緊密連接蛋白在高尿酸血癥致大鼠腎間質纖維化腎組織的表達及非布司他的干預作用

陳 敢 周姍姍 關昌杰 劉日光 秦曙光

廣州市第一人民醫(yī)院腎內科 (廣州 510180)

慢性腎衰竭(CRF)是各種慢性腎臟疾病發(fā)展的最終階段，腎小管間質纖維化在慢性腎臟疾病進展中起重要作用[1]。越來越多的研究表明[2]，導致腎臟纖維化的腎小管上皮細胞間充質轉化(EMT)伴隨著上皮細胞間連接(tight junction)的破壞和失去粘附能力。尿酸是人類嘌呤代謝的終產物，有研究表明，高尿酸通過影響腎小管上皮細胞功能紊亂從而導致高血壓和腎間質損害，最終形成惡性循環(huán)導致腎功能衰竭[3]。草酸鈣晶體液刺激MDCK細胞，引起MDCK細胞間質轉分化，緊密連接蛋白表達及功能下調，其有增強腎間質小管損傷，提示緊密連接可能是草酸鈣晶體液誘導腎間質EMT的啟動環(huán)節(jié)[4]。而有關高尿酸血癥誘導腎間質纖維化小管上皮細胞緊密連接蛋白表達關系的研究甚少。緊密連接蛋白中最重要的是跨膜蛋白occludin與胞質附著蛋白ZO家族及細胞內與其相連的細胞骨架蛋白，occludin與ZO-1的表達和分布與上皮細胞通透性密切相關[5]。故本實驗我們利用高尿酸血癥誘導大鼠腎間質纖維化模型觀察高尿酸血癥腎損害及腎間質纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中，緊密連接蛋白occludin與ZO-1的表達變化以及它與高尿酸血癥誘導腎間質纖維化間的關系，并應用降尿酸藥物非布司他觀察其對大鼠高尿酸血癥所致緊密連接蛋白表達異常及與腎間質纖維化的關系。為尋找腎間質纖維化發(fā)生、發(fā)展中的治療靶點，為CKD進行性發(fā)展的防治提供重要的理論依據和新的思路。

1 材料與方法

1.1 選用SPF級健康雄性SD大鼠30只(購自廣東省實驗動物中心),隨機分為正常對照組—正常組；高尿酸血癥模型組—模型組；非布司他干預組—干預組(n=10)。飼養(yǎng)于中山大學實驗動物中心SPF級實驗室，所有對大鼠操作均符合動物倫理委員會的要求。

1.2 主要試劑

非布司他(江蘇萬邦生物醫(yī)藥有限公司)，氧嗪酸、尿酸(購自美國Sigma化學公司)，Trizol總RNA抽提試劑盒、SYBR Green1染料(購自美國Invitrogen公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模：氧嗪酸(oxonic acid,OA)和非布司他配無菌蒸餾水溶解,尿酸用自來水溶解，均配置成所需濃度。模型組和干預組喂飼氧嗪酸,每日3次,同時給予尿酸水每日飲用[6]；干預組則于建立模型的同時給予非布司他灌胃,每日1次〔7〕；正常組給予等量的蒸餾水灌胃，自來水飲用，各組均連續(xù)給藥6周。水合氯醛腹腔注射麻藥，取各組大鼠腎臟組織，分別做免疫組化和熒光定量PCR。

1.3.2 腎臟組織學分析 將腎組織經10%的中性甲醛溶液中固定過夜，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片(4 μm厚度)后，進行馬松三色(Masson)染色分析。

1.3.2.1 腎臟免疫組化 石蠟切片常規(guī)脫蠟水化后，3%H2O2室溫孵育10 min，高壓處理修復抗原，小牛血清封閉非特異性抗原，分別加入兔抗大鼠ZO-1、occludin多克隆抗體(美國Zymed 1:100)，4 ℃孵育過夜，顯微鏡下觀察，蘇木素襯染，脫水、封片。

1.3.3 實時熒光定量PCR檢測 ZO-1、occludin mRNA表達水平，降Trizol試劑盒提取腎臟組織總mRNA，隨后取3 mL RNA模板做逆轉錄反應，按實際說明書將RNA逆轉錄為cDNA,按SYBR Green 試劑盒說明書進行PCR擴增，引物序列見表1，以GAPDH作為內參使每個樣品的目標基因標準化。

表1 PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 各組生化指標的變化

第6周時模型組和干預組血尿酸均增高(均P<0.01)。血肌酐和血尿素氮在模型組和干預組高于正常組(均P<0.01)。而干預組較模型組低(P<0.05)；見表2。

表2 各組大鼠第6周血生化指標變化

2.2 腎臟組織Masson染色觀察

比較三組大鼠腎臟組織RIF指數[8]，與正常組相比，模型組、干預組RIF指數均增高(均P<0.05)，干預組RIF指數低于模型組，高于正常組(均P<0.05)。見表3。

表3 三組大鼠6周時腎臟組織RIF指數

2.3 ZO-1、occludin免疫組化表達結果 與正常組相比，模型組、干預組ZO-1、occludin蛋白表達量顯著減少(均P<0.05)，干預組ZO-1、occludin表達量高于模型組，低于正常組(均P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠腎臟組織6周ZO-1、occludin蛋白表達光密度值(IOD)變化變化

2.4 ZO-1 、occludin mRNA的表達情況

實驗6周時與正常組織比較，模型組ZO-1 mRNA表達是正常組的0.118倍(P<0.05)，干預組ZO-1 mRNA表達是正常組的0.510倍(P<0.05)；模型組occludin mRNA表達是正常組的0.128倍(P<0.05)，干預組occludin mRNA表達是正常組的0.385倍(P<0.05)。見表5、圖1。

表5 各組大鼠腎臟組織6周ZO-1、occludin mRNA(相對定量數值(2—△△Ct))表達的變化

圖1 ZO-1和occludin RT-PCR產物電泳

3 討 論

跨膜蛋白occludin與胞質附著蛋白ZO-1是緊密連接蛋白中最重要的細胞骨架蛋白，在人體各組織器官中均有表達,目前研究表明，上皮細胞緊密連接蛋白參與機體多種生理過程，同時也參與了多種病理機制過程。許多腎臟病理狀態(tài)下伴隨著上皮細胞緊密連接蛋白結構和功能的改變，腎小管上皮細胞緊密連接的改變可影響腎小管上皮屏障功能并改變內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而啟動慢性腎小管間質纖維化[9]，而高尿酸血癥致慢性腎小管間質纖維化中對緊密連接蛋白影響的研究很少，本研究通過氧嗪酸聯合尿酸方法復制大鼠高尿酸血癥模型[7]，實驗表現為血尿酸顯著升高且腎功能顯著下降。實驗選取非布司他作為腎臟保護的陽性對照組。非布司他是近年來一種新型的降尿酸藥物，它是非嘌呤類黃嘌呤氧化酶抑制劑，可以高度選擇性的抑制黃嘌呤氧化酶，不受氧化或還原狀態(tài)的影響，抑制尿酸的生成,延緩腎間質纖維化，延緩腎功能衰竭[10]。實驗結果提示高尿酸血癥成模后6周及非布司他干預組大鼠RIF指數明顯增加,兩組相比干預組較低(P<0.05)但高于正常組(P<0.05)，說明大鼠腎間質纖維化明顯增加。模型組、干預組大鼠腎臟組織ZO-1 、occludin mRNA表達量較正常組明顯降低(均P<0.01)，但干預組較模型組增高(P<0.05)，Peerapen P[4]等研究發(fā)現,在草酸鈣晶體液刺激MDCK細胞，通過免疫熒光發(fā)現緊密連接蛋白表達量減少，Zeisber[11]等研究表明ZO-1在EMT過程中受到抑制，表達相應減少，而移植腎缺血再灌注之后，緊密連接蛋白ZO-1與粘附連接蛋白的表達均降低，在細胞內的分布發(fā)生改變[12]。這與我們的實驗結果相一致，本實驗發(fā)現ZO-1、occludin的表達與高尿酸血癥引起的腎間質纖維化呈負相關(r=- 0.996,P<0.01)。由于ZO-1、occludin的表達減少時已出現腎間質纖維化，故緊密連接蛋白的表達減少是高尿酸血癥腎間質纖維化的原因還是結果，尚無法定論。而本實驗中應用非布司他干預血尿酸濃度，能顯著改善ZO-1、occludin的表達，推測血尿酸濃度高低可能影響緊密連接蛋白的表達，至于是否通過其他因子影響緊密連接蛋白的表達尚有待進一步研究。同時我們發(fā)現，非布司他對大鼠腎功能的保護作用具有顯著性意義。

由于腎間質纖維化早期階段EMT是可逆的，所以盡早干預有可能誘導已發(fā)生的EMT的腎小管上皮細胞恢復正常，維持腎臟正常的組織結構和功能[13]。通過本研究，明確了高尿酸血癥能下調ZO-1和occludin的表達，且低表達的ZO-1和occludin能有效促進腎小管上皮細胞發(fā)生EMT，這不僅加深了對EMT及高尿酸血癥腎間質纖維化的認識，還提示增加ZO-1和occludin的表達和功能可作為一個新的高尿酸血癥腎病治療靶點。同時我們發(fā)現，在高尿酸血癥大鼠腎間質纖維化發(fā)展過程中，隨著大鼠腎間質EMT的發(fā)展，緊密連接蛋白的表達下調，非布司他具有減輕緊密連接蛋白表達下調的作用，說明非布司他對大鼠腎功能的保護作用具有顯著性意義，為CKD進行性發(fā)展的防治提供重要試驗依據和新的思路。