10?羥基?α?癸烯酸對氧化應(yīng)激損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用

黃瓊，馬心超，袁義強(qiáng)

（河南省胸科醫(yī)院，河南鄭州 450000）

近年來，心血管疾病發(fā)病呈年輕化趨勢，已經(jīng)嚴(yán)重危害人類的健康，不但給患者帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還給人類的健康帶來了巨大的威脅[1]。國家心血管病中心組織編撰的《中國心血管病報告2018》統(tǒng)計我國心腦血管病現(xiàn)患人數(shù)2.9億，其中腦卒中1 300萬，冠心病1 100萬，肺源性心臟病500萬，心力衰竭450萬，風(fēng)濕性心臟病250萬，先天性心臟病200萬，高血壓2.7億[2]。動脈粥樣硬化和高血壓等多種心血管疾病的發(fā)生是因為血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷導(dǎo)致的，而氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡可直接造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷現(xiàn)象的出現(xiàn)，也就是說氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡會直接導(dǎo)致多種心血管疾病的發(fā)生[3]。10?羥基?α?癸烯酸（10?hydroxy?2?decenoic acid，10?HDA）是一種在蜂王漿中發(fā)現(xiàn)的一種獨特的脂肪酸，由于其他蜂產(chǎn)品不含10?HDA，所以其存在可以作為區(qū)分蜂王漿與其他蜂產(chǎn)品的一個指標(biāo)。10?HDA具有抗腫瘤、促進(jìn)膠原蛋白、免疫調(diào)節(jié)、抗菌和抗炭疽等多種生理活性[4]。有研究報道指出，10?HDA在人結(jié)腸癌細(xì)胞中具有殺菌和抗炎活性；同時10?HDA還具有治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛力，能夠通過下調(diào)PI3K?AKT通路來抑制類風(fēng)濕性滑膜細(xì)胞增殖[5]。同時10?HAD因其獨特的分子結(jié)構(gòu)，具有抗氧化活性，清除機(jī)體中多余的氧化自由基的功效[6]。本研究在建立體外內(nèi)皮細(xì)胞過氧化氫（H2O2）損傷的基礎(chǔ)上，探討10?HAD對氧化所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響，并進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株EVC304購自中國科學(xué)院細(xì)胞研究所。

1.2 藥品與試劑

10?HDA（CAS：14113?05?4，貨號：YS014080）購自湖北廣奧生物科技有限公司；H2O2溶液（30%，貨號：216763）和BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：AR0146）購自上海鈺博生物科技有限公司；FBS胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶和青/鏈霉素（P/S）購自北京泰新生物科技有限公司；實驗所用一抗抗體均購自上海愛必信生物科技有限公司；HRP辣根過氧化物酶標(biāo)記的IG二抗購自中國北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CCK?8試劑盒（貨號：LHK900）購自上海宇淳生物科技有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒（貨號：556547）、一氧化氮（NO）試劑盒（貨號：584159）、丙二醛（MDA）試劑盒（貨號：358418）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（貨號：574158）和ECL發(fā)光液（貨號：325874）購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3 細(xì)胞系與細(xì)胞培養(yǎng)

將含10%FBS，1%P/S的DMEM培養(yǎng)液加入EVC?304細(xì)胞，并將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞滿度為70%~80%左右，利用胰蛋白酶消化離心后傳代。

1.4 實驗分組及H2O2損傷模型的建立

取對數(shù)生長期的EVC?304細(xì)胞經(jīng)消化制成細(xì)胞懸液，以1×105個/孔接種于96孔板中，隨機(jī)分為空白對照組（不作任何處理）、H2O2模型組（100 μmol/L H2O2）和10?HAD低、中、高劑量組（10、30、50 μmol/L），各組培養(yǎng)條件保持完全一致，模型組H2O2濃度為100μmol/L作為造模濃度，10?HAD低、中、高劑量組分別用10?HDA 10、30、50μmol/L+H2O2100μmol/L。

1.5 CCK?8實驗檢測細(xì)胞增殖抑制率

按照“1.4”的方法建立H2O2損傷模型并加藥處理24 h后，將10μL CCK?8試劑加入孔中并在37℃下孵育1.5 h。隨后，通過酶標(biāo)儀在490 nm處測量吸光度（A），并計算細(xì)胞存活率。增殖抑制率=｛1?（實驗組A空白調(diào)零組A/對照組A?空白調(diào)零組A）｝×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測10?HAD對內(nèi)皮細(xì)胞活性氧（ROS）的影響

按照“1.4”的方法建立H2O2損傷模型并加藥處理24 h后，將細(xì)胞收集到Tube管中，離心并棄去上清，加PBS重懸并洗滌1次，隨后加入5μL的DCFH?DA，隨后置于37℃條件下避光孵育30 min，離心重懸，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

1.7 ELISA法測定細(xì)胞中NO、MDA的含量和SOD的活性

前期處理同“1.4”，模型建立后藥物處理1 d，隨后用PBS洗滌2次，分別將各組細(xì)胞裂解液收集，高速離心，保留離心后的上清液，按照試劑盒說明書，分別檢測相同體積細(xì)胞上清液中NO、MDA的含量和SOD的活性。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測10?HAD對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

按照“1.4”的方法建立H2O2損傷模型并加藥處理不同時間（3、6、12、24 h）后，用胰酶消化，離心，收集細(xì)胞并進(jìn)行Annexin V?FITC和PI染色，染色方法參照試劑盒，最后于流式細(xì)胞儀上檢測分析。

1.9 Western blot檢測蛋白變化情況

前期處理同“1.4”，到處理時間后，收集各組EVC?304細(xì)胞，以PBS洗2次，用PIPA細(xì)胞裂解液置冰浴裂解，4℃離心機(jī)中以12 000 r/min離心30 min，收集上清。利用BCA試劑盒定量，沸水浴變性5 min，SDS?PAGE分離目標(biāo)蛋白，上樣量為20μL。轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST漂洗后，5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，孵一抗抗過夜，TBST漂洗5次（每次5 min），加入二抗搖床孵育1 h，TBST漂洗5次（每次5 min），用ECL顯影液顯色，最后顯影拍照，并用Image J軟件對圖片進(jìn)行分析。

1.1 0統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 10?HAD對H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷細(xì)胞活力的影響

結(jié)果如表1所示，在24 h，與空白對照組相比，模型組細(xì)胞增殖率顯著下降（P<0.01），說明實驗造模成功；與模型組相比，10?HAD組細(xì)胞增殖率均顯著提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），且10?HDA濃度越高，效果越顯著，呈劑量依賴性，高濃度的10?HDA（50μmol/L）促進(jìn)細(xì)胞增殖作用最顯著（P<0.01）。

表1 10?HAD對H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷細(xì)胞活力的影響Table 1 Effect of 10?HDA on the viability of vascular endo?thelial cells injured by H2O2

2.2 10?HAD對H2O2損傷的EVC?304細(xì)胞中ROS水平的影響

如圖1所示，流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果示，與對照組比較，模型組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明H2O2可誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS升高；與模型組比較，10?HAD組細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），表明10?HAD能減少H2O2誘導(dǎo)胞內(nèi)ROS的生成。

圖1 10?HAD對H2O2損傷的EVC?304細(xì)胞中ROS水平的影響Figure 1 Effect of 10?HDA on the apoptosis of EVC?304 cells induced by H2O2

2.3 10?HAD對H2O2損傷的EVC?304細(xì)胞上清液中NO、MDA的含量和SOD活性的影響

結(jié)果如表2所示，與空白對照組相比，模型組中EVC?304細(xì)胞上清液中NO、SOD活性明顯下降，而MDA的含量大幅度升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，10?HAD組能提高細(xì)胞上清液中的NO含量和SOD活性，下調(diào)MDA活性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

表2 10?HAD對H2O2損傷的EVC?304細(xì)胞上清液中NO、MDA的含量和SOD活性的影響Table 2 Effect of 10?HDA on the content of NO，MDA and the activity of SOD in the supernatant of EVC?304 cells injured by H2O2（x±s）

2.4 10?HAD對H2O2損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率的影響

如圖2所示，與空白對照組相比，模型組中血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在10?HAD處理組中，隨著10?HAD處理濃度的增加，H2O2損傷后內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)濃度依賴性的降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。說明10?HAD能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。并進(jìn)一步檢測了細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量變化情況，Bax的表達(dá)量和Bax/Bcl?2的比值顯著降低，Bcl?2的表達(dá)量顯著升高，且10?HAD濃度越高，效果越明顯，呈劑量依賴性，10?HAD組與模型組相比，cleaved Caspase?3的表達(dá)含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

圖2 10?HAD對H2O2損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Effect of 10?HDA on the apoptosis of EVC?304 cells injured by H2O2

2.5 10?HAD對Nrf2、HO?1信號通路蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，對照組中Nrf2、HO?1蛋白呈少量表達(dá)，模型組Nrf2和HO?1蛋白表達(dá)與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。10?HAD組明顯上調(diào)Nrf2、HO?1蛋白表達(dá)，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 10?HAD上調(diào)H2O2損傷后血管內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2/HO?1信號通路蛋白的表達(dá)Figure 3 Effect of 10?HDA on the expression of Nrf2/HO?1 signaling pathway proteins in vascular endothelial cells after H2O2 injury

3 討論

完整的血管內(nèi)皮系統(tǒng)是心血管系統(tǒng)維持穩(wěn)態(tài)的基石，血管內(nèi)皮細(xì)胞的緊密結(jié)合保證了血管壁通透性完整，同時也使血管舒張和收縮處在一個平衡狀態(tài)，參與各組織器官營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)與廢物清理等多項生理進(jìn)程，內(nèi)皮細(xì)胞損傷與功能失?？蓪?dǎo)致多種疾病的發(fā)生。氧化應(yīng)激是最常見的內(nèi)皮損傷因素，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)能夠很大程度上降低細(xì)胞損傷程度，而近年來的研究都證實天然來源的物質(zhì)可以在降低氧化應(yīng)激損傷過程中起到較強(qiáng)的作用，被公認(rèn)為是血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的可靠研究方向[7?8]。

本研究利用100μmol/LH2O2損傷EVC?304細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型進(jìn)行研究。SOD和MDA是氧化應(yīng)激反應(yīng)的直接表現(xiàn)因素，MDA是脂質(zhì)過氧化物，其過量會對細(xì)胞產(chǎn)生損傷作用；SOD是體內(nèi)清除自由基的抗氧化酶，不但能夠?qū)⒆杂苫膺€抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；NO是由內(nèi)皮細(xì)胞的線粒體產(chǎn)生的“信使分子”，改善機(jī)體的代謝，在維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)以及免受傷害方面作用很大。CCK?8實驗結(jié)果和ELISA實驗結(jié)果表明，H2O2引起的氧化應(yīng)激損傷使EVC?304細(xì)胞的存活率顯著降低，ROS水平升高，NO、SOD活性明顯下降，而MDA的含量大幅度升高。在加入10?HAD之后可顯著提高H2O2損傷的EVC?304細(xì)胞的存活率，降低細(xì)胞ROS和MDA水平，提高細(xì)胞上清液中的NO含量和SOD活性，表明10?HDA可以減輕EVC304的氧化應(yīng)激損傷，增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞由基因調(diào)控的細(xì)胞死亡，是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要生理進(jìn)程，與這一進(jìn)程關(guān)系最為密切的包括Bcl?2、Caspase兩大家族[9]。通過Annexin V?FITC配合PI進(jìn)行雙染，并利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，反映細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。本實驗發(fā)現(xiàn)，H2O2損傷EVC?304細(xì)胞后，細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡數(shù)目均大幅增大。而10?HAD組中凋亡細(xì)胞隨著10?HDA處理濃度的升高而減少，說明10?HDA具有明顯抵抗H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。在蛋白分子水平的檢測中，10?HDA能夠抑制H2O2誘導(dǎo)的Caspase?3蛋白的活化，增加抗凋亡蛋白Bcl?2的表達(dá)，降低Bax和Bax/Bcl?2的比值，表明10?HDA抑制H2O2引起的線粒體途徑細(xì)胞凋亡。

Nrf2/ARE是機(jī)體內(nèi)重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，Nrf2即核因子E2相關(guān)因子2，是氧化應(yīng)激基本表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子；ARE是抗氧化反應(yīng)元件，是一個特異的DNA?啟動子結(jié)合序列，當(dāng)機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生后，Nrf2受到多種蛋白的調(diào)控轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與ARE結(jié)合后直接調(diào)控HO?1啟動轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮抗氧化作用[10?11]。本實驗對這兩條信號通路進(jìn)行了檢測，從實驗結(jié)果中可以看出，與模型組相比，10?HAD組Nrf2/ARE抗氧化信號通路中關(guān)鍵分子Nrf2及HO?1表達(dá)增多，因此推測10?HDA能夠調(diào)節(jié)Nrf2/ARE信號通路來發(fā)揮抗氧化效應(yīng)。

本實驗證明了10?HAD可以提高損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖率，增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，抑制細(xì)胞凋亡，并激活Nrf2/ARE抗氧化信號通路。為研究10?HAD在保護(hù)心血管疾病中的應(yīng)用提供了一定的實驗基礎(chǔ)。