加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析篩胃癌相關(guān)分子

肖又德 鄭永法 戈 偉

1.泰康同濟(jì)（武漢）醫(yī)院腫瘤科，湖北武漢 430000；2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤科，湖北武漢 430000

胃癌（gastric cancer）是世界上癌癥相關(guān)性死亡的常見原因之一，其病死率位居癌癥病死率的第三位[1]，盡管以手術(shù)結(jié)合化療的方案廣泛應(yīng)用于胃癌的治療，但胃癌的5 年生存率依然較低[2-3]?；蛐酒壳皬V泛應(yīng)用于包括癌癥在內(nèi)的多種復(fù)雜疾病的診斷、預(yù)測(cè)以及藥物篩選等領(lǐng)域[4-6]。但傳統(tǒng)的篩選差異基因表達(dá)極易遺漏調(diào)控過程中的核心分子。通過系統(tǒng)的繪制個(gè)體生物網(wǎng)絡(luò)互作圖可以精準(zhǔn)找出與預(yù)后相關(guān)的核心分子[7-8]，加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene coexpression network analysis，WGCNA）可以有效解決上述問題[9-10]。本研究擬利用該方法篩選更為有效的胃癌分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集獲取

從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/，檢索時(shí)間：建庫至2020 年11 月14 日）中下載胃癌患者的RNA-seq 數(shù)據(jù)及其臨床資料，并剔除生存情況及病理分期不明的患者，最終納入359 例胃癌患者。同時(shí) 從GEO 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，通過關(guān)鍵詞（胃癌、生存和基因芯片）檢索篩選帶有生存數(shù)據(jù)的胃腺癌數(shù)據(jù)集，且數(shù)據(jù)集能獲得標(biāo)準(zhǔn)化的注釋文件，獲取兩個(gè)數(shù)據(jù)集（GES15459 和GSE22377，檢索時(shí)間：建庫至2020 年11 月14 日），用于外部驗(yàn)證胃癌患者的預(yù)后。含有多種癌癥組織和癌 旁 組 織 的ONCOMINE 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.oncomine.org）也用于外部驗(yàn)證。

1.2 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

WGCNA 是一種常用的模塊化分析技術(shù)，已被用于識(shí)別和篩選復(fù)雜疾病的生物標(biāo)志物或藥物靶點(diǎn)[11]。首先，通過R 軟件中的“WGCNA”分析包構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)[8,12]。然后，建立兩個(gè)基因之間的相關(guān)矩陣，通過對(duì)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，確定軟閾值大小，將鄰接轉(zhuǎn)化為拓?fù)渲丿B矩陣（TOM），TOM 可以度量1個(gè)基因的網(wǎng)絡(luò)連通性[7,13]。為了將表達(dá)譜相似的基因分類到基因模塊（ME）中，基于TOM 的差異測(cè)度進(jìn)行平均連鎖層次聚類[8,12]。模塊鑒定后，采用t 檢驗(yàn)計(jì)算組間各基因表達(dá)顯著性檢驗(yàn)的P 值。為進(jìn)一步分析模塊特征基因的差異性，為模塊樹狀圖選擇一條切線，并合并部分模塊。

1.3 特征模塊和核心基因篩選

對(duì)每個(gè)ME 進(jìn)行分析時(shí)，通過Pearson 相關(guān)檢驗(yàn)來評(píng)估MEs 與轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，以確定相關(guān)模塊（各模塊在各個(gè)樣本上Pearson 系數(shù)絕對(duì)值相加為最高者認(rèn)定為響應(yīng)系數(shù)最高模塊）。選擇與轉(zhuǎn)移高度相關(guān)的模塊作為轉(zhuǎn)移模塊進(jìn)行分析。利用STRING 網(wǎng)站進(jìn)行蛋白-蛋白的互作（PPI）分析（選擇連接數(shù)最大10個(gè)），并利用Cytoscape 軟件中的MCODE 插件進(jìn)一步分析。同時(shí)利用R 軟件的LASSO 回歸分析包篩選轉(zhuǎn)移模塊中基因。

1.4 GO 功能學(xué)、KEGG 通路分析和GSEA 分析

為了解轉(zhuǎn)移模塊涉及的功能學(xué)和通路。采用標(biāo)準(zhǔn)富集計(jì)算方法進(jìn)行GO 功能分析和KEGG 通路分析用以篩選與其相關(guān)的功能和通路。為了解核心分子在胃癌患者中的潛在功能，利用TCGA 胃癌患者數(shù)據(jù)集進(jìn)行GSEA 分析。將P<0.05 和|富集評(píng)分（ES）|>0.3作為截止標(biāo)準(zhǔn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采 用SPSS 24.0、GraphPad Prism 7.0 和R 3.4.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，同時(shí)用上述軟件進(jìn)行圖像生成處理。組間比較采用t 檢驗(yàn)?；蜃罴呀攸c(diǎn)取值，利用X-Tile 軟件，基于最小P 值和最大Log-rank χ2值進(jìn)行分析計(jì)算[14]。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，評(píng)估核心靶基因的預(yù)測(cè)能力，利用曲線下面積（AUC）評(píng)估敏感度和特異性。K-M 法繪制生存曲線，預(yù)測(cè)基因?qū)颊哳A(yù)后的影響。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般資料

本研究共納入359 例胃癌患者進(jìn)行分析，其中男230 例，女129 例；年齡（65.7±10.9）歲；腫瘤位置：近端87 例，胃體134 例，遠(yuǎn)端131 例，未知7 例；腫瘤組織學(xué)分級(jí)：G18 例，G2128 例，G3215 例，GX8 例；病理分期：Ⅰ期53 例，Ⅱ期116 例，Ⅲ期152 例，Ⅳ期38 例。

2.2 構(gòu)建共表達(dá)模塊結(jié)果

WGCNA 方法將基因進(jìn)行模塊化富集分析（圖1，封三），共篩選16個(gè)相應(yīng)的ME，見圖2（封三），依據(jù)各模塊在各個(gè)樣本上Pearson 系數(shù)篩選獲取了BLUE模塊，BLUE 模塊共含有2078個(gè)基因。

圖1 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析模式圖

圖2 各模塊相關(guān)分析圖

2.3 BLUE 模塊相關(guān)功能分析及核心分子篩選結(jié)果

BLUE 模塊中相關(guān)基因篩選表達(dá)響應(yīng)基因參與的信號(hào)通路關(guān)聯(lián)提示，主要與蛋白磷酸化異常、蛋白激酶活化等相關(guān)，見圖3（封三）。PPI 和MOCDE 插件篩選位于調(diào)控核心位置的基因，見圖4。LASSO 分析篩選出19個(gè)與預(yù)后相關(guān)的靶基因（DUSP16、NUP50、CDC5L、PTPRF、KBTBD2、SLC11A2、DHX15、ACBD5、RMI1、TRIM25、C3orf38、MSI2、VPS35、RNF43、PACRGL、GMCL1、SMAD5、IMPACT、IDE）。將上述3種方法篩選的結(jié)果進(jìn)行綜合分析，獲得CDC5L。

圖3 BLUE 模塊中GO 和KEGG 分析

圖4 蛋白互作分析

2.4 CDC5L 驗(yàn)證結(jié)果

CDC5L 表達(dá)量為7.2 時(shí)為最佳截點(diǎn)，見圖5（封三）。低表達(dá)CDC5L 患者的總生存率高于高表達(dá)患者（P=0.038），見圖6。為了解CDC5L 表達(dá)量在患者TNM 分期中的作用，對(duì)其分層分析，結(jié)果提示其Ⅰ、Ⅱ期低表達(dá)CDC5L 患者總生存率高于高表達(dá)患者（P=0.06、0.03），見圖7。CDC5L 顯示出較強(qiáng)的預(yù)測(cè)胃癌轉(zhuǎn)移患者能力（AUC=0.745），見圖8。ONCOMINE數(shù)據(jù)庫對(duì)CDC5L 基因進(jìn)行meta 分析發(fā)現(xiàn)，納入的33個(gè)數(shù)據(jù)集中，癌組織中CDC5L 表達(dá)量高于癌旁組織（P <0.001），見圖9。GEO 數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證結(jié)果顯示，低表達(dá)CDC5L 的胃癌患者有著更好的預(yù)后，見圖10。

圖5 X-tile軟件選取得CDC5L最佳截點(diǎn)

圖6 不同CDC5L 表達(dá)情況胃癌患者生存分析曲線

圖7 不同病理分期胃癌患者生存分析曲線

圖8 CDC5L 預(yù)測(cè)胃癌轉(zhuǎn)移的ROC 曲線

圖9 胃癌和癌旁組織中CDC5L 表達(dá)比較

圖10 CDC5L 在GEO 數(shù)據(jù)集的驗(yàn)證結(jié)果

2.5 GSEA 功能學(xué)分析結(jié)果

結(jié)果顯示，CDC5L 主要涉及細(xì)胞周期調(diào)控以及糖代謝通路。見圖11。

圖11 GSEA 分析功能學(xué)分析結(jié)果

3 討論

胃癌是世界上癌癥相關(guān)性死亡的常見原因之一，盡管目前以手術(shù)結(jié)合化療/免疫治療/靶向治療等多種方案已廣泛應(yīng)用于胃癌的治療當(dāng)中，但胃癌的五年生存率依然低下[2-3]。這主要是因?yàn)榇蠖鄶?shù)胃癌患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，造成其預(yù)后不佳[15]。晚期轉(zhuǎn)移性胃癌患者五年生存率不足10%[16-17]。為更早地識(shí)別具有高危轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的胃癌患者，本研究利用TCGA 數(shù)據(jù)集，通過精準(zhǔn)的WGCNA 方法識(shí)別出CDC5L 與胃癌患者預(yù)后相關(guān)，同時(shí)其能夠較好地預(yù)測(cè)早期胃癌患者是否發(fā)生轉(zhuǎn)移；內(nèi)部和外部數(shù)據(jù)集同時(shí)驗(yàn)證CDC5L 具有較強(qiáng)的重復(fù)性和可靠性。

CDC5L 是G2/M 轉(zhuǎn)變所必需的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑[18-20]。CDC5L 通過與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)蛋白ATR 相互作用，激活A(yù)TR 下游效應(yīng)因子，干擾CDC5L 表達(dá)使S期細(xì)胞周期檢查點(diǎn)失活，從而增加藥物敏感性[21-22]。研究顯示[23-25]，CDC5L 在肝癌、口腔鱗癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤中也發(fā)揮了作用。但目前尚無CDC5L 在胃癌中的作用及相關(guān)機(jī)制的報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，CDC5L 能較好地預(yù)測(cè)胃癌患者生存及轉(zhuǎn)移發(fā)生情況。外部ONCOMINE 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，CDC5L 在癌組織中高表達(dá)。GEO 數(shù)據(jù)集驗(yàn)證了低表達(dá)CDC5L 胃癌患者有更好的預(yù)后。因此，本研究結(jié)果對(duì)未來探索CDC5L 與胃癌患者不良預(yù)后奠定了一定的基礎(chǔ)。但不可否認(rèn)的是，本研究結(jié)果還需進(jìn)一步在臨床樣本中獲得更為可靠的驗(yàn)證，以及通過體內(nèi)/外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CDC5L 的臨床和生物學(xué)意義。

總之，本研究通過WGCNA 等生物信息學(xué)方法利用TCGA 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)CDC5L 高表達(dá)與較差預(yù)后相關(guān)。利用外部數(shù)據(jù)集對(duì)上述結(jié)果驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)CDC5L 在癌組織中高表達(dá)。CDC5L 有可能成為新的預(yù)后指標(biāo)，有助于胃癌患者個(gè)性化治療及臨床預(yù)后判斷。