基于MRM-IDA-EPI技術(shù)篩查豬尿中4種β-受體激素殘留

湯逸飛，屠雨晨，陳欣慰，黃 芳，張國平

（嘉興市農(nóng)業(yè)綜合檢驗檢測中心，浙江 嘉興 3140501）

在我國，克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林等β受體激素已被禁止使用[1]。當(dāng)高劑量使用這類β受體激素時，雖然隱形添加可顯著提高豬或其他家畜體質(zhì)量以及酮體瘦肉率，但其殘留物很容易通過食物鏈進(jìn)入人體進(jìn)而危害健康[2]。本研究以豬尿為例，結(jié)合快速前處理和超高效液相分離（QuEChERS-UPLC）方法，首次檢測端采用多反應(yīng)監(jiān)測-信息依賴-增強型質(zhì)譜掃描（MRM-IDA-EPI）技術(shù)靶向同步對4種β受體激素的離子對和碎片離子信息進(jìn)行識別和分析，降低了豬尿的基質(zhì)效應(yīng)對低含量化合物檢出的影響，可快速準(zhǔn)確地完成對化合物的識別[3]，為豬肉產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管和溯源提供有力的技術(shù)支撐[4]。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器包括液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-20AD/QTRAP4500，日本島津公司/美國AB Sciex公司）、ROTINA 420R離心機(jī)（德國Hettich公司）和XW-80A旋渦混合器（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；提取鹽試劑包成分為4.0 g硫酸鎂，1.0 g氯化鎂，1.0 g檸檬酸鈉，0.5 g檸檬酸氫二鈉；凈化離心管成分為150 mg N-丙基乙二胺（PSA），15 mg石墨化炭黑（GCB），885 mg硫酸鎂?？藗愄亓_、萊克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林均為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；乙腈和甲醇均為色譜級；實驗用水為超純水。

1.2 試驗方法

QuEChERS-UPLC條件:量取豬尿10.0 mL，加入10 mL乙腈溶液，加入提取鹽試劑包，加入1枚陶瓷均質(zhì)子，振搖1 min，4 200 rpm，離心5 min。取上清提取液6.0 mL，轉(zhuǎn)移到凈化離心管中，渦旋1 min，4 200 rpm，離心5 min。取上清凈化液2 mL，氮吹至近干，初始流動相（A:B=95:5）溶液復(fù)溶至1.0 mL，0.22μm水膜過濾待測液。色譜柱采用Kinetex Biphenyl柱（2.6μm，2.1 mm×100 mm），流動相A為A（0.2%甲酸+2 mmol/L乙酸銨水溶液），B為甲醇，流速0.5 mL/min，柱溫40℃，進(jìn)待測液1μL。流動相梯度條件為0.1～1.0 min，A:B=95:5；1～4 min，A:B=95:5→40:60；4～8 min，A:B=40:60→36:64；A:B=5:95保持5 min洗柱；A:B=95:5保持5 min平衡。

MRM-IDA-EPI條件:在MRM模式下，正離子電噴霧離子源（ESI+）設(shè)定源參數(shù)為噴霧電壓（Ion－Spray Voltage）5500 V，輔助氣1（GS1）55 Arb，輔助氣2（GS2）55 Arb，輔助氣加熱溫度（TEM）550℃，氣簾氣（CUR）35 Arb，碰撞氣（CAD）Medium；β-受體激素監(jiān)測離子對（MRM）解簇電壓（DP），碰撞能量（CE）見表1。在相應(yīng)IDA-EPI模式下，對在離子對響應(yīng)值超過500 cps的進(jìn)行EPI質(zhì)譜掃描，EPI掃描范圍m/z50～600，碰撞氣（CAD）Low，掃描速率10000Da/s，解簇電壓（DP）100 V，碰撞能量（CE）10 eV，其他參數(shù)與MRM模式設(shè)定一致。

表1 4種β-受體激素在甲醇溶劑中的質(zhì)量分析參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 空白豬尿基質(zhì)對數(shù)據(jù)分析的影響

為充分體現(xiàn)豬尿檢測中可能存在的假陽性，對提取離子流色譜圖（XIC）進(jìn)行篩查。XIC結(jié)果表明，空白豬尿基質(zhì)對提取-凈化試劑包組合不會產(chǎn)生假陽性。根據(jù)在豬尿加標(biāo)基質(zhì)中峰形良好，沒有雜峰干擾并且響應(yīng)較大的離子對為定量離子對。豬尿基質(zhì)中4種β-受體激素相應(yīng)離子對的離子流（TIC）如圖1所示，其中圖中編號為表1中對應(yīng)的4種β-受體激素。

圖1 豬尿基質(zhì)中4種β-受體激素的總離子流

2.2 結(jié)構(gòu)解析

在正離子模式下，對4種β-受體激素離子對進(jìn)行+MRM-IDA-EPI分析，4種β-受體激素可被準(zhǔn)確識別，見圖2。該圖中的化合物編號與豬尿中鑒定的相關(guān)信息與化合物的編號相一致，見表2。4種β-受體激素碎片離子雖然受到豬尿基質(zhì)影響會出現(xiàn)一些不相關(guān)信號，但與文獻(xiàn)[5]比較，質(zhì)譜裂解規(guī)律呈現(xiàn)的[M+H]+等特征碎片離子均已識別。

表2 豬尿中MRM-IDA-EPI鑒定的4種β-受體激素相關(guān)信息

圖2 豬尿中4種β-受體激素定量離子對所對應(yīng)的XIC圖和EPI圖

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，將配制的0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L和50μg/L系列質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4種β-受體激素線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）、檢出限（LOD，信噪比S/N≥3）和定量限（LOQ，信噪比S/N≥10）見表3。結(jié)果表明，4種β-受體激素在豬尿中0.5～50μg/L的線性范圍良好，相關(guān)系數(shù)r在0.985～0.994之間，檢出限在0.07～0.13 ng/mL之間，定量限在0.24～0.44 ng/mL之間。

表3 4種β-受體激素在豬尿中的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

2.4 回收率試驗

采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對加標(biāo)量分別為0.5 ng/mL，5 ng/mL和50 ng/mL的豬尿空白基質(zhì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗。低質(zhì)量濃度（0.5 ng/mL）p%范圍為74.12%～112.80%，RSD%為1.75%～14.38%；中質(zhì)量濃度（5ng/mL）p%范圍為73.67%～109.33%，RSD%為0.63%～6.70%；高質(zhì)量濃度（50 ng/mL）p%范圍為62.11%～108.45%，RSD%為0.95%～14.35%。結(jié)果表明，該檢測方法準(zhǔn)確度較好。

表4 4種β-受體激素在豬尿基質(zhì)中的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

3 討論和小結(jié)

豬尿中定量檢測β-受體激素殘留是比較常規(guī)的檢測項目，以往檢測僅通過出峰的保留時間（RT）判定陽性，往往容易發(fā)生假陽性的情況。本研究建立的方法主要特點是以QuEChERS-UPLC技術(shù)為基礎(chǔ)，在+MRM-IDA-EPI模式下，既相對滿足基質(zhì)外標(biāo)法定量的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度的要求，又可同步通過EPI結(jié)構(gòu)解析，復(fù)核4種β-受體激素[M+H]+等特征碎片離子的檢出。該方法可用于豬尿中4種β-受體激素的快速篩查測定，具備農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第197號-10-2019相似樣品制備和檢測靈敏度的特點。