龍虎人丹改善糖尿病小鼠腎損傷和纖維化的藥效研究

高詩(shī)雨，梁蘭妹，張薺，李穎，任梓漠，賴文杰，熊詩(shī)琳，丁禮琴，金家驊，蘭天

（1.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.上海中華藥業(yè)有限公司，上海 201707）

糖尿病腎?。―N）是最常見(jiàn)且最嚴(yán)重的糖尿病微血管并發(fā)癥，占糖尿病患者總數(shù)40%，是導(dǎo)致終末期腎?。╡nd?stage renal disease，ESRD）和糖尿病患者死亡的主要原因[1?2]。DN臨床主要特征為持續(xù)的蛋白尿及腎功能進(jìn)行性下降，而腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化病變與之密切相關(guān)。DN典型的腎形態(tài)學(xué)變化包括腎小球系膜擴(kuò)張、基底膜（glomeru?lar basement membrane，GBM）增厚、腎小管損傷、腎臟炎癥浸潤(rùn)和腎小管間質(zhì)纖維化等[3?4]。纖維粘連蛋白(fibronectin,FN)和膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其過(guò)度分泌是促進(jìn)腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的主要原因[5]。由于DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前治療DN的藥物以降血糖類和腎素血管緊張素類藥物為主，但它們?cè)诎l(fā)揮治療作用的同時(shí)也對(duì)機(jī)體產(chǎn)生不同程度的副作用。因此，開(kāi)發(fā)治療DN的新型靶向藥物已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

龍虎人丹（LHRD）是由甘草、兒茶、肉桂、薄荷腦、冰片等11味中藥材組成的中藥復(fù)方，具有開(kāi)竅醒神、和中止嘔、祛暑化濁功效?？捎糜谥惺铑^暈、惡心嘔吐、腹瀉及暈船、暈車[6]。該功效提示其具備調(diào)理脾胃、化濁健運(yùn)的功能，而臨床期糖尿病腎病的病機(jī)特點(diǎn)為“脾腎兩虛，淤血阻滯腎絡(luò)”[7]，故探索LHRD健脾化濁功能對(duì)DN的干預(yù)作用具有十分重要的意義。此外，目前已有研究表明LHRD能顯著降低STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的血糖，并可以通過(guò)抑制炎癥因子釋放和氧化應(yīng)激途徑改善CCl4誘導(dǎo)的慢性小鼠肝纖維化，或是通過(guò)提高肝臟抗氧化應(yīng)激能力，抵制過(guò)量APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷，進(jìn)而起到肝保護(hù)作用[8?10]。基于LHRD已有的臨床用途及上述相關(guān)研究結(jié)果，本研究擬對(duì)LHRD在糖尿病腎臟并發(fā)癥中的藥效進(jìn)行評(píng)價(jià)，以挖掘其潛在的應(yīng)用價(jià)值，為L(zhǎng)HRD的臨床研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

38只SPF級(jí)C57BL6/J雄性小鼠，體質(zhì)量22~25 g，8周齡，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2018?0034。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照中國(guó)動(dòng)物福利法相關(guān)規(guī)定進(jìn)行，并得到廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（No.gdpu?lac2018062）。

1.2 藥物及試劑

龍 虎 人 丹（LHRD，規(guī)格：0.04 g/丸，批號(hào)：161006，上海中華藥業(yè)有限公司）；陽(yáng)性藥氯沙坦（規(guī)格：50 mg/片，批號(hào)：2018005，杭州默沙東制藥有限公司）；鏈脲佐菌素（STZ，批號(hào)：WXBD0304V，美國(guó)Sigma公司）；葡萄糖（批號(hào)：2018052069，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；尿蛋白、血肌酐和尿素氮檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20181023、20181128、20181011，南京建成生物技術(shù)研究所）；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)：UD282629，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；FN一抗（批號(hào)：CR3274504?2，英國(guó)abcam公司）；an?ti?GAPDH抗體（批號(hào)：N20908，北京全式金生物技術(shù)有限公司）；蘇木素伊紅（H&E）染液（批號(hào)：0729A20，北京雷根生物技術(shù)有限公司）；Masson三色染色液（批號(hào)：0928A20，北京雷根生物技術(shù)有限公司）；SYBRGreen Supermix（批號(hào)：64309999，美國(guó)Bio?Rad公司）；TAKALA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：AJ2014A，大連TAKALA公司）；HRP標(biāo)記羊抗兔、抗鼠二抗（批號(hào)：0000390794、0000379490，美國(guó)Pro?mega公司）。

1.3 主要儀器

One?Touch Ultra型血糖儀（型號(hào)：One?Touch Ultra Vue，美國(guó)強(qiáng)生公司）；多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：1510，美國(guó)Thermo Fisher Scientific）；LC480熒光定量PCR儀（型號(hào)：Roche LC 480，瑞士Roche）；微型蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（型號(hào)：PowerPac Basic，美國(guó)Bio?Rad）；化學(xué)發(fā)光儀（型號(hào)：3300029?7Q，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）；熒光顯微鏡（型號(hào)：BX51，日本Olympus）；切片機(jī)（型號(hào)：RM2135，HistoCore MUL?TICUT，德國(guó)Leica公司）。

1.4 方法

1.4.1 糖尿病腎病小鼠模型的構(gòu)建、分組及給藥 48只雄性小鼠，隨機(jī)選取42只小鼠，用STZ合并HFD誘導(dǎo)糖尿病引起的C57BL/6L小鼠腎損傷模型[11]。選取雄性小鼠隔夜禁食不禁水12 h（9:00 pm?9:00 am），以40 mg/kg劑量連續(xù)5 d腹腔注射給藥，第7天小鼠血糖穩(wěn)定后禁食6 h，小鼠尾靜脈取血測(cè)空腹血糖，血糖值大于11.1 mmol/L視為小鼠糖尿病模型成功[11?12]。實(shí)驗(yàn)分組情況如下：正常對(duì)照組（0.5%CMC?Na）小鼠6只，模型組（0.5%羧甲基纖維素鈉，0.5%CMC?Na）、LHRD 100 mg/kg組、LHRD 200 mg/kg組、氯沙坦（陽(yáng)性藥，30 mg/kg）組，每組各8只。研究表明，LHRD 100 mg/kg對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠具有明顯的降糖作用[8]；同時(shí)，氯沙坦30 mg/kg劑量能顯著改善2型糖尿病小鼠蛋白尿水平升高和肌酐清除率下降情況，明顯改善腎損傷，包括腎小球硬化和間質(zhì)纖維化[13]。在此基礎(chǔ)上，本研究設(shè)置給藥劑量為L(zhǎng)HRD100 mg/kg、200 mg/kg和氯沙坦30 mg/kg。分組后，每天固定時(shí)間灌胃給藥，灌胃量10μL/g，正常對(duì)照組小鼠和模型組小鼠灌胃給予0.5%CMC?Na。治療期間，所有小鼠同時(shí)給予HFD飼料，實(shí)驗(yàn)周期為12周。HFD購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，批號(hào)181106054，成分包括蛋白質(zhì)19%，脂肪18%，碳水化合物50%。

1.4.2 檢測(cè)各組小鼠腎質(zhì)量體質(zhì)量比 取材前各組小鼠禁食不禁水12 h，12 h后先記錄所有小鼠體質(zhì)量，再麻醉取材。乙醚麻醉小鼠昏迷后眼球取血，血液室溫放置30 min后常溫3 000 r/min離心15 min，吸取上層血清儲(chǔ)存于?80℃以待檢測(cè)。剪取小鼠腎臟并去除外層包膜及所有脂肪組織，記錄每只小鼠腎臟質(zhì)量。各組小鼠腎質(zhì)量體質(zhì)量比即為：各小鼠腎臟質(zhì)量（mg）÷體質(zhì)量（g）。

1.4.3 檢測(cè)各組小鼠24 h尿蛋白水平 代謝籠收集各組小鼠24 h尿液排泄量，記錄所收集的尿液體積。24 h尿蛋白檢測(cè)及計(jì)算方法按照使用說(shuō)明書（南京建成生物工程研究所）進(jìn)行。

1.4.4 檢測(cè)各組小鼠血肌酐和尿素氮水平 血肌酐和尿素氮水平的檢測(cè)，按照南京建成生物工程研究所相應(yīng)檢測(cè)試劑盒中的使用說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.4.5 小鼠腎臟HE和Masson病理染色 小鼠腎臟用福爾馬林溶液固定24 h（4℃），石蠟包埋，用切片機(jī)將腎臟切成3μm厚病理切片。按照HE、Masson試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行腎臟病理染色。后期通過(guò)顯微鏡拍片觀察組織病理?yè)p傷程度，每個(gè)樣本隨機(jī)采集6個(gè)視野。對(duì)Masson染色的陽(yáng)性面積統(tǒng)計(jì)，采用ImageJ軟件對(duì)每個(gè)樣本所采集的6個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性表達(dá)面積統(tǒng)計(jì)。

1.4.6 Westernblot檢測(cè)小鼠腎臟FN蛋白表達(dá)情況 取20 mg腎臟組織，加300μL RIPA裂解液，通過(guò)機(jī)械勻漿2 min（60 Hz/min）。高速離心機(jī)4℃，12 000 r/min離心30 min后收集上清液，按照說(shuō)明書用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。將15μL含等量蛋白（30μg）樣本通過(guò)SDS?PAGE凝膠電泳進(jìn)行蛋白條帶分離。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。室溫下，PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，用一抗（1∶1 000）在4℃下孵育過(guò)夜。第2天，用二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，PVDF膜用電化學(xué)發(fā)光顯影液結(jié)合化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)灰度，以GAPDH為內(nèi)參。

1.4.7 熒光定量PCR檢測(cè)小鼠腎臟FN基因表達(dá) 用Trizol法提取腎臟組織總RNA并使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按照SYBR Green Super Mix說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，并測(cè)定Ct值。所使用引物信息如下：FN引物序列：上游5’?GATTGGC?GACAAGTGGAG?3’，下游5’?TAGGTGAACGGG AG GACA?3’；β?actin引物序列：上游5’?ATGGAG GGGAATACAGCCC?3’，下游5’?TTCTTTGCAGCTC CTTCGTT?3’。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95℃5 min；95℃10 s，60℃15 s，72℃20 s，循環(huán)40個(gè)周期。以β?actin為內(nèi)參基因，使用2?△△Ct法計(jì)算每個(gè)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量（△Ct=目的基因Ct值?內(nèi)參基因Ct值）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均用（±s）表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LHRD對(duì)糖尿病小鼠腎臟生理和生化參數(shù)的影響

糖尿病小鼠腎臟生理和各項(xiàng)代謝生化指標(biāo)變化如表1所示，與正常對(duì)照組小鼠對(duì)比，模型組小鼠腎質(zhì)量體質(zhì)量比明顯升高（P<0.01），LHRD 100、200 mg/kg組和氯沙坦組小鼠的腎質(zhì)量體質(zhì)量比均明顯下調(diào)（P<0.01）。結(jié)果表明LHRD對(duì)糖尿病小鼠腎臟的整體肥大病變具有改善作用。與正常對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮水平顯著升高（P<0.01），表明經(jīng)STZ合并HFD誘導(dǎo)后，糖尿病小鼠腎臟功能受損，腎臟濾過(guò)率下調(diào)。與模型組相比，LHRD 100、200 mg/kg組小鼠24 h尿蛋白(P<0.05)、血肌酐和尿素氮的表達(dá)水平均明顯下降（P<0.01），氯沙坦組小鼠的24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮的表達(dá)水平也明顯下降（P<0.01）。表明LHRD可改善糖尿病引起的小鼠腎臟濾過(guò)率下調(diào)。

表1 各組糖尿病小鼠腎質(zhì)量體質(zhì)量比、24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮水平Table1 Levels of kidney weight/body weight，24 h urine protein，serum creatinineand urea nitrogen of mouse in each group(x±s)

2.2 LHRD對(duì)糖尿病小鼠腎小球肥大和腎小管損傷的影響

HE染色觀察各組小鼠腎臟組織病理學(xué)變化，HE染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠腎小球明顯肥大，部分腎小管內(nèi)皮發(fā)生脫落，小管形態(tài)不完整，腎小管明顯擴(kuò)張。此外，模型組小鼠腎小球區(qū)域及部分腎小管中細(xì)胞核數(shù)量增加、胞核排列紊亂，表明腎臟發(fā)生炎性浸潤(rùn)。與模型組相比，LHRD 100、200 mg/kg組和氯沙坦30 mg/kg組小鼠上述情況明顯減輕。結(jié)果表明LHRD對(duì)糖尿病引起的小鼠腎臟結(jié)構(gòu)病變具有保護(hù)作用，能改善糖尿病小鼠腎小球肥大、腎小管損傷情況，抑制糖尿病小鼠腎臟炎癥反應(yīng)的發(fā)生。見(jiàn)圖1。

圖1 LHRD改善糖尿病小鼠腎小球擴(kuò)張和腎小管損傷（HE染色，40×）Figure 1 LHRD improves glomerular hypertrophy and renal tubular damage in diabetic mice(HEstaining,40×)

2.3 LHRD改善糖尿病小鼠腎臟膠原沉積情況

Masson病理染色檢測(cè)各組小鼠腎臟膠原沉積結(jié)果如圖2所示。與正常對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠腎小球和腎小管間質(zhì)Masson染色呈深藍(lán)色，表明糖尿病小鼠腎臟膠原沉積明顯增加，腎纖維化加重。與模型組相比，各給藥組小鼠腎臟膠原分泌和沉積明顯被抑制。Masson陽(yáng)性表達(dá)面積統(tǒng)計(jì)結(jié)果與腎臟Masson病理染色結(jié)果相符，與正常對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠膠原陽(yáng)性表達(dá)面積顯著增加（P<0.01），LHRD 100、200 mg/kg組和氯沙坦30 mg/kg組小鼠明顯抑制膠原表達(dá)（P<0.05或P<0.01），結(jié)果見(jiàn)表2。表明LHRD能減輕STZ?HFD誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟膠原沉積，改善腎纖維化情況。

表2 各組小鼠腎臟Masson染色陽(yáng)性面積統(tǒng)計(jì)表Table 2 Statistical table of Masson staining positive area of kidney in each group(x±s)

圖2 LHRD改善糖尿病小鼠腎臟膠原沉積（Masson染色，40×）Figure 2 LHRD improves collagen deposition in kidney of diabetic mice(Masson staining,40×)

2.4 LHRD改善糖尿病小鼠腎臟FN過(guò)度表達(dá)情況

結(jié)果見(jiàn)圖3。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠腎臟中FN蛋白顯著上調(diào)，LHRD 100、200 mg/kg和氯沙坦30 mg/kg組糖尿病小鼠的FN蛋白條帶變細(xì)、顏色變淺，表明LHRD顯著抑制糖尿病小鼠腎臟過(guò)分泌FN蛋白。為進(jìn)一步觀察LHRD對(duì)FN的調(diào)控作用，提取各組小鼠腎臟中的mRNA，從基因水平檢測(cè)FN mRNA變化情況。FN mRMA檢測(cè)結(jié)果與蛋白檢測(cè)結(jié)果一致，見(jiàn)表3。與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠腎臟的FN mRNA水平顯著上調(diào)（P<0.01），LHRD 100、200 mg/kg和氯沙坦30 mg/kg組糖尿病小鼠腎臟的FN mRNA水平明顯下調(diào)（P<0.05）。結(jié)果表明LHRD能抑制糖尿病小鼠腎臟中FN的表達(dá)，進(jìn)而延緩腎臟的纖維化進(jìn)程。

表3 LHRD降低糖尿病小鼠腎臟FN mRNA表達(dá)Table 3 LHRD reduces the expression of FN mRNA in kid?ney of diabetic mice(x±s)

圖3 LHRD降低糖尿病小鼠腎臟FN蛋白表達(dá)Figure 3 LHRD reduces the expression of FN protein in kid?ney of diabetic mice

3 討論

文獻(xiàn)報(bào)道顯示，預(yù)計(jì)到2025年，全球糖尿病患者將由2007年2.46億上升至3.8億，增幅55%，其中，糖尿病發(fā)展成DN的患者將超過(guò)1億[14]。在DN形成早期若不及時(shí)加以干預(yù)，最終可發(fā)展為ESRD，ESRD患者只能進(jìn)行血液透析或換腎。據(jù)統(tǒng)計(jì)53%的ESRD確診患者僅有3年的生存時(shí)長(zhǎng)[15]。因此，DN是繼腦血管動(dòng)脈、冠狀動(dòng)脈硬化癥后最危害人體健康的疾病，開(kāi)展DN的防治工作刻不容緩。

DN起因是高血糖，并伴隨著腎臟功能逐漸下調(diào)和惡化。一般DN病理進(jìn)程起始于腎小球高灌注，導(dǎo)致濾過(guò)功能異常，繼而發(fā)生GBM增厚，系膜擴(kuò)張，腎小球過(guò)度肥大，此時(shí)出現(xiàn)微量白蛋白尿，若不加以藥物干預(yù)治療，將會(huì)出現(xiàn)持續(xù)性蛋白尿，腎功能下調(diào)，腎小球硬化、腎小管損傷，最終導(dǎo)致不可逆性腎病。中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)、多途徑以及整體調(diào)節(jié)等優(yōu)勢(shì)，具有臨床用藥開(kāi)發(fā)的潛質(zhì)。LHRD作為具有百年發(fā)展史的中華中藥復(fù)方，具備調(diào)理脾胃、化濁健運(yùn)的功能。關(guān)于LHRD的臨床前研究表明，LHRD對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠具有顯著的降糖作用[11]，提示LHRD可能具有抗DN的功效，即減輕高糖血癥引起的腎臟高濾過(guò)負(fù)荷。有研究表明，將近端腎小管上皮細(xì)胞（PTECs）暴露在高水平白蛋白會(huì)激活PTECs，從而誘導(dǎo)趨化因子和炎癥因子表達(dá)，如IL?1β、IL?6、IL?8、和CCL2等，進(jìn)而引起炎癥反應(yīng)[16?18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予LHRD 100、200 mg/kg治療的糖尿病小鼠24 h尿蛋白排泄量降低，還能減輕血肌酐和尿素氮含量，表明LHRD可能通過(guò)提高腎小管重?cái)z取功能和腎小球?yàn)V過(guò)率，進(jìn)而干預(yù)DN進(jìn)程。此外，腎臟病理染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LHRD可改善糖尿病小鼠腎臟肥大和腎小管損傷，抑制糖尿病引起的小鼠腎臟炎癥浸潤(rùn)。腎臟纖維化是DN發(fā)展至ESRD的關(guān)鍵病理進(jìn)程，促纖維化相關(guān)蛋白，如膠原、FN等的過(guò)度合成和分泌是纖維化形成的重要環(huán)節(jié)，抑制該類蛋白表達(dá)可延緩DN進(jìn)程[19]。本研究結(jié)果顯示，LHRD能明顯抑制糖尿病小鼠腎臟膠原沉積和FN的表達(dá)。

LHRD由多味中藥組成，其中甘草、肉桂、木香、八角茴香、丁香、砂仁和胡椒中均含有黃酮類成分，如丁香總黃酮對(duì)DPPH自由基有很好的清除率，且清除效果呈濃度依賴性[20]。研究表明，八角茴香中除黃酮類對(duì)DPPH自由基有較好的清除作用外，八角茴香油成分也具有較強(qiáng)的抗氧化活性[21]。此外，具有抗氧化活性成分的還有砂仁多糖、肉桂黃酮類等[22?23]。龍虎人丹各味單體藥除具有抗氧化活性外，還具有抗炎作用，而作為L(zhǎng)HRD的主要成分，甘草可以通過(guò)調(diào)控ERK/NF?κB/miR?155信號(hào)通路改善脂質(zhì)代謝紊亂并具有抗炎活性[24]。此外，其他成分如薄荷腦、丁香和木香也具有抗炎活性[25?27]。研究發(fā)現(xiàn)LHRD具有較強(qiáng)的抗氧化和抗炎癥能力[9?10]。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中高血糖、氧化應(yīng)激和炎癥是糖尿病誘發(fā)腎損傷和纖維化的關(guān)鍵因素。因此，推測(cè)LHRD可能是通過(guò)血糖控制、抗氧化和（或）抗炎癥途徑發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

綜上所述，LHRD可改善STZ合并HFD誘導(dǎo)的糖尿病小鼠腎臟功能受損情況，具體表現(xiàn)為L(zhǎng)HRD治療的糖尿病小鼠腎質(zhì)量體質(zhì)量比、24 h尿蛋白、血肌酐和尿素氮水平顯著下調(diào)。同時(shí)，LHRD明顯改善糖尿病小鼠腎小球肥大、腎小管損傷和腎臟炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象。此外，LHRD明顯抑制糖尿病小鼠腎臟中促腎臟纖維化因子、膠原和FN的表達(dá)，治療效果與氯沙坦治療效果相當(dāng)。以上研究結(jié)果均表明LHRD對(duì)糖尿病合并腎臟并發(fā)癥具有保護(hù)作用，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。