CYP11B2基因-344C/T多態(tài)與云南雙河鄉(xiāng)彝族人群原發(fā)性高血壓的相關(guān)性

彭紅瑜，范志祥，張延潔，舒 芯，張馥麟，龍 莉

（昆明醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)系，云南 昆明 650500）

原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）是一種受到遺傳與環(huán)境雙重作用的多因素復(fù)雜疾病，目前其發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。在中國(guó)，臨床上90%以上的高血壓患者為原發(fā)性高血壓，具體臨床表現(xiàn)為頭暈乏力、失眠健忘等[2]，原發(fā)性高血壓是導(dǎo)致心、腦血管病和腎衰竭的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)人類健康與社會(huì)生活造成了極大威脅[3]。經(jīng)過(guò)抽樣調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)生活的同一民族，同一地區(qū)生活的不同民族間會(huì)表現(xiàn)出高血壓標(biāo)化患病率的差異[4]。早在1981年已有研究證實(shí)涼山彝族的血壓水平可能是全國(guó)甚至全球最低的，其血壓幾乎不隨年齡增加而上漲[5]，本研究以云南省晉寧縣雙河鄉(xiāng)彝族居民為研究對(duì)象，探究了高血壓的重要候選基因—醛固酮合成酶（CYP11B2）基因-344C/T位點(diǎn)多態(tài)性是否與該地區(qū)彝族原發(fā)性高血壓易感性相關(guān)，為我國(guó)少數(shù)民族高血壓防治及研究CYP11B2基因在高血壓中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

在云南省昆明市晉寧縣雙河鄉(xiāng)本地彝族居民中隨機(jī)抽取267例健康者與132例原發(fā)性高血壓患者，年齡分布在29～88歲之間。EH組診斷標(biāo)準(zhǔn)為：收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒張壓≥90 mmHg，不同時(shí)間點(diǎn)診斷3次異常[6]；對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)為：收縮壓＜140 mmHg，舒張壓＜90 mmHg。EH組與對(duì)照組中排除繼發(fā)性高血壓，心肌梗死，先天性心臟病，持續(xù)性房顫等心血管病，排除糖尿病、肝腎功能異常者，EH組入選男性52名，女性80名，共計(jì)132名，對(duì)照組入選男性75名，女性101名，共計(jì)176名。本次實(shí)驗(yàn)已獲得昆明醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，對(duì)本次調(diào)查所有參與者均已知情并同意。

1.2 研究方法

收集所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象身高、體重、腰圍、臀圍、收縮壓、舒張壓等臨床數(shù)據(jù)，計(jì)算體重指數(shù)（BMI）=體重/身高2（kg/m2），腰臀比（WHR）=腰圍（cm）/臀圍（cm），脈壓指數(shù)（PPI）=（收縮壓-舒張壓）/收縮壓，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

采集受試者外周血，酚-氯仿法提取基因組DNA，分組編號(hào)后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎肞CR-RFLP技術(shù)以不同樣本DNA為模板配制20 μL PCR體系，引物序列如下：F：5′-CAGGA GGAGACCCCATGTGAC-3′；R：5′-CCTCCACCC TGTTCAGCCC-3′（北京擎科生物科技公司合成）。PCR儀循環(huán)條件為：98 ℃，2 min；98 ℃，15 s；58 ℃，15 s；72 ℃，30 s，共38個(gè)循環(huán)；最后72 ℃，2 min，4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，GelRed（北京擎科生物科技）染色后有目的條帶則繼續(xù)用Hae III（Thermo Fisher Scientific）內(nèi)切酶酶切，37 ℃水浴4 h，確保DNA片段被完全切開，4%瓊脂糖凝膠電泳分離條帶，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，Image-Lab軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

分別計(jì)算EH組與對(duì)照組CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。χ2檢驗(yàn)檢測(cè)哈迪·溫伯格遺傳平衡、組間基因型頻率及等位基因頻率；計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料比較

與對(duì)照組相比，EH組中人群年齡及性別分布均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。EH組人群體重指數(shù)，脈壓指數(shù)均高于對(duì)照組，腰臀圍比值則低于對(duì)照組（P＜0.05），EH組為實(shí)驗(yàn)組，見表1。

表1 EH組和對(duì)照組一般臨床資料比較（）Tab.1 Comparison of the general clinical data between EH group and control group（）

表1 EH組和對(duì)照組一般臨床資料比較（）Tab.1 Comparison of the general clinical data between EH group and control group（）

*P＜0.05。

2.2 CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)基因型鑒定

PCR產(chǎn)物電泳后得到長(zhǎng)為537 bp的目的片段（圖1），有目的條帶的產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶HaeIII酶切后，等位基因T產(chǎn)生273 bp片段，當(dāng)T和C發(fā)生互換時(shí)會(huì)產(chǎn)生酶切位點(diǎn)，酶切產(chǎn)生202 bp和71 bp兩條帶，故 TT基因型會(huì)產(chǎn)生273 bp，138 bp，126 bp 3個(gè)片段，CT型會(huì)產(chǎn)生273 bp，202 bp，138 bp，126 bp和71 bp共5個(gè)片段，CC型會(huì)產(chǎn)生202 bp，138 bp，126 bp和71 bp共4個(gè)片段，由此可以鑒定出所有基因型。但71 bp片段過(guò)小很難被瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)到，故膠圖中無(wú)法觀察到71 bp條帶，見圖2。

圖1 CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)PCR產(chǎn)物Fig.1 PCR product of CYP11B2-344C/T

圖2 CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)不同基因型Fig.2 Different genotype of CYP11B2-344C/T

2.3 CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)多態(tài)性在彝族EH組與對(duì)照組中的分布比較

EH組與對(duì)照組CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)多態(tài)性分布（χ2=0.655，P=0.721；χ2=0.458，P=0.795）均符合哈迪溫伯格遺傳平衡，具有群體代表性。在云南彝族EH組與對(duì)照組人群中分別統(tǒng)計(jì)CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)基因型頻率、基因頻率，2組的比較結(jié)果如表2所示?？傮w而言，EH組與對(duì)照組基因型TT，CT，CC的分布頻率較接近，等位基因T頻率與等位基因C頻率差異不大（P＞0.05）。在男性中，EH患者較對(duì)照組基因型頻率與等位基因頻率差異不大（P＞0.05）；在女性EH患者中，基因型TT頻率高于對(duì)照組（P＜0.05），但基因型CT、CC及等位基因頻率與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表2 CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)基因型頻率在EH組與對(duì)照組人群中的分布[n（%）]Tab.2 CYP11B2-344C/T genotype frequency in control group and EH group [n（%）]

2.4 CYP11B2基因-344C/T多態(tài)性在彝族不同性別人群中的分布

CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)多態(tài)在彝族正常人群中不存在性別差異（P＞0.05），而其在EH組人群中分布結(jié)果如下，在132例受試者中，TT，CT，CC基因型頻率分別為64.39%，29.55%，6.06%，等位基因T、C頻率為79.17%，20.83%。在不同性別的患者中，基因型頻率和基因頻率顯著不同，其中女性患者TT基因型頻率為70.00%，高于男性患者的55.77%，女性患者基因型CC的頻率為2.50%，低于男性的11.54%（P＜0.05），女性EH患者對(duì)比男性患者等位基因T分布頻率較高，等位基因C分布頻率較低（P＜0.05），存在性別差異，見表3。

表3 CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)多態(tài)性在彝族EH患者中的分布[n（%）]Tab.3 CYP11B2-344C/T polymorphism in YI population of EH group [n（%）]

3 討論

原發(fā)性高血壓是遺傳因素和環(huán)境因素共同決定的復(fù)雜疾病，其中遺傳因素在原發(fā)性高血壓的發(fā)病中約占76%[7]。識(shí)別原發(fā)性高血壓的易感基因，不僅有利于闡明原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制，還講對(duì)該病的治療、預(yù)后判斷、早期檢出以及預(yù)防等產(chǎn)生重大影響。目前已知的原發(fā)性高血壓的候選基因涉及腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、交感神經(jīng)系統(tǒng)、水鹽代謝等[4]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，包括血管緊張素原（angiotensinogen，AGT）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）和醛固酮合成酶（cytochrome P450 family 11 subfamily B member 2，CYP11B2）等維持機(jī)體鈉穩(wěn)態(tài)和血壓平衡的關(guān)鍵因子，參與血壓調(diào)節(jié)。CYP11B2基因?qū)儆诩?xì)胞色素 P450 基因超家族，定位于8q22，總長(zhǎng)約為7 kb，含八個(gè)內(nèi)含子和九個(gè)外顯子，編碼蛋白醛固酮合成酶，該酶可催化脫氧皮質(zhì)酮逐步生成皮質(zhì)酮、18-羥皮質(zhì)酮和醛固酮[8]，是醛固酮合成系統(tǒng)的關(guān)鍵限速酶。-344C/T變異位于CYP11B2 基因順式作用元件SF-1因子結(jié)合區(qū)，等位基因C與SF-1因子結(jié)合的能力明顯強(qiáng)于T等位基因，該變異可影響醛固酮的合成分泌[9]，而醛固酮增多會(huì)引發(fā)血壓升高等疾病[10-13]。在我國(guó)黑龍江省漢族人群，延邊自治州朝鮮族人群，內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙古族人群中均發(fā)現(xiàn)CYP11B2基因-344位點(diǎn)C/T突變會(huì)增加高血壓的患病風(fēng)險(xiǎn)[14-17]。

但是本研究發(fā)現(xiàn)CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)多態(tài)與中國(guó)云南彝族人原發(fā)性高血壓不相關(guān)，推測(cè)原因可能有兩點(diǎn)：（1）由于不同地區(qū)、不同民族生活習(xí)俗，經(jīng)濟(jì)文化和遺傳背景的差異，歷年來(lái)高血壓流行病學(xué)普查資料及各項(xiàng)研究均顯示，各民族高血壓患病率及易感基因存在明顯差異[18]，也有研究證實(shí)CYP11B2基因-344C/T多態(tài)與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性存在民族、種族特異性，例如CYP11B2基因-344C/T多態(tài)與中國(guó)山東漢族人群原發(fā)性高血壓相關(guān)，但與懷化侗族人群原發(fā)性高血壓不相關(guān)[19-20]；在葡萄牙人群中發(fā)現(xiàn)，CYP11B2基因-344T等位基因頻率與原發(fā)性高血壓不相關(guān)，而在埃及人群中則表現(xiàn)出相關(guān)性[21-22]。（2）單基因單突變位點(diǎn)相關(guān)性分析無(wú)意義，不能代表該基因與高血壓完全不相關(guān)，在中國(guó)福建漢族人群中，CYP11B2基因-344C/T多態(tài)與該地區(qū)漢族原發(fā)性高血壓無(wú)關(guān)，但與ACE，ADDUCIN基因多態(tài)聯(lián)合分析則有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[23]。CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)突變與印度人群高血壓風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，聯(lián)合CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)突變、2號(hào)內(nèi)含子轉(zhuǎn)換突變以及3號(hào)外顯子K173R多態(tài)協(xié)同分析則與該地區(qū)人群高血壓易感性相關(guān)[24]，提示原發(fā)性高血壓發(fā)病因素復(fù)雜，單一基因分析無(wú)差異可能是因?yàn)樵l(fā)性高血壓是由多種基因協(xié)同調(diào)控，單個(gè)基因的突變位點(diǎn)并不唯一，多位點(diǎn)突變也可能共同影響疾病的發(fā)生發(fā)展。

本研究還發(fā)現(xiàn)，女性高血壓患者基因型TT分布頻率高于對(duì)照組，且在EH組人群中CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)多態(tài)性表現(xiàn)出了性別差異，而對(duì)照組中則沒有性別差異。這與之前的一些研究類似，2011年，杜志榮等[3]發(fā)現(xiàn)CYP11B2基因-344C/T位點(diǎn)多態(tài)與新疆哈薩克族人原發(fā)性高血壓患病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)，但C-344T可能增加男性患病風(fēng)險(xiǎn)；牛文全等[25]在北方漢族人群中發(fā)現(xiàn)CYP11B2基因多態(tài)與女性高血壓患者易感性相關(guān)，但不影響整體漢族人群高血壓易感性；徐新娟等[26]發(fā)現(xiàn)CYP11B2基因-344C/T多態(tài)性可能與新疆巴里坤哈薩克族女性高血壓有關(guān)，但群體相關(guān)分析結(jié)果無(wú)差異。在筆者的研究中，云南彝族女性高血壓患者中，CYP11B2基因-344位點(diǎn)C被替換為T的概率更高，而男性患者CYP11B2基因則相對(duì)保守。CYP11B2基因在原發(fā)性高血壓與性別之間的聯(lián)系目前尚無(wú)定論，有研究認(rèn)為Y染色體上存在一個(gè)或多個(gè)與男性血壓相關(guān)的位點(diǎn)，CYP11B2基因多態(tài)可能與Y染色體上的相關(guān)位點(diǎn)互作引起血壓升高[27]，也有研究指出CYP11B2基因-344C/T多態(tài)性與高血壓性別特異性的關(guān)聯(lián)可能與SF-1位點(diǎn)與雌激素相關(guān)受體（ERRa）連接作用有關(guān)[28]。

除上述結(jié)果外，本研究還發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的體重指數(shù)、脈壓指數(shù)均顯著低于EH組人群，而腰臀圍比值則高于EH組（P＜0.05），說(shuō)明肥胖可能是引發(fā)彝族人群原發(fā)性高血壓的原因之一，但腰腹部脂肪堆積可能不是云南彝族人群原發(fā)性高血壓發(fā)病的主要誘因。肥胖可以引發(fā)血壓升高等多種疾病已被證實(shí)[29]，但腰腹部脂肪堆積對(duì)高血壓發(fā)病的影響尚未可知，該結(jié)果仍需擴(kuò)大樣本量后繼續(xù)驗(yàn)證。原發(fā)性高血壓更深入的機(jī)制還有待挖掘，下一步筆者將繼續(xù)收集樣本，擴(kuò)大研究群體，做上下游多基因，多突變位點(diǎn)聯(lián)合分析，為研究原發(fā)性高血壓的遺傳因素與高血壓防治提供實(shí)驗(yàn)資料。