糖皮質(zhì)激素受體基因NR3C1 rs7701443 和rs2963156 多態(tài)性與腦小血管病的相關(guān)性分析

李靜雅 王 君 莫衛(wèi)焱 任 歆 汪 琦 周衛(wèi)東

1.應(yīng)急總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100028；2.北京市隆福醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100010

腦小血管病（CSVD）為一種環(huán)境因素和基因遺傳共同作用的疾病，遺傳因素在CSVD 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。腦缺血后調(diào)節(jié)和影響炎癥反應(yīng)的糖皮質(zhì)激素受體基因（NR3C1）多態(tài)性與CSVD 的相關(guān)性研究備受關(guān)注。van Rossum 等[2]研究認(rèn)為NR3C1 ER22/23EK 位點(diǎn)多態(tài)性是CSVD 中腦白質(zhì)病變保護(hù)因素。預(yù)研樣本中未檢出ER22/23EK，中國(guó)千人基因組里查找未發(fā)現(xiàn)ER22/23EK 突變型。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)[3]，（NR3C1）上rs7701443 和rs2963156 兩個(gè)標(biāo)簽基因多態(tài)性與代謝綜合征風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。在單基因位點(diǎn)分析中，SNP rs7701443 AA 和rs2963156 CT、CT/TT 與GG、CC比較，分別獨(dú)立增加了代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)。另一項(xiàng)研究顯示，rs7701443 位點(diǎn)AA 基因型攜帶者的體重指數(shù)（BMI）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）均高于GG+GA基因型攜帶者。rs2963156位點(diǎn)TT基因型攜帶者的腰臀比（WHR）、TC、LDL-C 等均低于CC+CT 基因型攜帶者。代謝綜合征的危險(xiǎn)因素及BMI、SBP、DBP、WHR等亦是CSVD 的危險(xiǎn)因素。我國(guó)人群NR3C1 與CSVD的相關(guān)性尚不明確，因此，有必要對(duì)NR3C1 上基因位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性研究。本研究旨在分析中國(guó)北京地區(qū)漢族人群中NR3C1 rs7701443 和rs2963156 基因位點(diǎn)與CSVD 的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

CSVD組為2013 年3 月—2018 年5 月于應(yīng)急總醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）神經(jīng)內(nèi)科前瞻性研究[4-6]收集確診為CSVD 的患者200 例，男74 例，女126 例，年齡（65.49±8.97）歲，均來(lái)自同一地區(qū)且非1 級(jí)親屬。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡50～85 歲，符合CSVD 診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷標(biāo)準(zhǔn)：按照《中國(guó)腦小血管病診治專家共識(shí)2015》[5]。對(duì)照組為同期我院招募的年齡在50～85 歲，且經(jīng)MRI 排除CSVD 的正常對(duì)照100 名，男33 名，女67 名，年齡（60.17±7.235）歲。本研究已獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均已簽署知情同意書。兩組均采用統(tǒng)一調(diào)查表。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 采集受試者靜脈血1～2 mL，用北京博邁德基因技術(shù)有限公司全血基因組DNA 快速提取試劑盒（貨號(hào)：DL101-01）嚴(yán)格按照說(shuō)明書行DNA 提取。DNA 質(zhì)檢合格后，存放-20℃冰箱備用。

1.2.2 擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)和合成 從NCBI SNP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）分別獲得rs7701443和rs2963156 位點(diǎn)上下游約300 bp 序列。利用DNAMAN 序列分析軟件設(shè)計(jì)兩個(gè)SNP 位點(diǎn)的擴(kuò)增引物：rs7701443 正向引物rs7701443-F（5’-ATTCTCTCCATTCATTCCTT-3’），反向引物rs7701443-R（5’-ATTTTCCTAACCTTAAACAC-3’）。rs7701443 變異位點(diǎn)距正向引物5’端109 bp，距反向引物5’端154 bp。rs2963156 擴(kuò)增正向引物為rs2963156-F（5’-TAGTTGGATGAATTTAGGTG-3’），反向引物rs2963156-R（5’-GGGGTATTTTCCTGTAAGAA-3’）。rs2963156 變異位點(diǎn)距正向引物5’端234 bp，距反向引物5’端155 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR 擴(kuò)增 采用天根生化科技（北京）有限公司高保真TIANSeq HiFi Amplification Mix（貨號(hào)：NG219）對(duì)目的DNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系：TIANSeq HiFi Amplification Mix 10 μL，10 μmol/L 正反向引物各1 μL，基因組DNA 50 ng，加ddH2O 至20 μL。94℃預(yù)變性10 min，94℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35 個(gè)循環(huán)。然后72℃延伸2 min，16℃保存。PCR 擴(kuò)增均在杭州博日科技股份有限公司Gene Explorer PCR擴(kuò)增儀器[貨號(hào)：TC-96/G/H（b）B]上完成。擴(kuò)增結(jié)束后，吸取PCR 產(chǎn)物5 μL 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.4 測(cè)序 PCR 產(chǎn)物送北京華大基因生物公司和北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行一代測(cè)序。一代測(cè)序采用雙脫氧核苷酸鏈終止法在自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行，用Chromas 軟件對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行分析，根據(jù)測(cè)序峰圖結(jié)果判定樣品對(duì)應(yīng)基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)。相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)率以優(yōu)勢(shì)比（odds ratio，OR 值）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

遺傳平衡檢查：對(duì)2 個(gè)SNP 位點(diǎn)（rs7701443 和rs2963156）分別行Hardy-Weinberg 平衡吻合度檢驗(yàn)，rs7701443 CSVD組χ2=0.014，P=0.993，對(duì)照組χ2=0.123，P=0.941。rs2963156 CSVD組χ2=1.127，P=0.569，對(duì)照組χ2=0.011，P=0.994。兩組均具有符合Hardy-Weinberg 平衡，樣本具有群體代表性。

2.1 rs7701443 多態(tài)性

2.1.1 兩組rs7701443 等位基因頻率比較 兩組基因型頻率和等位基因頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組rs7701443 等位基因頻率比較[例（%）]

2.1.2 排除CSVD 危險(xiǎn)因素 排除高血壓、冠心病、糖尿病等CSVD 危險(xiǎn)因素影響后，兩組基因型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組rs7701443 基因型頻率比較（例）

2.2 rs2963156 多態(tài)性

2.2.1 兩組rs2963156 等位基因頻率比較 兩組rs2963156 基因型頻率和等位基因頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 兩組rs2963156 等位基因頻率比較[例（%）]

2.2.2 排除CSVD 危險(xiǎn)因素 排除高血壓、冠心病、糖尿病等CSVD 危險(xiǎn)因素影響后，兩組rs2963156基因型頻率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表5。

表5 兩組rs2963156 基因型頻率比較（例）

3 討論

CSVD 危險(xiǎn)因素的影響與以往研究一致[7-14]。本研究未發(fā)現(xiàn)NR3C1 兩個(gè)標(biāo)簽基因位點(diǎn)rs7701443 和rs2963156 與CSVD 相關(guān)。

在CSVD 與候選基因多態(tài)性的相關(guān)性研究中[15]，至少存在36 個(gè)候選基因[4]。Tao 等[16]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1 rs1800470 對(duì)CSVD 的腦白質(zhì)變性起保護(hù)功能。Shan 等[17]關(guān)于COX2 與CSVD 的相關(guān)性研究中示rs689466 和rs20417 對(duì)腦白質(zhì)變性有保護(hù)性作用。Li 等[11]報(bào)道4 種候選基因（MYLK、AQP4、NINJ2 和INK4/ARF）中15個(gè)SNP與CSVD相關(guān)性研究，且rs2222823 雜合子和rs2811712 對(duì)CSVD 起保護(hù)作用。有研究提示[3,18]，rs7701443 和rs2963156 基因位點(diǎn)多態(tài)性與代謝綜合征、心血管疾病中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

本研究未發(fā)現(xiàn)這兩種基因多態(tài)性與CSVD 的相關(guān)性，可能原因：人種不同；發(fā)病機(jī)制不同，CSVD 主要是小動(dòng)脈、微動(dòng)脈、內(nèi)皮細(xì)胞受損導(dǎo)致，而代謝綜合征、心血管疾病的發(fā)病機(jī)制多傾向于大動(dòng)脈粥樣硬化[19-25]；該兩種基因多態(tài)性野生型基因頻率低，多數(shù)為多態(tài)性基因型。因此，需要更大的樣本量才可能達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，或者等待更多研究報(bào)道后薈萃分析后得出明確結(jié)論。