HPLC指紋圖譜結(jié)合化學計量學評價不同規(guī)格野菊花藥材質(zhì)量

施文婷，莫秋怡，彭幫貴，胡懿，鐘霞，鄧桂海，王壽富

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東佛山 528244）

野菊花是菊科植物野菊Chrysanthemum indi-cumL.的干燥頭狀花序，秋冬兩季花初開時采摘，呈類球形，直徑0.3～1.0 cm。野菊花味苦、辛，性寒，可清熱解毒、瀉火平肝，用于治療疔瘡癰腫、目赤腫痛、頭痛眩暈[1]。野菊花廣泛分布于我國的東北、華北、西北、華東和西南等地[2]?，F(xiàn)代研究表明，野菊花的主要藥效成分為黃酮類、酚酸類、多糖類和揮發(fā)油類物質(zhì)[3?6]，主要藥理作用包括抗菌、抗病毒、抗感染、免疫、神經(jīng)保護、保肝和抗腫瘤等，對心血管疾病的防治和輔助抗血小板凝聚也有一定作用[7?13]。

中藥材的質(zhì)量優(yōu)劣與其內(nèi)在的藥效成分含量高低密切相關(guān)[14]，張麗先等[15]通過建立HPLC指紋圖譜對不同產(chǎn)地的野菊花藥材進行了質(zhì)量比較；鄭繼標等[16]對野菊花藥材不同部位的蒙花苷含量進行了比較；魏民等[17]對野菊花藥材在不同采收期的蒙花苷含量進行了研究，尚未見不同規(guī)格野菊花藥材質(zhì)量比較的相關(guān)文獻報道。中藥材商品規(guī)格等級的劃分是衡量藥材質(zhì)量優(yōu)劣的重要標準，藥材的規(guī)格與其指標成分含量存在密切關(guān)聯(lián)[18?19]。2020年版《中國藥典》中以蒙花苷含量作為野菊花藥材的質(zhì)量評價指標，但野菊花富含多種活性成分，僅以蒙花苷作為評價野菊花藥材質(zhì)量的指標不夠全面。因此，本研究通過建立野菊花藥材指紋圖譜測定方法，并結(jié)合相似度評價、聚類（CA）分析、主成分（PCA）分析和方差分析等化學計量學方法對不同規(guī)格野菊花藥材的指紋圖譜信息進行分析，比較其差異性，為野菊花藥材規(guī)格等級的準確劃分和質(zhì)量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Arc型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；XP26型百萬分之一天平、ME204E型萬分之一天平（瑞士梅特勒?托利多公司）；Milli?Q Direct型超純水系統(tǒng)（德國Merck公司）；111B型二兩裝高速中藥粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司）；TC?15型套式恒溫器（海寧市新華醫(yī)療器械廠）；KQ?500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Mitutoyo型電子數(shù)顯游標卡尺（昆山科德三測量儀器有限公司）。

1.2 試藥

蒙花苷對照品（批號：111528?201911，質(zhì)量分數(shù)98.5%）、綠原酸對照品（批號：110753?202018，質(zhì)量分數(shù)96.1%）購于中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸C對照品（批號：wkq20031101，質(zhì)量分數(shù)99.21%）、新綠原酸對照品（批號：wkq18030107，質(zhì)量分數(shù)98.0%）、隱綠原酸對照品（批號：wkq19120203，質(zhì)量分數(shù)99.5%）、異綠原酸A對照品（批號：wkq20020403，質(zhì)量分數(shù)99.45%）、異綠原酸B對照品（批號：wkq17060705，質(zhì)量分數(shù)98.0%）購于四川省維克奇生物科技有限公司；液相用甲醇、磷酸、乙腈為色譜級（德國默克股份有限公司）；水為超純水，其余試劑均為分析純。

14批野菊花藥材（編號：S1?S14）經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為菊科植物野菊C.indicumL.的干燥頭狀花序，產(chǎn)地分別來自安徽、河南和湖北。根據(jù)野菊花藥材的直徑大小，將每批分為3類，以a、b、c分別表示直徑0.1～0.3 cm、直徑0.3～0.5 cm、直徑0.5～1.0 cm，14批野菊花藥材根據(jù)不同規(guī)格共分成42份樣品，分別編號為a1～a14、b1～b14、c1～c14。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[20]色譜柱：Waters XBridge C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流動相：乙腈（A）?0.1%磷酸溶液（B）梯度洗脫（0~16 min，5%~24%A；16~19 min，24%~29%A；19~29 min，29%~30%A；29~34 min，30%~32%A）；流速：1.2 mL/min；柱溫：30℃；檢測波長：326 nm；進樣量：10μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液的制備 取蒙花苷對照品適量，精密稱定，加入甲醇配制成對照品母液A；另取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C對照品適量，精密稱定，加入14%乙腈配制成對照品混合母液B；取對照品A、B液混合，置10 mL量瓶中，加入14%乙腈定容至刻度，搖勻，配制成含新綠原酸47.040 0μg/mL、綠原酸89.469 1 μg/mL、隱 綠 原 酸63.406 0μg/mL、異 綠 原 酸A 71.736 0μg/mL、異綠原酸B 65.954 0μg/mL、異綠原酸C 57.722 0μg/mL、蒙花苷56.243 5μg/mL的混合對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取野菊花藥材粉末（過三號篩）約0.3 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水50 mL，加熱回流45 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加30%甲醇100 mL，超聲處理（功率200 W，頻率50 kHz）30 min，取出，放冷，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性試驗 分別精密吸取空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液，照“2.1”項色譜條件進樣測定，色譜圖見圖1?？梢姡┰嚻吩谂c對照品溶液相應的保留時間處有相同的色譜峰，且空白溶劑無干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗HPLC色譜圖Figure 1 HPLCchromatograms of specificity test

2.3.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項供試品溶液，按“2.1”項色譜條件連續(xù)進樣6次，以10號峰蒙花苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。2.3.3 重復性試驗 取同一批野菊花粉末，精密稱定，平行稱定6份，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定。以10號峰蒙花苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%，表明方法重復性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.2.2”項供試品溶液，按“2.1”項色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，以10號峰蒙花苷為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 不同規(guī)格野菊花藥材的指紋圖譜

2.4.1 不同規(guī)格野菊花藥材指紋圖譜的建立 分別取14批不同直徑野菊花藥材（樣品a1~a14、b1~b14、c1~c14），按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。不同直徑野菊花的樣品數(shù)據(jù)依次采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012）進行評價，分別生成4個直徑HPLC對照圖譜，見圖2。確定了10個共有特征峰，通過對照品指認，確定了1號峰為新綠原酸，2號峰為綠原酸，3號峰為隱綠原酸，6號峰為異綠原酸B，7號峰為異綠原酸A，8號峰為異綠原酸C，10號峰為蒙花苷。

圖2 不同規(guī)格野菊花藥材共有對照指紋圖譜Figure 2 Common control fingerprints of different specifica?tions of C.indicum

2.4.2 不同規(guī)格野菊花藥材相似度評價 計算樣品a1~a14、b1~b14、c1~c14生成的對照指紋圖譜與未劃分規(guī)格野菊花藥材生成的對照指紋圖譜的相似度，結(jié)果見表1。可見，各批次藥材的相似度均>0.90，表明相同直徑范圍的不同批次野菊花具有較高的相似度。

表1 不同規(guī)格野菊花藥材指紋圖譜的相似度Table 1 The similarity of fingerprints of different specifications of C.indicum

2.4.3 不同規(guī)格野菊花藥材特征峰比較 以野菊花藥材規(guī)格為橫坐標，該規(guī)格下所有樣品峰1?峰10的“峰面積/取樣量”均值為縱坐標，對指紋圖譜中的10個特征峰隨規(guī)格的變化趨勢進行分析，其中a為直徑0.1～0.3 cm，b為直徑0.3～0.5 cm，c為直徑0.5～1.0 cm，d為未劃分規(guī)格的野菊花藥材。變化規(guī)律見圖3?？梢?，各特征峰的“峰面積/取樣量”隨野菊花直徑的增加呈遞減趨勢，且未劃分規(guī)格的藥材d的規(guī)格可能大多集中在0.3~0.5 cm。

圖3 不同規(guī)格野菊花藥材特征峰比較Figure 3 Comparison of characteristic peaks of different specifications of C.indicum

2.4.4 聚類分析 聚類分析是對樣品或指標成分進行分類的一種多變量統(tǒng)計技術(shù)，也是應用范圍最為廣泛的多元統(tǒng)計方法之一[21]。采用SPSS 20.0軟件對各特征峰的“峰面積/取樣量”進行聚類分析，建立14批野菊花不同直徑大小的聚類分析樹狀圖，結(jié)果見圖4。可見，不同規(guī)格野菊花共42個樣本聚為2類，由于不同批次間樣品存在一定差異，除去個別樣品（a4和a6），b與c聚為I類，a聚為Ⅱ類。綜上所述，根據(jù)14批不同規(guī)格野菊花樣品指紋圖譜聚類分析結(jié)果，基本可將直徑0.1~0.3 cm（a）與直徑0.3~1.0 cm（b和c）兩種規(guī)格的野菊花區(qū)分開。

圖4 42批野菊花樣品的聚類分析（CA）樹狀圖Figure 4 Cluster analysis(CA)dendrogram of 42 batches of C.indicum

2.4.5 主成分分析 主成分分析是一種廣泛應用于多學科的多元統(tǒng)計方法，可用于簡化數(shù)據(jù)，快速實現(xiàn)對數(shù)據(jù)的可視化識別[22]。采用SPSS 20.0軟件對10個共有峰的“峰面積/取樣量”進行因子分析，根據(jù)主成分的提取原則，取特征值大于1對應的成分作為提取主成分[23]，結(jié)果見表2、表3?？梢姡?個主成分累積貢獻率為96.262%，表明提取的2個主成分能基本反映全部指標的信息。主成分1的特征值為9.129，方差貢獻率為82.989%，載荷較高的峰有新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C，表明這6個峰主要反映主成分1的信息；主成分2的特征值為1.460，方差貢獻率為13.273%，載荷較高的峰有峰4、峰5、峰9及蒙花苷，表明這4個峰主要反映主成分2的信息。上述對野菊花藥材指紋圖譜差異貢獻較大的成分，可能是影響野菊花藥材質(zhì)量的關(guān)鍵成分。

表2 主成分分析Table 2 Principal component analysis

表3 主成分因子載荷矩陣Table 3 Loading matrix of principal component factor

2.4.6 方差分析 采用SPSS 20.0軟件對42份野菊花樣本各特征峰的“峰面積/取樣量”進行方差分析，并采用字母標記法進行顯著性分析，結(jié)果見表4?？梢?，特征峰1（新綠原酸）、峰2（綠原酸）、峰3（隱綠原酸）、峰6（異綠原酸B）、峰7（異綠原酸A）、峰8（異綠原酸C）、峰9、峰10（蒙花苷）在0.1~0.3 cm、0.3~0.5 cm、0.5~1.0 cm直徑范圍間差異均有統(tǒng)計學意義；特征峰4在0.1~0.3 cm與0.5~1.0 cm直徑范圍間差異有統(tǒng)計學意義；特征峰5在0.1~0.3 cm與0.3~1.0 cm直徑范圍間差異有統(tǒng)計學意義，表明不同直徑的野菊花在成分含量間存在較大差異。

表4 不同規(guī)格野菊花藥材方差分析比較結(jié)果（峰面積/取樣量,mAu·min?1·g?1）Table 4 Comparison results of variance analysis of different specifications of C.indicum

3 討論

野菊花中的黃酮類和酚酸類物質(zhì)均具有清熱解毒的藥理活性，因此僅以蒙花苷的含量為指標不足以準確、全面地評價野菊花藥材質(zhì)量。中藥指紋圖譜在一定程度上能基本反映中藥材全貌，實現(xiàn)對中藥材內(nèi)在質(zhì)量的綜合評價[24]。目前，采用HPLC建立野菊花藥材的指紋圖譜分析方法研究較少，本文探討了野菊花外觀性狀中直徑大小與內(nèi)在成分之間的關(guān)系，通過建立指紋圖譜，確定了野菊花藥材的10個共有峰，通過與對照品色譜峰比對，能夠確定7個共有峰的化學成分。

從本文的指紋圖譜比較結(jié)果可以看出，各特征峰的峰面積/取樣量比值與野菊花藥材直徑成反比，表明野菊花藥材的直徑越小，各特征成分的含量越高。2020年版《中國藥典》中規(guī)定野菊花藥材的直徑范圍為0.3~1.0 cm，實際在市場流通的貨源中，不乏直徑小于0.3 cm者，這部分藥材質(zhì)量理應更上一層，但混雜在大直徑規(guī)格的藥材中，不利于其臨床療效的發(fā)揮。因此針對野菊花藥材規(guī)格的劃分，可以考慮增加小于0.3 cm的規(guī)格。當然，直徑越小意味著越早采摘，產(chǎn)量可能也會相對較小，但作為商品，如能進行針對性的市場開發(fā)，仍應具有較好的市場前景。

聚類分析可將野菊花藥材大致分為2種規(guī)格：直徑0.1~0.3 cm與直徑0.3~1.0 cm，并且特征峰的方差分析結(jié)果均具有統(tǒng)計學意義；主成分分析結(jié)果表明，酚酸類成分集中在第一主成分上，且占有較高的載荷，表明酚酸類成分可代表所匹配大部分的色譜峰。因此，HPLC指紋圖譜結(jié)合化學計量學可有效評價不同規(guī)格野菊花藥材質(zhì)量，反映各成分間的含量差異，對野菊花藥材的規(guī)格等級的劃分、質(zhì)量評價和臨床使用具有一定的參考意義。