散發(fā)性左、右半腸癌錯配修復蛋白功能缺失與臨床病理特征的關聯(lián)分析

梁 磊 ，普 鑫 ，李文亮 ，馬淑敏 ，劉曉婷 ，孟烜宇 ，寇智勇 ，楊 軍

（1）昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科；2）病案統(tǒng)計科，云南 昆明 650032）

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率及死亡率分別占惡性腫瘤中第三位和第二位[1]，通常由微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instability，MSI）、染 色 體 不 穩(wěn) 定（chromosomal instability，CIN）及CpG島甲基化3條途徑引起[2-3]。新近研究證實，由微衛(wèi)星不穩(wěn)定途徑引發(fā)的微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（microsatellite instability-high，MSI-H）/錯配修復蛋白缺失（deficient mismatch repair protein，dMMR）狀態(tài)的腸癌患者預后較好[4-5]，通過檢測MSI-H/dMMR可指導結直腸癌化療藥物的選擇[6]，用于結直腸癌患者預后評估[7]。MSI-H/dMMR分別可通過多重熒光聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）及免疫組化（immunohistochemistry，IHC）進行檢測，兩者特異性及敏感性均＞90%[8]，可認為MSIH≈dMMR，由于IHC價格低廉、耗時較短[9]，因此臨床上更多用IHC進行檢測。

既往研究提示dMMR狀態(tài)與結直腸癌患者臨床病理特征存在相關性[10]。dMMR更多見于年輕、右半結腸、低分化、腫瘤直徑更大，粘液腺癌[11]以及UICC分期為I～II期[12]的結直腸癌患者。

為分析散發(fā)性左、右半腸癌dMMR與臨床病理特征的相關性，筆者收集了1 922例散發(fā)性腸癌患者資料，分析散發(fā)性左、右半腸癌dMMR狀態(tài)與臨床病理特征的關聯(lián)。

1 對象與方法

1.1 實驗對象

收集昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2014年1月至2019年9月共計2 343例所有散發(fā)性腸癌患者資料，其中1 922例符合入組標準。散發(fā)性右半腸癌患者占23.99%，散發(fā)性左半腸癌患者占76.01%。男女比例為1.43：1；中位年齡62歲；CEA＜5 ng/mL占61.34%，CEA≥5 ng/mL占38.66%；中位腫瘤直徑為4 cm；病理類型：普通腺癌89.07%，粘液腺癌2.86%，混合腺癌（普通腺癌+粘液腺癌）8.07%；腫瘤分化程度：高分化腫瘤14.62%；中高分化腫瘤31.01%；中分化腫瘤42.09%；中低分化腫瘤6.71%，低分化腫瘤2.81%，未分化腫瘤2.76%；pT分期：pT1～T2者24.14%，pT3～T4者75.86%；淋巴結轉(zhuǎn)移者40.48%，淋巴結未轉(zhuǎn)移者59.52%，UICC分期：I～II期者57.54%，III～IV期者42.46%，淋巴結數(shù)目＜12個28.93%，淋巴結數(shù)目≥12個71.07%，遠處轉(zhuǎn)移5.78%，無遠處轉(zhuǎn)移94.22%，脈管侵犯者21.75%，無脈管侵犯者78.25%，神經(jīng)侵犯者39.33%，無神經(jīng)侵犯者60.67%，見表1。本研究為單中心臨床回顧性研究，經(jīng)倫理委員會批準，豁免簽署病人知情同意書。

1.2 納入與排除標準

本研究篩選流程見圖1，納入及排除標準[10,13]如下：

納入標準：（1）經(jīng)手術切除病理學證實為腺癌的散發(fā)性腸癌；（2）臨床病理信息完善者。

排除標準：（1）經(jīng)手術切除病理學證實為非腺癌的腸癌；（2）遺傳性腸癌（家族性腺瘤性息肉病、Lynch綜合征及其他類型遺傳性腸癌）；（3）異時性或同時性多重癌；（4）術前接受新輔助治療者[14]；（5）臨床病理信息不全者。

1.3 觀測指標

本研究以脾曲為界，近端為右半結腸，遠端為左半結直腸。分別在散發(fā)性左、右半腸癌中收集錯配修復蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）、性別、年齡、體重指數(shù)（BMI）、民族、血型、術前CEA水平、腫瘤部位、病理類型、腫瘤分化程度、腫瘤直徑、pT分期、pN分期、淋巴結檢出數(shù)目、遠處轉(zhuǎn)移、UICC分期、脈管侵犯（+）、神經(jīng)侵犯（+）共18項臨床病理數(shù)據(jù)。

1.4 MMR檢測

1.4.1 MMR檢測方法所有標本均經(jīng) 10% 中性甲醛液固定、石蠟包埋、HE 染色。免疫組化采用 Max Vision 二步法，石蠟切片脫蠟、水化后PBS 沖洗，過氧化物酶阻斷劑封閉內(nèi)源性過氧化酶活性，加入一抗，室溫孵育，加生物素標記的二抗，加鏈霉素抗生物素的過氧化酶溶液，孵育后滴加 DAB 顯色，蘇木素復染，常規(guī)脫水，透明，封片。一抗為MSH2、MSH6、MLH1及PMS2，抗體及所用免疫組化試劑均購于中國福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.4.2 MMR結果判定4種蛋白的判斷標準一致[15-16]，結果由2名資深病理醫(yī)師雙盲獨立觀察評估。4種蛋白陽性表達均位于細胞核中，呈棕褐色；以正常上皮細胞或淋巴細胞作為陽性內(nèi)對照，4個錯配修復蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PMS2）均陽性表達時可判定為錯配修復蛋白功能完整（proficient mismatch repair，pMMR）；4種蛋白中任意一個或幾個出現(xiàn)表達缺失時，判定為錯配修復蛋白功能缺失（deficient mismatch repair，dMMR）。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析；計數(shù)資料采用率（%）表示，各項臨床病理因素與錯配蛋白表達之間的單因素分析選用χ2檢驗或Fisher確切概率法；多因素分析采用二元Logistic回歸模型，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 1 922例散發(fā)性腸癌錯配修復蛋白功能缺失情況

1 922例患者dMMR率為23.47%，右半腸癌dMMR率38.83%；左半腸癌dMMR率18.62%。其中MLH1、MSH2、MSH6及PMS2分別單獨表達缺失者分別為46例（2.39%）、18例（0.94%）、14例（0.73%）及146例（7.60%），MLH1與PMS2共同缺失者131例（6.82%），MSH2與MSH6共同缺失者23例（1.20%），4 種蛋白共同缺失者11例（0.57%），其他形式蛋白缺失者62例（3.23%），見圖2，表2。

表2 1922例散發(fā)性腸癌dMMR表型情況[n（%）]Tab.2 Different dMMR phenotype of all patients with sporadic colorectal cancer in the cohort [n（%）]

圖2 4種蛋白（MLH1、MSH2、MSH6、PSM2）表達情況及陽性對照Fig.2 Representative IHC results on mismatch repair proteins（MLH1，MSH2，MSH6 and PSM2）in colon cancer（Magnification，x400）.

2.2 1 922例散發(fā)性腸癌dMMR與臨床病理特征的關系

在1 922例散發(fā)性腸癌中，dMMR與臨床病理特征的單因素分析結果提示，dMMR與年齡，腫瘤直徑，分化程度、腫瘤部位、病理類型、神經(jīng)侵犯、淋巴結檢出數(shù)目及UICC分期相關，見表1；多因素分析結果提示，dMMR更多見于年齡＜62歲，右半結腸癌、腫瘤直徑≥4 cm、中低分化、低分化及未分化、UICC分期為I～II期及無神經(jīng)侵犯者，見表3。

表3 1922例散發(fā)性腸癌dMMR與臨床病理特征的多因素分析Tab.3 Multivariate results of the relationship between dMMR status and clinicopathological features of all patients with sporadic colorectal cancer in the cohort

2.3 461例散發(fā)性右半腸癌dMMR與臨床病理特征的關系

在461例散發(fā)性右半腸癌中，dMMR與臨床病理特征的單因素分析結果提示，dMMR與年齡，腫瘤浸潤深度相關，見表4；其中本研究的散發(fā)性右半腸癌的卡方分析發(fā)現(xiàn)，不論腫瘤直徑如何，其與dMMR不相關（P=0.074），但既往文獻[17]及本研究中所有腸癌的dMMR與腫瘤直徑存在相關性，將其與年齡，腫瘤浸潤深度進行多因素分析發(fā)現(xiàn)，散發(fā)性右半腸癌中dMMR更多見于年齡 ＜62歲，pT1～T2，腫瘤直徑≥4 cm者，見表5。

表4 461例散發(fā)性右半腸癌MMR與臨床病理特征的關系[n（%）]Tab.4 Relationship between different MMR status and clinicopathological characteristics of the 461 patients with right-side colon cancer in the cohort [n（%）]

續(xù)表4

表5 461例散發(fā)性右半腸癌dMMR與臨床病理特征的多因素分析Tab.5 Multivariate results of the relationship between dMMR status and clinicopathological features of the 461 patients with right-side colon cancer

2.4 1 461例散發(fā)性左半腸癌dMMR與臨床病理特征的關系

在1 461例散發(fā)性左半腸癌中，dMMR與臨床病理特征的單因素分析結果提示，dMMR與年齡，腫瘤分化程度，腫瘤直徑，檢出淋巴結數(shù)目，有無神經(jīng)侵犯有關，見表6；多因素結果分析提示，散發(fā)性左半腸癌中dMMR更多見于年齡＜62歲，腫瘤直徑≥4 cm及無神經(jīng)侵犯者，見表7。

表6 1 461例散發(fā)性左半腸癌MMR與臨床病理特征的關系 [n（%）]Tab.6 Relationship between different MMR status and clinicopathological characteristics of the 1 461 patients with left-side colon cancers in the cohort [n（%）]

續(xù)表6

表7 1 461例散發(fā)性左半腸癌dMMR與臨床病理特征的多因素分析Tab.7 Multivariate results of the relationship between dMMR status and clinicopathological features of the 1 461 patients with left-side colon cancer

3 討論

結直腸癌中，dMMR與年輕、右半結腸、腫瘤直徑更大、檢出淋巴數(shù)目更多以及病理分期等臨床病理因素有關[10]。由于左、右半腸癌在流行病學、病理、細胞遺傳及分子特征等方面存在明顯的差異，1990年，Bufill[18]提出近端和遠端結直腸癌即左右半結腸癌是兩種截然不同的腫瘤，然而，在散發(fā)性左、右半腸癌中，dMMR與上述結論是否一致目前未知；本研究以橫結腸脾曲為界，在散發(fā)性左、右半腸癌中分別分析dMMR與不同臨床病理特征的相關性。

在本研究中，所有散發(fā)性腸癌患者dMMR更多見于年齡＜62歲，右半腸癌、腫瘤直徑≥4 cm、中低分化、低分化及未分化、UICC分期為Ⅰ～Ⅱ期、無神經(jīng)侵犯者，這與既往報道基本一致[5,19]。在散發(fā)性右半腸癌中，dMMR與年齡，pT以及腫瘤直徑相關；在散發(fā)性左半腸癌中，dMMR與年齡，腫瘤直徑以及無神經(jīng)侵犯者相關，見圖3。

圖3 散發(fā)性左、右半腸癌dMMR狀態(tài)與臨床病理特征的關系Fig.3 Association of mismatch repair deficiency and clinicopathological parameters in patients with left-side and right-side sporadic colon cancer

在本研究中，1922例散發(fā)性腸癌的dMMR率為23.46%。國外dMMR率相對較低為8.4%[20]，但高者可達34%[21]，而國內(nèi)的不同地區(qū)dMMR率（7.8%～17.9%）也不盡相同[13,14,22,23]。上述結果提示，在不同人種以及不同地區(qū)的dMMR率存在差異，本研究的dMMR率相對較高可能與以下因素相關：（1）人種的不同導致錯配修復蛋白的表達不盡相同；（2）地域環(huán)境的差異導致錯配修復蛋白的表達存在差異；（3）雖然錯配修復蛋白缺失的判斷標準統(tǒng)一，但解釋結果存在一定主觀性，可能存在偏倚[24]。

在本研究的散發(fā)性右半腸癌中，右半腸癌的dMMR率為38.83%。通過多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，在散發(fā)性右半腸癌中，dMMR多見于年齡＜62歲，腫瘤直徑≥4 cm者以及pT1～T2者。除了年齡及腫瘤直徑這兩個因素以外，本研究首次發(fā)現(xiàn)，在散發(fā)性右半腸癌中的pT1～T2者（P=0.000，OR=3.778）較高頻率出現(xiàn)dMMR。與左半腸癌不同的是，散發(fā)性右半腸癌患者大體類型多為腫塊型，局部浸潤層次較淺，從本研究數(shù)據(jù)來看，散發(fā)性右半腸癌中T1～T2的患者共54例，其中dMMR者33例，占比61.11%相對較高，此外散發(fā)性右半腸癌多數(shù)由絨毛狀腺瘤發(fā)展而來，這也提示對于腺瘤癌變者，其dMMR率相對較高。

在散發(fā)性左半腸癌中，左半腸癌dMMR率18.62%。本研究首次發(fā)現(xiàn)，在左半腸癌中，dMMR更多見于無神經(jīng)侵犯者（OR=1.454，P=0.009）。在本研究中，散發(fā)性左半腸癌無神經(jīng)侵犯者共891例，其中dMMR表型者181例，占比20.31%，對于本研究中首次發(fā)現(xiàn)的dMMR更多見于無神經(jīng)侵犯者，需擴大樣本進行驗證，相關機制需后續(xù)試驗進一步探討。

綜上所述，在散發(fā)性腸癌中，不論腫瘤部位如何，dMMR均與年齡＜62歲，腫瘤直徑≥4 cm存在相關關系；然而，本研究發(fā)現(xiàn)，散發(fā)性左、右半腸癌dMMR表型分別與神經(jīng)侵犯（-）及pT1～T2分期相關。

本研究為單中心回顧性研究；由于潛在的局限性，不可避免的產(chǎn)生偏倚；缺少預后數(shù)據(jù)；本研究樣本量較小，需更大樣本量、多中心、前瞻性研究進一步佐證。