瓊脂糖酶產(chǎn)生菌的篩選和培養(yǎng)基優(yōu)化

李 靜， 楊邵嵐， 黃 琳， 管政兵， 蔡宇杰， 廖祥儒*

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122）

瓊脂是從紅藻加工中獲得的多糖，由具有雜合結(jié)構(gòu)的半乳聚糖家族構(gòu)成，組分為瓊脂糖和瓊脂膠[1]。瓊脂糖是接近中性的多糖，是由1，3糖苷鍵連接的β-D-半乳糖（G）和由1，4糖苷鍵連接的3，6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖（LA）殘基重復(fù)交替連接成的線性多糖分子，因其具有穩(wěn)定性和凝膠特性而受到廣泛應(yīng)用，例如作為食品添加劑、生物能源的原料、微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基、糖果以及瓊脂果凍[2]。瓊脂膠的半乳聚糖主鏈上常有硫酸酯基團(tuán)等其他基團(tuán)，并結(jié)合著鈣、鎂等無機(jī)元素[3]。

瓊脂糖酶由瓊脂分解細(xì)菌產(chǎn)生，幫助瓊脂解聚，將其降解成低聚合度的寡糖中間體，再繼續(xù)通過反應(yīng)進(jìn)行能量轉(zhuǎn)化[4-5]。瓊脂糖酶是生物研究領(lǐng)域的基本工具，可以從瓊脂糖凝膠中回收脫氧核糖核酸（DNA）條帶[6]，更是制備寡糖和降解紅藻細(xì)胞壁的重要工具酶，用于提取具有抗氧化等活性的生物質(zhì)[7-8]?；诹呀饽Ｊ剑傊敲阜譃棣?瓊脂糖酶和β-瓊脂糖酶。目前研究的瓊脂糖酶多來源于海洋微生 物， 包 括 弧 菌 屬 （Vibrio）[9]、 交 替 單 胞 菌 屬（Alteromonas）[10]、假單胞菌屬（Pseudomonas）[11]、不動(dòng)桿 菌 屬（Acinetobacter）和 鏈 霉 菌 屬（Streptomyces）等[12]。而這些菌株所產(chǎn)瓊脂糖酶活性低，降解瓊脂或瓊脂糖的能力普遍不高，如韓堯躍等[13]2015年分離的產(chǎn)瓊脂糖酶弧菌Ag-1，其發(fā)酵上清液酶活為7 U/mL；而張靜雅等[14]獲得的海洋弧菌HN897，酶活僅為0.41 U/mL；2018年，劉婷威等[15]對(duì)獲得的菌株Agarivorans albus RZW1-1進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，得到最高酶活為23.02 U/mL。由于現(xiàn)有瓊脂糖酶存在活性、穩(wěn)定性和生產(chǎn)率低等缺點(diǎn)，使得這些酶在工業(yè)生產(chǎn)中很少使用。迄今只有Sigma-Aldrich有限公司的β-瓊脂糖酶應(yīng)用于生產(chǎn)，1 kU費(fèi)用為1 854.4元，價(jià)格十分昂貴，所以目前僅用于科研[16]。

太歲作為一種大型混菌復(fù)合體，常以纖維素、幾丁素、甲殼質(zhì)為營(yíng)養(yǎng)[17-18]。作者從太歲中篩選得到了多株產(chǎn)瓊脂糖酶的菌株，開展了菌種鑒定及初步優(yōu)化發(fā)酵條件的實(shí)驗(yàn)，為非海洋來源瓊脂糖酶的開發(fā)，進(jìn)一步實(shí)施瓊脂糖酶基因的克隆表達(dá)及放大發(fā)酵等做了基礎(chǔ)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 太歲樣品由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑和儀器 酵母粉、蛋白胨、碘化鉀、碘、D-半乳糖、3-5二硝基水楊酸、NH4SO4、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、瓊脂粉：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；瓊脂糖（BiowestAgarose）：無錫特達(dá)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；柱式細(xì)菌基因提取試劑盒：天恩澤基因科技有限公司產(chǎn)品；2×Taq酶等PCR相關(guān)試劑：大連TaKaRa公司產(chǎn)品；pH計(jì)：奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)：Biorad公司產(chǎn)品；PCR儀、電泳儀：Biorad公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基與常用儲(chǔ)備液

1）篩選 培 養(yǎng) 基（g/L）：Agar 15、（NH4）2SO42、K2HPO4·3H2O0.5、NaCl 0.2、MgSO4·7H2O0.02；pH為7。

2）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：Agar 2，（NH4）2SO42、K2HPO4·3H2O 0.5、NaCl 0.2、MgSO4·7H2O 0.05、FeSO4·3H2O 0.02、CaCl20.01；pH為7。

3）種子培養(yǎng)基：同搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。

4）種子液的制備：用接種環(huán)輕蘸?jiǎn)蝹€(gè)菌落，接種至種子培養(yǎng)基，30℃、150 r/min過夜培養(yǎng)即為種子液。

5）DNS試劑：3，5-二硝基水楊酸3.15 g，在500 mL蒸餾水中溶解并攪拌，水浴至45℃，在溶液中按次序加入NaOH 20 g、酒石酸鉀91 g、無水亞硫酸鈉2.5 g、苯酚2.5 mL，攪勻，降至常溫后定容到1 000 mL，放入棕色試劑瓶避光密封，室溫下放置7 d后使用，6個(gè)月內(nèi)有效[19]。

6）底物溶液：瓊脂糖溶于pH為7的磷酸鹽緩沖液，使其終質(zhì)量濃度為0.5 g/dL，煮沸溶解后放置在40℃保溫。

1.2 方法

1.2.1 菌種的篩選 取1 g太歲樣品加入10 mL無菌水后于小型料理機(jī)中攪碎處理，將處理后的樣品稀釋后涂布于篩選培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，為防止盧氏碘液對(duì)細(xì)胞造成損傷，先標(biāo)記篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落并于新的平板上劃線，后在原平板上傾倒盧氏碘液，挑選原平板中有較大透明圈的菌落，將其對(duì)應(yīng)的新平板放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)接入有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30℃、150 r/min培養(yǎng)40 h，離心取上清液測(cè)酶活，選取540 nm處吸光度最高的細(xì)菌保存并鑒定。

1.2.2 菌株的鑒定

1）將菌株在平板上劃線至出現(xiàn)單個(gè)菌落，觀察其形態(tài)，革蘭氏染色后觀察菌體細(xì)胞特征。

2）16S rRNA基因序列的PCR擴(kuò)增和序列比對(duì)。利用柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，提取全基因組作為PCR模板DNA。擴(kuò)增引物選用細(xì)菌鑒定通用引物：正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-GGTTACCTTG TTACGACTT-3′。

PCR反應(yīng)體系（50μL）：2×Taq酶溶液25μL，DNA模板1μL，上下游引物各1μL，ddH2O 22μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。取5μL擴(kuò)增樣品進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果呈陽性（條帶大小正確）的樣品送至天霖生物科技（無錫）有限公司測(cè)序。測(cè)得序列結(jié)果利用NCBI的BLAST程序做同源性比對(duì)，選取比對(duì)后一些相似的菌株序列，運(yùn)用MEGA5.0的Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 酶活的測(cè)定 粗酶制備：4℃、8 000 r/min離心10 min取發(fā)酵上清液。

實(shí)驗(yàn)組為200μL發(fā)酵液加入200μL質(zhì)量濃度0.5 g/dL的瓊脂糖底物，對(duì)照組在此基礎(chǔ)上再加入400μL DNS試劑，對(duì)粗酶液進(jìn)行鈍化處理。兩組分別混勻后在40℃下反應(yīng)30 min，實(shí)驗(yàn)組加入DNS試劑停止反應(yīng)，煮沸5 min，冰水降溫后定容至5 mL。以對(duì)照組作為參照，測(cè)定其在540 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)曲確定反應(yīng)產(chǎn)生的還原糖質(zhì)量。

瓊脂糖酶的酶活定義：依照上述前提，每分鐘產(chǎn)生1μg還原糖所需的酶量作為一個(gè)酶活單位U。酶活力以U/mL表示。

1.2.4 菌株的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線 將體積分?jǐn)?shù)2%的種子液加入發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、150 r/min培養(yǎng)，間隔5 h取發(fā)酵液，以其在600 nm下的吸光度、發(fā)酵上清液的酶活力制作菌株的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線。

1.2.5 菌株產(chǎn)瓊脂糖酶的發(fā)酵優(yōu)化 采用單因素方法依次調(diào)整培養(yǎng)基的碳源、氮源及無機(jī)鹽質(zhì)量濃度。選取瓊脂粉、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖與瓊脂糖（均為0.2 g/dL）作為碳源，探究不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。確定最合適的碳源后，探究菌株產(chǎn)酶與碳源的添加質(zhì)量濃度之間的關(guān)系。優(yōu)化碳源后，選擇牛肉膏、蛋白胨、NH4NO3、（NH4）2SO4及酵母粉（均為0.2 g/dL）作為氮源，進(jìn)一步探究氮源的不同是否影響菌株產(chǎn)瓊脂糖酶。確定最佳氮源后，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定K+、Mg2+及Ca2+為3種實(shí)驗(yàn)因素（金屬離子添加形式分別為：K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、CaCl2），以濃度2 mmol/L和5 mmol/L為變量設(shè)計(jì)了8組實(shí)驗(yàn)（見表1），從而確定產(chǎn)瓊脂糖酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

表1 無機(jī)鹽濃度優(yōu)化Table 1 Optimization of the concentration of inorganic salts

1.2.6 數(shù)據(jù)分析及繪圖 所有實(shí)驗(yàn)采用至少3個(gè)重復(fù)，在此基礎(chǔ)上采用SPPSV13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

利用瓊脂糖酶篩選培養(yǎng)基，從太歲樣品得到幾株產(chǎn)生明顯透明圈的菌株。經(jīng)過初篩純化及搖瓶復(fù)篩之后，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為P1的細(xì)菌產(chǎn)酶能力較強(qiáng)，初始酶活達(dá)到10.08 U/mL。將其作為目的菌株進(jìn)行下一步研究。按照分子生物學(xué)的方法得到16SrRNA基因一段長(zhǎng)1 425 bp的DNA，將得到的DNA利用NCBI網(wǎng)站的BLAST進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示編號(hào)為P1的菌株序列與氣味類芽孢桿菌（Paenibacillus odorifer）的一致性超過99%。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示P1與Paenibacillus odorifer DSM 15391（T）在同一分支的置信度為77%，所以將其鑒定為類芽孢桿菌屬（見圖1）。

圖1 Paenibacillus sp.P1的16Sr RNA進(jìn)化樹分析Fig.1 16S r RNA phylogenetic tree analysis of Paenibacillus sp.P1

單個(gè)P1菌落在篩選培養(yǎng)基上是白色半透明圓形、表面平整、邊緣規(guī)則的短桿狀細(xì)胞，呈革蘭氏陰性。經(jīng)生理生化鑒定，該菌具有固氮能力，既不能利用明膠，也無法水解纖維素（見表2）。

表2 Paenibacillus sp.P1生理生化鑒定Table 2 Physiological and biochemical identification of Paenibacillus sp.P1

2.2 菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶曲線

利用發(fā)酵培養(yǎng)基在30℃培養(yǎng)60 h后，繪制菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線（見圖2），發(fā)現(xiàn)菌株在1~10 h時(shí)，生長(zhǎng)緩慢，此時(shí)產(chǎn)酶量非常低。而在10~25 h期間，菌株屬于快速生長(zhǎng)期，生物量劇增且酶量也逐步上升。之后P1進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，此時(shí)生物量增長(zhǎng)減緩，在35 h左右生物量有下降趨勢(shì)，但相應(yīng)酶活依然在增加，在40 h時(shí)達(dá)到最高值。之后菌種的生物量得到短暫回升后繼續(xù)降低，酶量也隨之減少。因此可判斷P1的最優(yōu)發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)為40 h，此時(shí)瓊脂糖酶酶活為10.1 U/mL。

圖2 Paenibacillus sp.P1的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)瓊脂糖酶曲線Fig.2 Growth curve and agarase-producing curve of Paenibacillus sp.P1

2.3 碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

選取瓊脂粉、葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖與瓊脂糖（均為0.2 g/dL）作為碳源進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其他成分與發(fā)酵培養(yǎng)基中一致。30℃培養(yǎng)40 h測(cè)酶活（碳源質(zhì)量濃度的優(yōu)化與此步操作一致）。如圖3（a）所示，在以葡萄糖、可溶性淀粉和乳糖作為碳源時(shí)，P1的瓊脂糖酶產(chǎn)量較低，而以瓊脂粉和瓊脂糖作為碳源時(shí)，瓊脂糖酶的酶活雖相差不大，但瓊脂粉更能促進(jìn)酶活升高。兩者的區(qū)別在于瓊脂粉中瓊脂膠占比更高，結(jié)合瓊脂膠的結(jié)構(gòu)以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)中金屬離子的濃度優(yōu)化結(jié)果，猜測(cè)是瓊脂膠上的基團(tuán)對(duì)酶活提高起了促進(jìn)作用，所以進(jìn)一步的碳源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)選擇瓊脂粉作為碳源。圖3（b）中當(dāng)瓊脂粉質(zhì)量濃度不超過0.3 g/dL時(shí)，酶活隨著培養(yǎng)基中瓊脂粉質(zhì)量濃度的增加而增加，最高可達(dá)到16.9 U/mL，而當(dāng)瓊脂粉質(zhì)量濃度在0.3~0.5 g/dL時(shí)，酶活隨瓊脂粉質(zhì)量濃度升高而下降，因瓊脂粉中的瓊脂糖具有凝膠功能，猜測(cè)是瓊脂粉質(zhì)量濃度升高，使反應(yīng)液黏稠，導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)過緩，酶活下降。

圖3 碳源種類及瓊脂粉質(zhì)量濃度對(duì)Paenibacillus sp.P1產(chǎn)瓊脂糖酶的影響Fig.3 Effects of carbon source species and agarose concentration on agarase production by Paenibacillus sp.P1

2.4 氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

選擇0.3 g/dL的瓊脂粉作為最佳碳源后，以質(zhì)量濃度均為0.2 g/dL的牛肉膏、蛋白胨、NH4NO3、（NH4）2SO4及酵母粉作氮源，考察氮源種類與瓊脂糖酶活力大小的聯(lián)系。結(jié)果如圖4所示，在選取的5種氮源下，P1都能產(chǎn)生瓊脂糖酶，但考慮到菌株本身的固氮能力，通過實(shí)驗(yàn)只能得出的結(jié)論是以蛋白胨作為氮源時(shí)，菌株產(chǎn)酶最多，此時(shí)的酶活達(dá)到22.7 U/mL。

圖4 氮源種類對(duì)Paenibacillus sp.P1產(chǎn)瓊脂糖酶的影響Fig.4 Effects of nitrogen source species on agarase production by Paenibacillus sp.P1

2.5 無機(jī)鹽濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

在優(yōu)化碳源、氮源及一些基礎(chǔ)發(fā)酵條件后，酶活提升到原始酶活的2倍以上。而產(chǎn)瓊脂糖酶的發(fā)酵培養(yǎng)基中有不少無機(jī)鹽成分，所以進(jìn)一步通過改變組分中的金屬離子濃度探究其對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響。結(jié)果見圖5，第6組酶活最高，此時(shí)K+、Mg2+及Ca2+的濃度分別為5、2、5 mmol/L。當(dāng)培養(yǎng)基中K2HPO4·3H2O與CaCl2的濃度升高時(shí)，P1的酶活有所提高，其中Ca2+對(duì)酶活提升有明顯促進(jìn)效果，而Mg2+濃度的增加則導(dǎo)致了酶活的降低。可能隨著SO42-添加濃度的增加，與Ca2+發(fā)生了結(jié)合，導(dǎo)致了Ca2+的減少，使得Ca2+的促進(jìn)作用被減弱，造成瓊脂糖酶活力減弱，Ca2+濃度的高低對(duì)瓊脂糖酶活的影響明顯，可能與瓊脂糖酶的結(jié)構(gòu)中有Ca2+結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)。

圖5 金屬離子濃度對(duì)Paenibacillus sp.P1產(chǎn)瓊脂糖酶的影響Fig.5 Effect of metal ion concentration on agarase production by Paenibacillus sp.P1

3 討論

我國(guó)的藻類資源十分豐富，但目前的開發(fā)利用產(chǎn)品多是以生產(chǎn)瓊脂作為化工及醫(yī)藥等原料出口，不僅附加值低，對(duì)環(huán)境也有污染。而通過瓊脂糖酶水解瓊脂或瓊脂糖可以高效獲得瓊脂寡糖[20]，瓊脂寡糖具備抗氧化活性[21]、保濕美白、抗炎及抑制淀粉降解[22]的作用。關(guān)于瓊脂糖酶產(chǎn)生菌的篩選和重組瓊脂糖酶的研究雖然很多，但尚沒有可以應(yīng)用于工業(yè)的酶產(chǎn)品，且目前國(guó)內(nèi)主要研究海洋來源細(xì)菌及其產(chǎn)生的瓊脂糖酶。作者從太歲中分離得到3株產(chǎn)瓊脂糖酶菌株，其中編號(hào)為P1的菌株產(chǎn)酶能力較強(qiáng)。通過生理生化及分子生物學(xué)鑒定，確定該菌株為氣味類芽孢桿菌（P.odorifer）。國(guó)內(nèi)尚未見有P.odorifer產(chǎn)瓊脂糖酶的報(bào)道，關(guān)于類芽孢桿菌的瓊脂糖酶基因的研究也相對(duì)較少。國(guó)外報(bào)道中，Hosoda等從菠菜根際土壤中分離得到幾株產(chǎn)瓊脂糖酶的Paenibacillussp.，這些菌株優(yōu)先存在于根部而不是土壤，符合根瘤菌的特性，并且它們都具有多種細(xì)胞外瓊脂糖[23]；Song等篩選到一株產(chǎn)瓊脂糖酶的菌Paenibacillussp.SSG-1，并通過菌株的全基因組測(cè)序得到瓊脂糖酶基因的序列[24]。

4 結(jié) 語

作者篩選獲得的Paenibacillussp.P1可以利用瓊脂作為唯一碳源，屬于非海洋來源的類芽孢桿菌屬，說明其含有將瓊脂糖水解成單糖的瓊脂糖水解酶體系，并且可能包含多種瓊脂糖酶，因此具有極大的開發(fā)潛力。實(shí)驗(yàn)測(cè)定并繪制了該菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線，其最佳產(chǎn)酶時(shí)間為培養(yǎng)40 h。通過對(duì)培養(yǎng)基的碳源、氮源及無機(jī)鹽濃度等因素的初步優(yōu)化，獲得其最適發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：Agar 3、蛋白胨2、K2HPO4·3H2O 1.0、NaCl 0.3、MgSO4·7H2O 0.05、FeSO4·3H2O 0.02、CaCl20.04（pH為7）。在最適發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵40 h測(cè)定P1的瓊脂糖酶酶活，該菌株的最高酶活達(dá)到34.7 U/mL，酶活提高為原來的3.4倍，為菌株放大培養(yǎng)和后續(xù)的瓊脂糖酶應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。為了對(duì)類芽孢桿菌的瓊脂糖酶進(jìn)行更深入的研究，將考慮對(duì)菌種P1進(jìn)行全基因組測(cè)序，挖掘出菌株中所有與瓊脂糖水解相關(guān)的酶的基因，進(jìn)行克隆表達(dá)或進(jìn)一步對(duì)基因進(jìn)行改造，以獲得酶活力更高、穩(wěn)定性更好等性質(zhì)更優(yōu)良的瓊脂糖酶，從而進(jìn)行更為全面的研究。后續(xù)實(shí)驗(yàn)也將以此為方向展開，期望得到關(guān)于類芽孢桿菌所產(chǎn)瓊脂糖酶的具體生物信息，補(bǔ)充非海洋來源的瓊脂糖酶信息，對(duì)比類芽孢桿菌所產(chǎn)瓊脂糖酶之間的異同。另外可將一種或幾種瓊脂糖酶聯(lián)合應(yīng)用于藻類轉(zhuǎn)化，生產(chǎn)單糖以及瓊脂寡糖等，促進(jìn)藻類資源的有效利用，將資源向高附加值產(chǎn)品轉(zhuǎn)化，為瓊脂糖酶的研究及藻類資源轉(zhuǎn)化提供更多方向。