RRx?001介導(dǎo)Nrf2減弱DOX誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷

周玉玲，曹德康，李震宇，蘇建忠，王欣，潘歡

（1.中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)特色醫(yī)學(xué)中心突發(fā)公共衛(wèi)生事件醫(yī)學(xué)防治研究所，北京 102613；2.嘉興市第一醫(yī)院，浙江嘉興 314000）

阿霉素（doxorubicin，DOX）和柔紅霉素（dauno?rubicin，DNR）屬于蒽環(huán)類抗生素，在臨床上廣泛應(yīng)用于多種惡性腫瘤的治療，包括白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、膀胱癌和卵巢癌[1]。然而由于阿霉素高累積劑量（>450~550 mg/m2）所引起的心肌毒性，這大大限制了其臨床應(yīng)用[2]。這種阿霉素治療而導(dǎo)致的醫(yī)源性并發(fā)癥（心臟損傷）將給患者的生活質(zhì)量帶來(lái)極大的影響，同時(shí)，由于多數(shù)腫瘤患者運(yùn)動(dòng)的缺乏反而可能加速心臟衰竭的發(fā)生[3]。

RRx?001是一種無(wú)毒、抗腫瘤耐藥的抗腫瘤藥物[4]，目前已進(jìn)入Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)[5]。RRx?001不僅能增加腫瘤放療和化療的敏感性[6?8]，且對(duì)正常組織具有放射保護(hù)作用[9]，這可能和RRx?001選擇性的調(diào)控活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的釋放，特別是一氧化氮（NO）的釋放有關(guān)[10?11]。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞能夠產(chǎn)生更多的ROS，這就迫使機(jī)體更加依賴抗氧化物質(zhì)以維持正常生存，例如還原型谷胱甘肽（GSH）[12]，因此，當(dāng)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)損傷時(shí)細(xì)胞更易受到損傷。相比之下，由于正常細(xì)胞的基礎(chǔ)ROS水平較低且抗氧化能力高，正常細(xì)胞能夠承受更高水平的氧化應(yīng)激。缺血再灌注造成的ROS大量釋放是心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的主要原因。已有文獻(xiàn)報(bào)道，倉(cāng)鼠心臟缺血再灌注前使用RRx?001預(yù)處理可提高心肌細(xì)胞活力，減少心肌細(xì)胞凋亡[13]。核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）是細(xì)胞調(diào)節(jié)抗氧化反應(yīng)的一種重要轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)抗氧化反應(yīng)元件（ARE）調(diào)控抗化基因的表達(dá)，增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抗性[14]。有研究報(bào)道，缺乏Nrf2可加重阿霉素所致心肌毒性和損傷[15]，但在心肌細(xì)胞中RRx?001是否影響Nrf2表達(dá)尚未報(bào)道。

由于約有10%的患者接受了阿霉素或其衍生物的治療，將有可能發(fā)展為心臟并發(fā)癥[16]，且現(xiàn)有的心臟保護(hù)措施不足，迫切需要尋找替代治療策略。Oronsky等[17]最近的研究表明，使用RRx?001預(yù)處理可改善阿霉素急性處理誘導(dǎo)的小鼠心肌功能損傷，但具體機(jī)制尚不清楚。本文將從細(xì)胞水平上探討RRx?001對(duì)于阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性是否具有心肌保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和儀器

H9c2細(xì)胞購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。阿霉素（doxorubicin，DOX）和RRx?001購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；ML385購(gòu)自MedChem?Express公司；Nrf2和GAPDH抗體購(gòu)自Abcam公司；熒光二抗購(gòu)自Li?cor公司；MTT試劑盒、Dihy?droethidium超氧化物陰離子熒光探針試劑盒、總SOD活性檢測(cè)試劑盒（NBT法）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH?Px）檢測(cè)試劑盒、丙二醛（MDA）檢測(cè)試劑盒和青鏈霉素混合液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；SDS?PAGE凝膠試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物科技有限公司；DMSO溶液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自HyClone公司。酶標(biāo)儀（ELX800，德國(guó)BIOTEK公司）；凝膠電泳儀（1658001/1645050/1703935，美國(guó)Bio?Rad公司）；超凈工作臺(tái)（B3，蘇州凈化工程設(shè)備有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)箱（3311，美國(guó)Thermo Fisher公司）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（GeneGnome XRQ，英國(guó)Syngene公司）；細(xì)胞破碎儀（Q125，德國(guó)Q SONIC公司）；渦旋振蕩器（88880018，美國(guó)Thermo Fisher公司）；離心機(jī)（Allegra x?12R，美國(guó)貝克曼公司）；熒光顯微鏡（DP80/BX43，美國(guó)奧林巴斯公司）。

1.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力

將H9c2細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移至96孔板中，細(xì)胞計(jì)數(shù)，稀釋至每孔約5×103個(gè)細(xì)胞。待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁后，給予相應(yīng)藥物處理，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，棄去上層培養(yǎng)基，并加入100μL純DMEM培養(yǎng)基配置的MTT溶液（500μg/mL）。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置4 h。棄去上層MTT溶液，加入150μL DMSO，并混合均勻。使用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)定吸光度A值，以對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化，檢測(cè)細(xì)胞活力變化。

1.3 Western blot檢測(cè)Nrf2蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞處理完畢后，加入50~100μL細(xì)胞裂解液（RIPA∶磷酸酶抑制劑:蛋白酶抑制劑=100∶10∶1），置于冰上裂解15 min，使用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移至1.5 mLEP管中。使用細(xì)胞破碎儀30%頻率破碎細(xì)胞5次，每次3 s。之后使用渦旋儀渦旋振蕩3次。4℃離心機(jī)13 500 r/min離心15 min。將上層透明液體轉(zhuǎn)移至新的1.5 mLEP管中，并使用BCA試劑盒用酶標(biāo)儀在562 nm處測(cè)定吸光度值，計(jì)算蛋白濃度。之后加入1/5體積的6×Loading Buffer緩沖液，100℃煮5 min后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用配膠試劑盒配置適宜濃度的SDS?PAGE凝膠，在每個(gè)加樣孔中加入適宜體積的蛋白混合樣品，在100 V恒壓下進(jìn)行凝膠電泳，待藍(lán)色印跡到達(dá)凝膠底側(cè)時(shí)停止電泳。取出凝膠，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1 h。取出NC膜，放置于PBS緩沖液配制的5%脫脂奶粉溶液，封閉1 h。封閉完畢后，使用3%BSA配制一抗（1:1 000），于4℃冰箱中過(guò)夜。過(guò)夜后，PBST溶液洗滌，使用5%脫脂牛奶配制二抗孵育液（1:10 000），置于搖床上室溫孵育1 h，此過(guò)程中注意避光。二抗孵育完畢后，在避光條件下使用PBST溶液洗滌4次。使用ECL化學(xué)發(fā)光法掃描蛋白條帶，并統(tǒng)計(jì)蛋白條帶灰度值，以對(duì)照組做標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 ROS的檢測(cè)

使用Dihydroethidium超氧化物陰離子熒光探針檢測(cè)細(xì)胞中ROS的變化。將處理后的細(xì)胞消化備用。使用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋dihydroethidium（1∶1 000），終濃度為10μmol/L。將收集好的細(xì)胞懸浮于稀釋好的dihydroethidium，細(xì)胞密度為1.0×106~2.0×107。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15 min。用熒光顯微鏡于535 nm激發(fā)波長(zhǎng)處觀察熒光強(qiáng)度并拍照，并使用Image Pro Plus軟件統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度。

1.5 SOD、GSH?Px和MDA的檢測(cè)

細(xì)胞中SOD、GSH?Px和MDA水平分別使用總SOD活性檢測(cè)試劑盒（NBT法）、GSH?Px檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以±s表示，使用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)及圖表繪制。兩組間的比較使用t配對(duì)/非配對(duì)檢驗(yàn)，多組間的使用方差分析（one?way ANOVA followed by Newman?Keules）。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RRx?001對(duì)阿霉素誘導(dǎo)心肌細(xì)胞毒性的影響

培養(yǎng)H9c2大鼠心肌細(xì)胞，給予0、0.05、0.1、0.5、1、5μmol的阿霉素12 h誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，圖1結(jié)果顯示阿霉素劑量依賴性地抑制細(xì)胞活力，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷。而使用1μmol/L的RRx?001預(yù)處理H9c2細(xì)胞1 h后再加入阿霉素處理細(xì)胞，相比于阿霉素單獨(dú)處理，RRx?001可減弱阿霉素（0.1、0.5、1、5μmol）誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性，說(shuō)明RRx?001對(duì)于阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性具有心肌保護(hù)作用。

圖1 RRx?001減弱阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性Figure 1 RRX?001 attenuates DOX?induced cardiac cytotox?icity(n=6)

2.2 RRx?001對(duì)Nrf2表達(dá)的影響

圖2 A中Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，阿霉素（5μmol/L）處理H9c2細(xì)胞12 h后顯著降低細(xì)胞中Nrf2的蛋白表達(dá)，而使用RRx?001（1μmol/L）預(yù)處理1 h后，阿霉素（5μmol/L）誘導(dǎo)的Nrf2蛋白表達(dá)下降被顯著逆轉(zhuǎn)，且該逆轉(zhuǎn)作用可被Nrf2特異性抑制劑ML385（1μmol/L）抑制。同時(shí)圖2B中MTT結(jié)果顯示RRx?001（1μmol/L）可顯著逆轉(zhuǎn)阿霉素（5μmol/L）所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，但與RRx?001同時(shí)給予Nrf2特異性抑制劑ML385（1μmol/L）時(shí)，RRx?001（1μmol/L）的心肌保護(hù)作用被取消，說(shuō)明RRx?001通過(guò)激活Nrf2發(fā)揮心肌保護(hù)作用，減弱阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性作用。

圖2 RRx?001對(duì)Nrf2的表達(dá)影響Figure 2 Effect of RRx?001 on the expression of NRF2(n=6)

2.3 RRx?001對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的ROS、SOD、GSH?px及MDA變化的影響

圖3 結(jié)果顯示，阿霉素（5μmol/L）可顯著增加H9c2細(xì)胞中ROS的生成，而使用RRx?001（1μmol）預(yù)處理后，和阿霉素單獨(dú)處理相比，阿霉素誘導(dǎo)的ROS的增多被顯著抑制。同時(shí)，阿霉素（5μmol/L）處理H9c2細(xì)胞12 h后，細(xì)胞內(nèi)抗氧化因子SOD、GSH?px水平下調(diào)，MDA水平上調(diào)，給予RRx?001（1μmol/L）預(yù)處理1 h后，和阿霉素（5μmol/L）組相比，H9c2細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH?px水平顯著上調(diào)，MDA水平被抑制（表1）。基于上述結(jié)果，RRx?001可通過(guò)上調(diào)Nrf2表達(dá)，增強(qiáng)H9c2細(xì)胞的抗氧化能力，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH?Px水平，抑制細(xì)胞內(nèi)MDA水平，控制ROS的過(guò)量生成，進(jìn)而減弱阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

表1 RRx?001對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激因子表達(dá)變化的影響Table 1 Effect of RRX?001 on the expression of oxidative stress factors induced by DOX(n=6)

3 討論

腫瘤依然是世界上威脅人類健康的主要疾病，而阿霉素作為一種多腫瘤抗癌藥物，由于其副作用導(dǎo)致其臨床應(yīng)用大大受限。右雷佐生作為臨床上用于減輕或減少蒽環(huán)類抗生素（如阿霉素）化療引起的心肌毒性的一種抗腫瘤輔助藥品，由于其可能削弱阿霉素的抗腫瘤活性也被限制了應(yīng)用[18]。文獻(xiàn)報(bào)道，腎素?血管緊張素系統(tǒng)的紊亂可能是蒽環(huán)類抗生素引起心臟毒性的原因，但血管緊張素受體抑制劑和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑已知的抗氧化特性，在理論上也可以抵消對(duì)腫瘤細(xì)胞的化學(xué)治療作用[19]。相比之下，RRx?001作為一個(gè)抑制腫瘤耐藥，且已經(jīng)進(jìn)入Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)的抗腫瘤藥物，不僅對(duì)正常細(xì)胞或組織具有保護(hù)作用，還可選擇性地殺死腫瘤細(xì)胞，具有巨大的臨床價(jià)值。本研究結(jié)果表明，RRx?001可以減弱阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性，其中Nrf2參與了RRx?001的心肌保護(hù)作用，RRx?001可逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導(dǎo)的Nrf2表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)SOD和GSH?Px抗氧化因子的生成，抑制MDA的水平，調(diào)控ROS的過(guò)量生成。同時(shí)還可以看出，將RRx?001運(yùn)用到癌癥患者的新輔助治療時(shí)具有2個(gè)優(yōu)勢(shì)，RRx?001不僅可以減輕阿霉素治療引起的心臟毒性，還能加強(qiáng)阿霉素對(duì)于腫瘤的殺傷作用。

Nrf2作為一類重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)下游抗氧化蛋白的表達(dá)以抵抗氧化應(yīng)激損傷。在正常條件下，Nrf2與Keap1結(jié)合，存在于細(xì)胞之中，發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，Keap1的半胱氨酸殘基被修飾，改變構(gòu)象導(dǎo)致Nrf2釋放出來(lái)，進(jìn)入細(xì)胞核中，與ARE結(jié)合后，促進(jìn)下游抗氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄，例如醌氧化還原酶1、血紅素加氧酶1和谷胱甘肽S?轉(zhuǎn)移酶等。本研究結(jié)果顯示，阿霉素處理后的H9c2細(xì)胞中Nrf2的表達(dá)下降，RRx?001可逆轉(zhuǎn)阿霉素誘導(dǎo)的Nrf2表達(dá)下降；同時(shí)阿霉素可引起H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激增多，ROS過(guò)量生成，表現(xiàn)為SOD、GSH?Px活性降低，MDA水平增高，而給予RRx?001預(yù)處理后，抗氧化能力增強(qiáng)，ROS水平被抑制，說(shuō)明RRx?001通過(guò)激活Nrf2，降低了阿霉素誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷和氧化應(yīng)激的作用。

綜上所述，RRx?001可通過(guò)增加H9c2細(xì)胞中Nrf2表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，減弱阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，這對(duì)于研究阿霉素心肌細(xì)胞損傷的治療及作用機(jī)制具有重要意義。