王 選 董世雷 張亞培 范芳華 朱 杰
浙江醫(yī)院醫(yī)學檢驗科,浙江杭州 310013
新德里金屬β 內(nèi)酰胺酶(New Delhi metallo-βlactamase,NDM)是2008 年首次發(fā)現(xiàn)的一種新型碳青霉烯酶[1]。隨后其便以驚人的速度在世界范圍內(nèi)播散流行。目前認為南亞、歐洲以及中東為NDM 最為流行的地區(qū)[2]。2011 年浙江省發(fā)現(xiàn)首例產(chǎn)NDM-1 鮑曼不動桿菌患者[3],隨后NDM 便在細菌中蔓延開來[4-8]。NDM 國內(nèi)雖多有研究,但菌株大多呈分散分布[9]。關(guān)于blaNDM-1基因分子水平研究,目前國內(nèi)還比較欠缺。本研究擬通過對2015 年1 月—6 月分離的29 株產(chǎn)NDM-1 腸桿菌科細菌進行同源性分析,了解其在該地區(qū)的流行情況;通過周圍序列分析,闡明該基因所處的周圍環(huán)境。
29 株產(chǎn)NDM-1 腸桿菌科細菌分離自浙江醫(yī)院碳青霉烯類抗生素耐藥菌株,包括9 株陰溝腸桿菌(Eo),6 株產(chǎn)氣腸桿菌(EA),4 株大腸埃希菌(EC),4 株弗勞地枸櫞酸桿菌(FC),2 株肺炎克雷伯菌(KP),2 株產(chǎn)酸克雷伯菌(KO)和2 株摩根摩根菌(MM)。本研究經(jīng)浙江醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。
Vitek2 compact 全自動細菌鑒定系統(tǒng)和藥敏系統(tǒng)(法國梅里埃公司,型號:VITEK?2 COMPACT 30);VITEK MS 質(zhì)譜儀(法國梅里埃公司,型號:VITEK?MS);哥倫比亞血瓊脂平板(鄭州貝瑞特生物制品有限公司,批號:0052020);Taq 酶及PCR 相關(guān)試劑(日本Takara 公司,批號:R007WZ);質(zhì)粒抽提試劑盒(美國Axygen 公司,批號:12318KA1);PCR 儀器及紫外成像系統(tǒng)(德國Biometra 公司,型號:Bio-1000F);脈沖場凝膠電泳儀及成像系統(tǒng)及相關(guān)試劑(德國Biometra 公司,型號:Biometra-Rotaphor?6.0)。
Vitek2 compact 全自動細菌鑒定系統(tǒng)和藥敏系統(tǒng)進行菌株鑒定和藥敏試驗,VITEK MS 質(zhì)譜儀對鑒定結(jié)果進行確認。
質(zhì)粒提取試劑盒提取菌株DNA 為模板,分別擴增碳青霉烯酶耐藥基因和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)耐藥基因,引物參照文獻[10-11]。陽性產(chǎn)物測序分析,確定耐藥基因類型。
采用脈沖場凝膠電泳技術(shù)對攜帶blaNDM-1基因腸桿菌科細菌進行同源性分析。具體操作流程和判定標準參考文獻[12]。
對EC、KP 和Eo 進行多位點序列分型。管家基因引物序列及擴增條件參見參考文獻[13-15]。PCR 擴增產(chǎn)物進行測序比對,以確定該菌株的多位點序列分型(MLST)型別。
受體菌為利福平耐藥大腸埃希菌EC600,供體菌為攜帶blaNDM-1菌株。接合子用VITEK MS 進行質(zhì)譜鑒定,PCR 擴增接合子blaNDM-1確認。
方法為以接合子DNA 為模板,PCR 擴增特異性引物來確定質(zhì)粒型別。擴增陽性產(chǎn)物進行測序,根據(jù)測序結(jié)果進行質(zhì)粒復(fù)制子分型。
提取接合子質(zhì)粒DNA,根據(jù)國內(nèi)攜帶blaNDM-1質(zhì)粒pNDM-HN380 的全質(zhì)粒測序序列(GenBank,JX10476 0.1),設(shè)計引物PCR 擴增接合子該基因周圍序列(8828 bp)。PCR 陽性結(jié)果測序,測序所得DNA 序列進行拼接,繪制開放閱讀框架示意圖。
29 株攜帶blaNDM-1基因菌株中,86.9%(26/29)合并ESBLs 或其他碳青霉烯酶耐藥基因。其中,3 株EA,2 株FC,1 株Eo 和1 株KP 同時含有blaNDM-1和blaKPC-2基因;1 株Eo 同時攜帶blaNDM-1和blaIMP-4基因;1 株KP 同時攜帶blaNDM-1和blaVIM-1基因。耐藥基因檢測結(jié)果見表1。
PFGE 分析發(fā)現(xiàn),6 株EA,5 株Eo,2 株EC 及2 株KO 分別具有同源性,見圖1。MLST 發(fā)現(xiàn)3 株大腸埃希菌為ST167,5 株陰溝腸桿菌為ST114,見表1。
圖1 菌株P(guān)FGE 示意圖
27 株菌株接合成功,見表1。接合子進行PBRT 質(zhì)粒分型發(fā)現(xiàn),其中16 株為IncX3 型質(zhì)粒,7 株為無法區(qū)分的型別,2 株為IncN 型質(zhì)粒,2 株為IncF 型質(zhì)粒。
表1 29 株產(chǎn)NDM-1 腸桿菌科細菌及其結(jié)合子菌株信息表
基因周圍環(huán)境分析見圖2。其中菌株KO-03、FC-05、EC-06 和Eo-09 的開放閱讀框架同已公開序列的KP 質(zhì)粒pNDM-HN380(GenBank 登錄號JX104760.1)完全一致,基因片段blaNDM-1-bleMBL-trpF 存在于所有已測序成功的16 株菌株中。
圖2 blaNDM-1 基因及其周圍環(huán)境的開放閱讀框架示意圖
兩種碳青霉烯酶存在于同一菌株中,在國內(nèi)外極少出現(xiàn)[16-17]。本研究結(jié)果顯示,9 株菌株攜帶兩種碳青霉烯酶。多種耐藥基因的合并存在,給產(chǎn)NDM-1 菌株的治療帶來更大挑戰(zhàn)。在國內(nèi),極少出現(xiàn)同一克隆株的傳播流行現(xiàn)象[18-19]。本研究通過PFGE 分析發(fā)現(xiàn)部分菌株具有同源性,提示需加強院內(nèi)感控,關(guān)注多重耐藥菌的傳播流行現(xiàn)象。質(zhì)粒是介導(dǎo)blaNDM-1基因傳播轉(zhuǎn)移的主要載體。目前世界上可以攜帶該基因的質(zhì)粒有IncX3、A/C、L/M、FI/FII、I1 等型別[20-21]。其中,IncX3 型質(zhì)粒認為是國內(nèi)介導(dǎo)該基因傳播轉(zhuǎn)移的主要載體[22-23]。本研究對接合子進行PBRT 質(zhì)粒分型發(fā)現(xiàn),59.3%(16/27)的質(zhì)粒為IncX3 型別,提示IncX3 型質(zhì)粒同樣是介導(dǎo)本地區(qū)blaNDM-1基因轉(zhuǎn)移的主要質(zhì)粒。
本研究對所獲菌株blaNDM-1基因周圍序列進行測序拼接發(fā)現(xiàn),測序成功菌株中均存在基因片段blaNDM-1-bleMBL-trpF,這與國內(nèi)報道一致[24-25]。本研究所有該基因上游均存在至少一個插入序列ISAba125。提示與ISAba125 相關(guān)的初始動員機制可能是blaNDM-1-bleMBL- trpF 基因獲得的原因。但是,trpF 下游區(qū)域基因序列
是多樣的,這提示浙江省blaNDM-1基因的獲得可能有多種來源。
綜上所述,本研究從菌株、質(zhì)粒以及基因3 個水平對NDM-1 的傳播方式進行分析發(fā)現(xiàn),多種傳播轉(zhuǎn)移方式的共同作用加速了該酶在腸桿菌科細菌中的流行。因此,院內(nèi)感染控制科迫切需要監(jiān)測腸桿菌科細菌中的碳青霉烯酶,特別是NDM-1,以控制和預(yù)防這類細菌的傳播流行。