異甜菊醇衍生物的合成及其抗氧化應(yīng)激研究

柯晴瑾，羅利萍，張曉鋒，譚文

（1.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.乳源瑤族自治縣應(yīng)急管理局，廣東韶關(guān) 512700）

異甜菊醇（isosteviol）是從甜菊糖酸酸水解中獲得的一種貝葉烷型四環(huán)二萜，具有很多生物活性[1]。研究顯示，異甜菊醇在缺血再灌注心臟病中具有心臟保護(hù)作用，并能減少心律不齊[2?4]。異甜菊醇結(jié)構(gòu)中的C15、C16羰基和C19羧基是3個良好的結(jié)構(gòu)修飾位點(diǎn)，經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾和改造得到的異甜菊醇衍生物表現(xiàn)出良好的生物活性：WU等[5?6]合成了一系列含羥基、羥甲基和含氮雜環(huán)的異甜菊醇衍生物，研究結(jié)果顯示吲哚衍生物具有抑制α?葡糖苷酶活性；HUANG等[7]合成了一系列具有C4?酰胺取代基的異甜菊醇衍生物，發(fā)現(xiàn)所測化合物具有有效的HBV活性；ZHU等[8]合成了雜環(huán)橋聯(lián)的碳硫酰胺類異甜菊醇衍生物，并證明了引入碳硫酰胺基取代的吡唑和異惡唑烷雜環(huán)片段可增強(qiáng)異甜菊醇的細(xì)胞毒活性；WANG等[9]制備了一系列含有二萜骨架和一氧化氮（NO）供體的異甜菊醇衍生物，篩選出了對HepG2及B16F10細(xì)胞具有抗增殖活性的衍生物；SHI等[10]在異甜菊醇結(jié)構(gòu)上引入三唑雜環(huán)合成了一系列衍生物，在體外抗凝研究中2個衍生物顯示出抗凝活性。

本課題組前期研究了異甜菊醇在不同的心肌細(xì)胞損傷模型的保護(hù)作用發(fā)現(xiàn)，異甜菊醇可通過調(diào)節(jié)線粒體分裂蛋白恢復(fù)線粒體功能，降低細(xì)胞活性氧生成，抑制細(xì)胞凋亡，起到抗氧化應(yīng)激作用[11?14]；另外，通過串聯(lián)Cannizzaro歧化/Aldol羥醛縮合反應(yīng)在C?15和C?16進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾后得到異甜菊醇衍生物，發(fā)現(xiàn)這些衍生物對DOX誘導(dǎo)的斑馬魚胚胎的心臟毒性具有保護(hù)作用[15]。在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究在C?19活潑位點(diǎn)引入苯并咪唑和3?氨基?2?羥基吡啶片段合成新的異甜菊醇衍生物，同時考察前期合成的衍生物[15]和新的衍生物的抗氧化應(yīng)激損失作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ML303T/02、ML104T/02電子天平[梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司]；85?1磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；HWCL?1型集熱式恒溫磁力攪拌浴（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；ZF?20D型暗箱三用紫外分析儀[驥輝分析儀器（上海）有限公司]；N?1210型EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、真空干燥箱VOS?60A[施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司]；S10H型超聲波清洗機(jī)[致微（廈門）儀器有限公司]；Alliacen e2695超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Q ExactiveOrbitrap高分辨質(zhì)譜儀（美國Ther?mo scientific公司）；核磁共振儀（德國布魯克公司）；Esco二氧化碳培養(yǎng)箱（藝思高科技有限公司）；5424R離心機(jī)（德國Eppendrof公司）；Axio Observer Z倒置熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）；TriStar2SLB942S多功能酶標(biāo)儀（德國Berthold公司）；FAC?SCelesta分析型流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

3?氨基?2?吡啶酮、苯并咪唑、N,N?二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醛溶液（37%）、四甲基哌啶氮氧化物（TEMPO）、KI、SOCl2均購于艾覽（上海）化工科技有限公司；次氯酸鈉、亞氯酸鈉、三乙胺（TEA）、NaOH、乙醇均購于阿拉丁試劑(上海)有限公司；H2O2購于科龍化工有限公司；以上試劑均為分析純。

H9c2心肌細(xì)胞系購買于中國科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibico公司）；活性氧（ROS）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；二甲基亞砜DMSO、CCK?8檢測試劑盒（Biosharp）；青霉素?鏈霉素溶液、LDH檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2 異甜菊醇衍生物的合成

合成路線如圖1所示。其中異甜菊醇衍生物A和B為前期研究合成所得[15]，化合物D和E為新合成，4種衍生物均為白色固體粉末。

圖1 異甜菊醇衍生物合成路線Figure 1 The synthetic route of isosteviol derivatives

稱取300 mg異甜菊醇溶于1.2 mL SOCl2溶液中，76℃反應(yīng)4 h，得到粗產(chǎn)物C。

100 mg粗產(chǎn)物C溶于10 mL無水DCM，加入120 mg 3?氨基吡啶?2（1H）?酮和0.2 6mL TEA，143 mg HATU，室溫反應(yīng)2~4 h。反應(yīng)結(jié)束后，用水萃取產(chǎn)物，加入無水Na2SO4干燥，通過柱色譜法純化（洗脫液：PE∶EA=1∶1）得到衍生物D（80 mg，80%產(chǎn)率）。

450 mg粗產(chǎn)物C溶于5 mL無水DCM，加入173.46 mg苯并咪唑和2 mL TEA，室溫反應(yīng)2~4 h。反應(yīng)結(jié)束后，用水萃取產(chǎn)物，加入無水Na2SO4干燥，通過柱色譜法純化（洗脫液：PE∶EA=4∶1）得到衍生物E（219 mg，75%產(chǎn)率）。

化合物D和E，用高效液相色譜（HPLC）法對衍生物進(jìn)行了純度測定，D純度為97.8%，E純度為96.74%。

1.3 細(xì)胞實(shí)驗

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 H9c2心肌細(xì)胞用含2 mmol/LL?谷氨酰胺、10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清、青霉素（10 000 U/mL）和鏈霉素（10 000μg/mL）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。實(shí)驗前將細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)皿或孔板上24 h后，選擇貼壁90%以上生長良好的心肌細(xì)胞，用500μmol/L的H2O2處理2 h，或在H2O2處理之前用不同衍生物預(yù)處理24 h。

1.3.2 細(xì)胞活力及乳酸脫氫酶LDH測定 為了探討H2O2濃度對心肌細(xì)胞活力和膜穩(wěn)定性的影響，用100~500μmol/L H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞2 h后，利用CCK?8檢測試劑盒檢測細(xì)胞的活性。除去培養(yǎng)基，將新鮮制備的10%CCK?8溶液添加到每個孔中，并在37℃下孵育2 h后，立即使用酶標(biāo)儀在450 nm處測量每個孔的吸光度。采用乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒檢測細(xì)胞釋放到培養(yǎng)上清液中的乳酸脫氫酶活性，處理好的細(xì)胞，每孔吸取120μL培養(yǎng)上清液到新的96孔板中，加入60μL LDH檢測工作液，室溫輕搖30 min，使用酶標(biāo)儀在490 nm處測量每個孔的吸光度。

1.3.3 細(xì)胞凋亡和壞死的檢測 采用AnnexinV?FITC/PI雙染法對細(xì)胞的凋亡和壞死的水平進(jìn)行檢測。經(jīng)H2O2或衍生物處理后的細(xì)胞，經(jīng)無芬紅胰酶消化、PBS洗滌后，加入400μL 1X的AnnexinV?FITC結(jié)合液懸浮細(xì)胞，加入5μLAnnexinV?FITC染色液，混勻后4℃避光孵育15 min；加入10μL PI染色液，混勻后4℃避光孵育15 min，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，熒光通道設(shè)置為FITC和PI。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的檢測 采用二氯熒光素（DCFH?DA）對細(xì)胞內(nèi)ROS進(jìn)行測定。將H9c2心肌細(xì)胞鋪在六孔板上，并在有或沒有加入衍生物的情況下預(yù)處理24 h，然后用500μmol/L H2O2處理2 h。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，與2μmol/L DCFH?DA在37℃孵育30 min。用0.25%的胰蛋白酶（不含EDTA和酚紅）洗滌過量的DCFH?DA后，加入300μLPBS中，并使用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度。使用flowjo軟件（版本7.6.1）分析數(shù)據(jù)，并用FITC陽性細(xì)胞的百分比表示細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2 結(jié)果

2.1 衍生物結(jié)構(gòu)表征

化合物A和B表征結(jié)果參考課題組前期研究結(jié)果[15]。

衍生物D：1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：8.72（d，J=4.2 Hz，1H），8.42（d，J=8.3 Hz，1H），7.43（dt，J=39.2，19.5 Hz，1H），2.77（dd，J=18.5，2.9Hz，1H），2.48（d，J=13.8 Hz，1H），2.10~1.95（m，3H），1.90~1.83（m，2H），1.75（d，J=12.8 Hz，2H），1.67（d，J=15.1 Hz，2H），1.64（s，3H），1.63~1.55（m，3H），1.50~1.38（m，3H），1.37~1.33（m，1H），1.33~1.26（m，3H），1.07（s，3H），1.04（d，J=3.2 Hz，1H），1.02（s，3H）。13CNMR（150 MHz，CDCl3）δ：222.22，173.23，151.71，140.81，134.96，129.25，120.75，57.31，54.75，54.20，48.71，48.41，44.29，41.26，39.46，38.62，38.29，38.00，37.24，28.80，21.68，20.38，19.86，18.86，14.09。HRAMLC?MS/MS：m/z：409.2486（6）[M?H]?（calcdforC25H34N2O3，410.2569）。

衍生物E：13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：222.20，175.88，142.58，140.74，133.06，125.68，124.80，120.33，115.70，60.29，55.56，54.31，48.77，48.47，48.45，41.94，40.21，40.02，39.63，38.63，37.33，28.86，22.46，20.47，19.95，19.43，15.77。HRAMLC?MS/MS：m/z：419.2692（9）[M+H]+（calcdforC27H34N2O2，419.2693）。

2.2 異甜菊醇衍生物抗心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷保護(hù)作用

2.2.1 不同濃度H2O2對H9c2細(xì)胞活力和LDH釋放率的影響 細(xì)胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶（LDH）的含量，可以反映細(xì)胞膜的完整程度，細(xì)胞損傷發(fā)生時，細(xì)胞膜遭破壞，通透性增加，更多的LDH會釋放到細(xì)胞外。從圖2可見，用100~500μmol/L H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞2 h，細(xì)胞存活率及乳酸脫氫酶LDH釋放顯示出H2O2濃度依賴性，經(jīng)500μmol/L H2O2處理后，細(xì)胞活力顯著下降至42%（P<0.01），細(xì)胞膜完整性被嚴(yán)重破壞，LDH濃度為Control組的4.7倍，細(xì)胞毒性明顯增加（P<0.01）。因此確定500μmol/L H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞2 h作為后續(xù)實(shí)驗的條件，用于誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。

圖2 不同濃度H2O2對H9c2心肌細(xì)胞活力（A）和LDH釋放率（B）的影響Figure 2 Effects of different concentrations of H2O2 on H9c2 cardiomyocyte activity and release of LDH

2.2.2 不同衍生物預(yù)處理對細(xì)胞活力的影響 選擇H2O2相應(yīng)濃度建立好穩(wěn)定模型后，進(jìn)一步研究不同衍生物預(yù)處理對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果見圖3?？梢?，和空白對照組相比，加入500μmol/L H2O2后細(xì)胞存活率明顯降低；根據(jù)課題組前期研究顯示，5μmol/L是異甜菊醇鈉產(chǎn)生心臟保護(hù)作用的有效劑量[12?13]，因此，以該劑量作為衍生物活性初步篩選的給藥濃度。用5μmol/L的衍生物預(yù)處理后，與H2O2模型組相比，細(xì)胞存活率均有明顯增加（設(shè)對照為1，H2O2模型組細(xì)胞活力降低為對照組的26.16%，P<0.01；給藥組比模型組細(xì)胞活性增加量分別是：A：21.47%，不顯著；B：16.53%，P<0.01；D：9.76%，P<0.05；E：52.97%，P<0.05），以衍生物E作用最顯著。后續(xù)以不同濃度的衍生物E預(yù)處理進(jìn)一步研究對H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用。

圖3 不同衍生物預(yù)處理對H9c2心肌細(xì)胞活力的影響Figure 3 Effects of different isosteviol derivatives pretreat?menton H9c2 cardiomyocyte activity

2.2.3 不同濃度的衍生物E預(yù)處理對細(xì)胞活力的影響 從圖4可見，與H2O2模型組比較，在5~20μmol/L的衍生物E預(yù)處理后H9c2細(xì)胞存活率隨藥物濃度升高而降低（圖4A），進(jìn)一步降低藥物濃度探討合適的給藥濃度。在1~10μmol/L預(yù)處理細(xì)胞后，與H2O2模型組相比，細(xì)胞存活率先與給藥濃度成正相關(guān)，給藥濃度為5μmol/L達(dá)到最高，隨后降低（圖4B）。綜合2個實(shí)驗濃度范圍的預(yù)處理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衍生物E給藥濃度為5μmol/L時對H9c2細(xì)胞的保護(hù)作用最明顯，因此采用5μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗的藥物處理濃度。

圖4 不同濃度的衍生物E對H9c2細(xì)胞活力的影響Figure 4 Effects of Different Concentrations of Isosteviol Derivative Eon the cell viability of H9c2 cells

2.2.4 衍生物E預(yù)處理對細(xì)胞凋亡和壞死的影響為了檢測衍生物E能否抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和壞死，采用AnnexinV?FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞儀檢測了不同組中的細(xì)胞凋亡和壞死水平，結(jié)果見圖5。可見，與空白組相比，H2O2模型組細(xì)胞的凋亡率和壞死率都顯著上升，5μmol/L衍生物E預(yù)處理則顯著降低了細(xì)胞凋亡和壞死；同時，衍生物E單獨(dú)給藥組與空白組相比，細(xì)胞的凋亡率和壞死率沒有明顯的改變，表明5μmol/L衍生物E預(yù)處理細(xì)胞能夠抑制由H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞的凋亡和壞死。

圖5 衍生物E對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞凋亡和壞死的影響Figure 5 Effect of derivative Eon apoptosis and necrosis of H9c2 cells induced by oxidative stress

2.2.5 衍生物E預(yù)處理對氧化應(yīng)激時H9c2細(xì)胞中的ROS水平的影響 為了檢測衍生物E是否會調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的活性氧ROS，用DCFH?DA熒光染料孵育細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果見圖6?？梢?，與空白組相比，H2O2模型組中細(xì)胞內(nèi)的ROS水平顯著上升，表明細(xì)胞氧化應(yīng)激增強(qiáng)；與H2O2模型組相比，5μmol/L化合物預(yù)處理24 h則顯著降低了細(xì)胞ROS水平；衍生物E單獨(dú)處理24 h的細(xì)胞ROS水平與空白組相比沒有明顯的變化。

圖6 衍生物E對H2O2誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞氧化應(yīng)激中ROS水平的影響Figure 6 Effect of derivative Eon ROSlevel in H2O2 induced oxidative stress in H9c2 cells

3 討論

細(xì)胞內(nèi)的活性氧ROS包含了超氧自由基、羥基自由基和過氧化氫等[16]。氧化應(yīng)激是ROS產(chǎn)生和體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)之間失衡的結(jié)果[17]。當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA受損，引起心肌細(xì)胞壞死和凋亡[18?19]。H2O2是一種相對穩(wěn)定的氧自由基，H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激是一種用于研究化合物或藥物對心臟疾病的潛在保護(hù)的廣泛使用的模型[20?25]。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，異甜菊醇可以增加H9c2細(xì)胞缺氧再灌注后的細(xì)胞活力、降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平、恢復(fù)線粒體形態(tài)及其膜電位，具有抑制細(xì)胞缺氧再灌注損傷的作用[11]；可通過抑制線粒體裂變蛋白表達(dá)，同時上調(diào)抗氧化因子硫氧還蛋白1（Trx1）和過氧化物酶2（Prdx2）的表達(dá)，從而降低ROS水平并恢復(fù)線粒體膜電位和形態(tài)的完整性[14]。本研究用500μmol/L H2O2處理H9c2心肌細(xì)胞2 h后，細(xì)胞的活力降低至約42%，LDH濃度則逐漸上升到對照組的4.7倍以上，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的LDH濃度反映了細(xì)胞膜的損傷程度，表明500μmol/L處理2 h能夠使H9c2細(xì)胞產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，氧化應(yīng)激損傷模型構(gòu)建成功。通過化學(xué)修飾在活潑位點(diǎn)C?15、C?16引入羥基羧基、在C?19引入苯并咪唑和3?氨基?2?羥基吡啶片段得到4個異甜菊醇衍生物A、B、D、E，經(jīng)衍生物預(yù)處理后，細(xì)胞活力提升；5μmol/L衍生物E預(yù)處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平下調(diào)，細(xì)胞存活率提高25%，降低了由H2O2導(dǎo)致的H9c2細(xì)胞凋亡和壞死。綜上所述，異甜菊醇衍生物對H2O2誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用，其構(gòu)效關(guān)系及抗氧化應(yīng)激確切的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。