超聲輔助酶法[14]等。前人對小米的研究集中在小米黃色素[15]、多酚[16]、脂肪[17]、蛋白質[18]等方面，而對小米多糖的相關報道較少。潘海龍等[19]在提取小米中多糖采用正交優(yōu)化法的收率為7.76 mg/g。尹震花[20]對補骨脂多糖用DEAE-52纖維素色譜柱和Sephadex G-100柱色譜進行分離純化，得到了2種多糖(PPs-1-1和PPs-2-1)。在提取多糖時加入適量纖維素酶，可以破壞細胞壁從而促進多糖物質溶出，提高提取量。晁紅娟等[21]在毛竹提取多糖過程中，添加纖維素酶比不加酶條件下提取率和純度分別提高了10%和8.5%。目前酶法提取小米多糖還未見報道，本實驗以河峪黃小米為原料，采用超聲輔助酶法探索小米多糖最優(yōu)提取工藝條件，并進行分離純化以及抗氧化活性研究，為小米多糖的開發(fā)及綜合利用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

河峪黃小米，山西省晉中市榆社縣。

木瓜蛋白酶、苯酚、葡萄糖、氯仿、濃硫酸、正丁醇、DEAE纖維素DEAE-52、葡聚糖凝膠G-100、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼 (DPPH)、羥甲基氨基甲烷(Tris)、硫酸亞鐵、水楊酸、濃鹽酸。

1.2 儀器與設備

AL204型電子分析天平，SB-5200DT超聲波清洗儀，SP-2000UV型紫外可見分光光度計，SC-3614低速離心機 ，HL-2B恒流泵。

1.3 方法

1.3.1 小米多糖提取1.3.1.1 小米預處理

小米洗凈并60 ℃烘干，粉碎后過60目篩，裝袋冷藏備用。

1.3.1.2 小米多糖提取

小米粉→水提取→調節(jié)pH值→加酶，水浴→滅酶10 min→超聲(220W)→離心→濃縮上清液→加3倍無水乙醇→4 ℃靜置12 h→離心→沉淀→溶解定容→測定多糖濃度。

1.3.2 小米多糖的測定1.3.2.1 葡萄糖標準曲線

稱取105 ℃、4 h烘至質量不變的葡萄糖10 mg置于100 mL 容量瓶定容。分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL放于小試管，加蒸餾水至2.0 mL，用移液管加5%苯酚溶液1 mL，迅速加濃硫酸5 mL，混勻，冷卻至常溫后在490 nm測定吸光值。制得標準曲線回歸方程y=0.012 6x-0.010 1，R2=0.996 1。

1.3.2.2 多糖測定方法

粗多糖溶解定容至100 mL，搖勻后取2 mL，加5%苯酚溶液1 mL，5 mL濃硫酸，490 nm波長處測其吸光度值。小米多糖提取量計算見式(1)。

Y=(c×V×N)/m

(1)

式中：V為定容體積/mL；m為小米質量/g；c為溶液中多糖的質量濃度/mg·g-1；N是稀釋倍數(shù)。

1.3.3 單因素實驗

選料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)，超聲時間10、20、30、40、50 min，纖維素酶量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和提取溫度30、40、50、60、70 ℃這4個因素，以小米多糖提取量為評價指標。

1.3.4 Plackett-Burman實驗

以單因素實驗為基礎，多糖提取量為評價指標，從多個單因素中選出影響多糖提取量的關鍵性因素[22]。

表1 Plackett-Burman實驗因素及水平

1.3.5 響應面實驗

根據(jù)Plackett-Burman實驗結果，選取料液比(A)、超聲時間(B)、纖維素酶量(C)為單因素，以小米多糖提取量為響應值，進行響應面優(yōu)化實驗。實驗因素水平見表2。

表2 Box-Behnken 實驗因素水平表

1.3.6 小米多糖脫蛋白1.3.6.1 蛋白含量的測定

采用考馬斯亮藍G-250法[23]測定蛋白質含量，得標準曲線為Y=6.702 9X+0.003 9，R2=0.998 9。

1.3.6.2 脫蛋白方法選擇

Sevag法：將1/5的氯仿，正丁醇混合液(V氯仿∶V正丁醇=5∶1)加入多糖溶液中，震蕩20 min，離心(3 000 r/min,10 min)得上清液，重復6次按式(2)、式(3)計算蛋白脫除率和多糖保留率。

木瓜蛋白酶法：多糖溶液中加入2%的木瓜蛋白酶溶液，50 ℃水浴30 min，滅酶后離心得上清液，計算蛋白脫除率和多糖保留率。

酶法-Sevag法：先用酶法進行脫蛋白處理，然后用Sevag法脫除蛋白，測蛋白脫除率和多糖保留率。

蛋白脫除率=

(2)

(3)

1.3.7 小米多糖脫色

H2O2法：用0.05 mol/L的NaOH溶液將多糖溶液調pH至8.5，加入多糖溶液1/5體積的30% H2O2溶液，50 ℃恒溫脫色2 h，冷卻至室溫調pH為7.0，取上清液分別在450、490 nm測定其吸光度值，多糖脫色率和保留率計算見式(4)、式(5)。

(4)

(5)

活性炭：將活性炭多次清洗過濾并烘干，多糖溶液加入3%活性炭，60 ℃水浴2 h，取上清液在450、490 nm測定其吸光度值，并計算多糖脫色率和多糖保留率。

D315樹脂法[24]：在一定量的多糖溶液中加入5.00 g樹脂，調pH至6.0，振蕩24 h，過濾，在450、490 nm測上清液吸光度值，計算脫色率和多糖保留率。

1.3.8 DEAE-52柱層析

首先對DEAE-52進行活化處理，用鐵架臺固定DEAE-纖維素層析柱(2.6 cm×30 cm)后進行裝柱，過程中應不產(chǎn)生氣泡，分層現(xiàn)象，平衡12 h后上樣，多糖上樣3 mL，用tris-HCl、0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速2 mL/min，2 min收集一管，用苯酚-硫酸法測定每管多糖含量。

1.3.9 Sephadex G-100柱層析

將小米多糖組分MP-1配制成溶液，上樣2 mL，用0.1 mol/L NaCl溶液進行洗脫，流速0.5 mL/min，6 min收集一管，用苯酚-硫酸法測定每管多糖含量。

1.3.10 體外抗氧化活性研究1.3.10.1 羥基自由基清除能力

參考文獻[25]并稍加改進，取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的多糖溶液各1 mL加入6 mmol/L硫酸亞鐵溶液1 mL，搖勻，10 min后加6 mmol/L水楊酸溶液1 mL，搖勻，30 min后于510 nm處測定吸光度Ai，蒸餾水代替水楊酸測得本底Aj，蒸餾水代替多糖溶液為空白A0，羥基自由基清除率計算見式(6)。

S=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

(6)

1.3.10.2 DPPH自由基清除能力

參考文獻[26]并加以修改：取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的多糖溶液1 mL分別加入1 mL的0.2 mmol/L DPPH-無水乙醇溶液混勻，避光放置30 min，517 nm測吸光度Ai，用蒸餾水代替DPPH自由基得本底Aj，再用蒸餾水代替多糖溶液得空白A0，DPPH自由基清除率計算見式(6)。

1.3.10.3 超氧陰離子自由基清除能力

參考文獻[27]并進行修改：取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL的多糖溶液各1 mL，加入4.5 mL的pH=8.2的0.1 mmol/L tris-HCl溶液和2.4 mL蒸餾水混勻，常溫放置10 min，加0.1 mL 6 mmol/L鄰苯三酚，3 min后加1 mol/L HCl 0.1 mL終止反應，325 nm測定吸光度Ai，蒸餾水代替水楊酸溶液測本底Aj，蒸餾水代替多糖溶液為空白A0，超氧陰離子自由基清除率計算見式(6)。

1.3.11 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本實驗均進行3次重復,采用Design-Expert 8.0.6、Origin8.5和SPSS 21.0軟件作圖分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

由圖1可知，小米中多糖的提取量隨料液比的逐漸增大呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢，可能是料液比太小時，多糖提取不夠充分；料液比過大時，多糖提取量降低可能是過大料液比會降低提取液的固形物含量, 還會減少其吸收超聲波能[28]；超聲時間超過20 min后，多糖提取量顯著下降，原因可能是長時間超聲，超聲波的空化作用會破壞部分多糖的結構，并且長時間超聲會加劇雜質的溶出，從而降低了提取量[29]；酶用量超過1%后，多糖提取量開始出現(xiàn)下降趨勢，可能是酶量添加到1%時多糖已完全溶出，過多的酶分子對多糖的提取無貢獻，還會導致多糖降解，從而降低了多糖提取量；當溫度60 ℃后繼續(xù)升溫，多糖提取量開始下降，可能由于高溫破壞了多糖分子結構，從而提取量下降[30]。

圖1 單因素實驗結果

2.2 Plackett-Burman實驗

在單因素實驗的基礎上，以小米多糖提取量為評價指標進行Plackett-Burman實驗設計，每個因素分別設計高 (1)、低 (-1) 2個水平，對料液比(A)、加酶量(B)、超聲時間(C)、提取溫度(D)進行顯著性考察。由表4可見，影響實驗的主次順序為C>A>B>D，其中A、B、C影響極顯著(P<0.01)，所以選用這3個因素響應面實驗。

表3 Plackett-Burman實驗設計表及結果

表4 Plackett-Burman 實驗統(tǒng)計分析

2.3 響應面實驗

根據(jù)單因素實驗和Plackett-Burman實驗結果，選取料液比，超聲時間，纖維素酶量3個因素，以小米多糖提取量為響應值進行響應面實驗，用Design-Expert 8.0.6軟件對表5數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到小米粗多糖提取量對料液比，超聲時間，纖維素酶量的二次多項回歸模型為：小米多糖提取量=30.28+0.95A+1.24B+0.44C+1.22AB+1.08AC+0.46BC-2.94A2-8.85B2-3.03C2。

2.3.1 小米多糖提取響應分析方案及結果

表5 小米多糖提取響應分析方案及結果

表6 小米多糖提取量回歸模型的方差分析

2.3.2 響應面各因素交互作用分析

響應面的彎曲程度與該因素對多糖提取量影響成正相關，等高線圖中，橢圓形表明兩因素交互作用顯著，圓形說明交互作用不顯著[31]。在實驗因素水平范圍內(nèi)，存在小米多糖的最大提取量。響應面結果表明超聲時間10～30 min、料液比1∶10～1∶25范圍內(nèi)，小米多糖提取量先增大后減小。超聲時間20 min、料液比1∶20 g/mL附近值對小米多糖提取量有重要影響；料液比1∶10～1∶25、酶用量0.5%～1.5%多糖提取量先增大后減?。怀晻r間10～30 min、酶用量0.5%～1.5%時，多糖提取量先增大后減小，超聲時間20 min、酶用量1.0%附近值多糖提取量最大。

2.3.3 最優(yōu)工藝確定與回歸模型的驗證實驗

以多糖提取量為響應值，通過回歸模型分析，得出超聲輔助酶法提取小米多糖的最佳工藝條件：料液比1∶22.00、超聲時間20.87 min、酶用量1.04%、多糖提取量為30.451 mg/g。為了實驗中方便操作，將本工藝條件修正為料液比1∶22、超聲時間21 min、酶用量1%、此條件下多糖提取量為30.34 mg/g，與理論值相差0.111 mg/g，說明該修正工藝與實際結果擬合性較好，所建模型正確，利用響應面優(yōu)化的小米多糖提取工藝條件真實可靠，有實用價值。

2.4 小米多糖脫蛋白

采用3種方法對多糖進行脫蛋白，結果見圖2。當僅用木瓜蛋白酶法對多糖進行脫蛋白處理時蛋白脫除率65%，多糖保留率77%；只用Sevag法對小米多糖進行脫蛋白時蛋白脫除率73%，多糖保留率75%；當用酶法-Sevag法結合時蛋白脫除率可達78.23%，多糖保留率89.42%。選用酶法-Sevag法除多糖中的蛋白可在保證多糖保留率的情況下最大限度的脫除蛋白質[32]。

圖2 脫蛋白方法對多糖提取量的影響

2.5 小米多糖脫色

如圖3所示，3種不同脫色方法對小米多糖的脫色率都在60%以上，其中，當選用H2O2法對多糖進行脫色時脫色率僅為62%，并且H2O2氧化性較強，會破壞多糖糖苷鍵，導致多糖保留率降低[33]?；钚蕴糠〞r效果不太好可能是因為活性炭對色素特異性吸附[34]。采用D315樹脂法脫色效果最佳，脫色率和多糖保留率分別是88%、80.20%，故選用D315樹脂法脫色處理小米多糖。

圖3 脫色方法對多糖提取量的影響

2.6 DEAE-52柱層析

采用DEAE-52纖維素柱對脫蛋白脫色處理后小米多糖進行進一步的分離純化，如圖8。小米多糖經(jīng)DEAE-52柱層析純化得到兩個組份MP-1、MP-2。因MP-2含量較少，所以將MP-1進行富集，透析，進一步純化。

圖4 小米多糖DEAE-52色譜柱洗脫曲線

2.7 Sephadex G-100凝膠柱層析

小米多糖MP-1經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱層析洗脫，得到單一對稱的曲線圖，證明此時得到的小米多糖是較純多糖，對該組份進行富集，干燥可得小米多糖MP-1組分純品。

圖5 小米多糖Sephadex G-100色譜柱洗脫曲線

2.8 體外抗氧化活性

圖6為VC和小米多糖MP-1抗氧化能力結果圖。在0.5～2.5 mg/mL時，MP-1和VC對羥自由基清除能力呈上升趨勢，在0.5～2 mg/mL時，MP-1對羥自由基清除率逐漸上升，在2.5mg/mL時基本平穩(wěn)，清除率是70.69%；在0.5～2mg/mL時，VC和小米多糖MP-1對DPPH自由基清除能力都隨著濃度的增加而增強，當質量濃度為2.5 mg/mL時，VC和MP-1對DPPH自由基清除率分別為99.31%、75.33%：超氧陰離子自由基是一種本身對身體無害的弱氧化劑，但是它與羥基分子結合可能會破壞DNA和其他生物分子[35]，0.5～2 mg/mL的MP-1對超氧陰離子自由基的清除率為25.56%～65.32%。經(jīng)SPSS 21.0分析可得，MP-1對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子清除率最高分別為75.33%、70.69%、68.62%，對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子半抑制質量濃度分別為1.105、0.200、1.371 mg/mL，表明小米中多糖具有較好的抗氧化能力。

圖6 MP-1和VC的抗氧化能力

3 結論

小米中多糖提取優(yōu)化工藝條件，并對其進行分離純化和抗氧化活性研究。最終確定小米多糖最佳提取工藝參數(shù)為：液料比為1∶22，超聲時間21 min，纖維素酶添加量1%，超聲溫度60 ℃，小米多糖提取量為30.34 mg/g。經(jīng)木瓜蛋白酶法-Sevag法脫蛋白，D315樹脂法脫色， DEAE-52纖維素色譜柱和Sephadex G-100柱色譜純化得到多糖組分MP-1，并對MP-1進行體外抗氧化性活性研究。抗氧化研究表明，MP-1對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子清除率最高分別為75.33%、70.69%、68.62%，對DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子半抑制質量濃度分別為1.105、0.200、1.371 mg/mL，表明小米多糖具有較好的抗氧化能力。