種植密度對轉Bt棉纖維殺蟲蛋白表達量及氮代謝的影響

陳媛, 劉震宇, 周明園, 張晨霞, 田巧鳳, 張中寧, 張祥, 陳德華

(揚州大學江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室， 糧食作物現(xiàn)代產業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇 揚州 225009)

蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)轉基因棉花自20世紀90年代中期首次商業(yè)化推廣以來，已在世界范圍內廣泛種植。Bt棉的應用減少了化學藥品的使用，從而減輕了環(huán)境污染，提高了安全性，同時殺蟲劑和農藥的減少降低了種植者的生產成本[1]。然而，在世界各地的棉花產區(qū)，Bt棉抗蟲性會表現(xiàn)出下降或不穩(wěn)定的情況[2]。研究表明，Bt棉殺蟲蛋白的表達存在時空分布差異。在時間上表現(xiàn)為隨生育進程表達量逐漸下降，即苗期抗蟲性強，鈴期抗蟲性弱；對第2代棉鈴蟲抗性較高，但對第3、第4代棉鈴蟲的抗性顯著下降[3]。在空間上表現(xiàn)為不同部位、不同器官的抗蟲性存在差異，其中最重要的表現(xiàn)特征為生殖器官的抗蟲性明顯低于葉片[2]。除時空差異特征外，多種環(huán)境因素對Bt棉Bt蛋白的表達量均有影響。土壤干旱和澇漬顯著降低棉株各器官的Bt蛋白表達量，其中又以干旱對Bt蛋白表達量的影響更大[4-7]。土壤鹽分脅迫顯著降低Bt蛋白表達量和Bt棉的抗蟲性[8-10]。高溫會使bt基因的沉默時間提前，Bt蛋白表達降低的時間也相應提前，導致Bt蛋白含量急劇降低[11-13]?？諝鉂穸让{迫同樣會導致Bt蛋白表達量急劇降低，并且會進一步加劇溫度脅迫對Bt蛋白含量的影響[14-15]。因此，在Bt抗蟲棉生產中如何協(xié)調好各方面因素，充分發(fā)揮其抗蟲潛力，對提高棉花生產的總體效益具有重要意義。

種植密度作為一種易于調控的栽培措施，改變種植密度會直接影響到棉花的個體發(fā)育和群體構成，從而影響產量及其構成因素，如鈴重和鈴數(shù)等[16-18]。研究表明，種植密度對Bt 棉蕾中Bt蛋白的表達量具有顯著影響，表現(xiàn)為在高密度下棉蕾中Bt蛋白表達量上升[19]。然而，種植密度對棉鈴中Bt蛋白表達量的影響卻鮮少報道。棉鈴作為棉鈴蟲等相關害蟲危害的首選對象之一，也是棉花栽培的產量對象，其Bt蛋白表達量的多少更能反映Bt棉抗蟲性的強弱。因此，開展種植密度對棉鈴抗蟲性的研究，明確Bt棉抗蟲性受密度的影響程度及其機理，從而解決Bt棉產量形成關鍵期對棉鈴蟲毒殺作用低，影響生殖器官發(fā)育的問題，對提高抗蟲棉產量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗于2015—2016年在揚州大學農學院試驗田(N 32.39°，E 119.42°)進行，以具有相同遺傳背景的Bt棉常規(guī)種泗抗1號(SK-1)和雜交種泗抗3號(SK-3)為試驗材料。采用穴盤育苗移栽方式，分別于2015年4月6日播種，5月19日移栽大田；2016年4月9日播種，5月17日移栽大田?；┑?60 kg·hm-2純氮)、磷肥(300 kg·hm-2過磷酸鈣)和鉀肥(120 kg·hm-2KCl)；在初花期追施氮肥(54 kg·hm-2純氮)、磷肥(300 kg·hm-2過磷酸鈣)和鉀肥(120 kg·hm-2KCl)；在成鈴初期和盛鈴期再次分別追施氮肥126和30 kg·hm-2(純氮)。

設置1.5×104(D1)、3.0×104(D2)、4.5×104(D3)、6.0×104(D4)和7.5×104(D5)株·hm-2五個種植密度，單因素隨機區(qū)組設計，重復3次。在開花時掛牌標記植株，分別于花后10 (10 DAF)、20(20 DAF)、30(30 DAF)和40(40 DAF) d，每小區(qū)取15個棉鈴，其中10個用于測定棉鈴干重和體積；5個經(jīng)液氮冷凍后貯存于-80 ℃冰箱中，用于測定Bt蛋白及氮代謝物含量和相關酶活性。

1.2 測定項目與方法

每個小區(qū)選取10株棉株調查單株鈴數(shù)，選取10個棉鈴調查單鈴體積及單鈴干重。采用將棉鈴浸入盛水的量筒，然后記錄量筒水位上升的方法測定棉鈴體積。將棉鈴置于烘箱中110 ℃殺青30 min，然后80 ℃烘干至恒重，用USA HZ&HUAZHI電子天平(HZT-A+100)測定棉鈴干重。

采用酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 測定Bt蛋白含量，試劑盒由中國農業(yè)大學提供，檢測方法見Chen等[20]。可溶性蛋白含量采用G-250考馬斯亮藍比色法[21]測定；游離氨基酸含量采用抗壞血酸茚三酮染色法[22]測定；鮮樣經(jīng)Tris-HCl緩沖液研磨離心后，采用賴氏比色法測定[23]谷氨酸丙酮酸轉氨酶(glutamic-pyuvic transaminase,GPT)和谷氨酸草酰乙酸轉氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase,GOT)活性；采用福林-酚試劑法[24]以產生酪蛋白含量表示蛋白酶活性；運用氨基酸的茚三酮反應[24]以吸光率的的變化值測定肽酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用 Microsoft Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用 SAS 9.4軟件進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和最小顯著差異法(LSD，P=0.05)比較不同處理間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 不同種植密度下棉鈴的發(fā)育情況

SK-1和SK-3兩個品種的單株鈴數(shù)、單鈴體積和干重均隨生育進程呈上升趨勢(表1)。隨著棉株的生長發(fā)育，單株鈴數(shù)、單鈴體積和干重不斷增加，同一密度下SK-1和SK-3在40 DAF的單株鈴數(shù)、單鈴體積、單鈴干重與10 DAF均呈顯著差異。然而，隨種植密度的增加，SK-1和SK-3兩個品種的單株鈴數(shù)、單鈴體積和干重在四個生育期均呈下降趨勢。同一生育期不同種植密度間,D5密度的單株鈴數(shù)、單鈴干重與D1密度呈顯著差異(表1)。由此可見,隨著種植密度的加大，單

株鈴數(shù)、單鈴體積和干重逐漸減少;同一時期相同種植密度時兩個品種間差異不顯著。

2.2 不同種植密度條件下棉纖維Bt蛋白表達量的變化

SK-1和SK-3兩個品種的纖維中Bt蛋白表達量隨生育進程呈增加趨勢(表2)。隨著棉株的生長發(fā)育，纖維中Bt蛋白表達量不斷增加，同一種植密度下SK-1在40 DAF的纖維中Bt蛋白表達量與10和20 DAF纖維中Bt蛋白表達量均呈顯著差異。然而，隨種植密度的增加，SK-1和SK-3兩個品種的Bt蛋白表達量在四個生育期均呈上升趨勢，同一生育期不同種植密度間D5密度的纖維中Bt蛋白表達量與D1密度呈顯著差異(表2)，即隨著種植密度的加大，纖維中Bt蛋白表達量逐漸增加。

表2 不同種植密度下纖維中Bt蛋白表達量Table 2 Expression levels of Bt protein in cotton fiber under different plant densities

2.3 不同密度條件下Bt棉纖維中氮代謝的變化

SK-1和SK-3兩個品種的纖維中可溶性蛋白含量和游離氨基酸含量均隨生育進程呈上升趨勢(表3)。隨著棉株的生長發(fā)育，纖維中可溶性蛋白含量和游離氨基酸含量不斷增加，SK-1和SK-3在同一種植密度下40 DAF纖維中可溶性蛋白含量與30、20和10 DAF可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)顯著差異；40 DAF纖維中游離氨基酸含量與20、10 DAF游離氨基酸含量呈顯著差異。然而，隨種植密度的增加，SK-1和SK-3纖維中可溶性蛋白含量在四個生育期均呈上升趨勢，纖維中游離氨基酸含量在四個生育期均呈下降趨勢，SK-1和SK-3在同一生育期不同種植密度下，D5密度下棉纖維中可溶性蛋白含量與D3、D2和D1密度下棉纖維中可溶性蛋白含量差異顯著；D1密度下SK-1纖維中游離氨基酸含量與D5密度下差異顯著(表3)。隨著種植密度的加大，纖維中可溶性蛋白含量逐漸增加，游離氨基酸含量逐漸減少。同一時期相同種植密度時兩個品種間差異不顯著。由此可見，適當提高種植密度有利于棉纖維中可溶性蛋白質的合成和積累，降低游離氨基酸含量。

表3 不同種植密度下棉纖維中可溶性蛋白含量和游離氨基酸含量Table 3 The contents of soluble protein and free amino acid content in cotton fiber under different plant densities

SK-1和SK-3纖維中GPT和GOT活性均隨生育進程呈上升趨勢(表4)，隨著棉株的生長發(fā)育，纖維中GPT和GOT活性不斷升高，SK-1和SK-3在同一種植密度下40 DAF纖維中GPT和GOT活性與10 DAF纖維中GPT和GOT活性均呈顯著差異。然而，隨種植密度的增加，SK-1和SK-3纖維中GPT和GOT活性在四個生育期均呈上升趨勢。SK-1在同一生育期不同種植密度下，D5密度下纖維中GPT和GOT活性與D2和D1密度下纖維中GPT活性差異顯著(表4)，隨著種植密度的加大，纖維中GPT和GOT活性均逐漸升高。由此可見，密度顯著影響纖維中GPT和GOT活性，適當提高棉花種植密度，可以提高纖維中GPT和GOT活性，有利于氨基酸與蛋白質的合成。

表4 不同種植密度下纖維中GPT和GOT活性Table 4 Activities of GPT and GOT in cotton fiber under different plant densities

SK-1和SK-3纖維中蛋白酶和肽酶活性均隨生育進程呈上升趨勢(表5)，隨著棉株的生長發(fā)育，纖維中蛋白酶和肽酶活性不斷升高。SK-1和SK-3在同一種植密度下，40 DAF纖維中的蛋白酶和肽酶活性與10 DAF纖維中蛋白酶和肽酶活性差異顯著。然而，隨種植密度的增加，SK-1和SK-3纖維中蛋白酶和肽酶活性在四個生育期均呈下降趨勢。同一時期不同種植密度相比較，D1密度下纖維中蛋白酶和肽酶活性與D4和D5密度下纖維中蛋白酶和肽酶活性呈顯著差異(表5)，隨著種植密度的加大，纖維中蛋白酶和肽酶活性均逐漸降低。由此可見，高密度的種植方式降低了纖維中蛋白酶和肽酶活性，從而降低了蛋白質的分解能力，提高了蛋白質含量，進而增強了抗蟲性。

表5 不同密度水平下纖維中蛋白酶和肽酶活性Table 5 Activities of protease and peptidase in cotton fiber under different plant densities

2.4 棉鈴Bt蛋白表達量與棉鈴生長系數(shù)、氮代謝的關系

棉纖維Bt蛋白表達量與棉鈴生長系數(shù)的相關分析表明(表6)，纖維中Bt蛋白表達量與單株鈴數(shù)、單鈴體積和單鈴干重呈極顯著負相關。由此說明棉纖維中Bt蛋白的表達與棉鈴的生長發(fā)育有極顯著的負相關關系，棉鈴太大、太多，均不利于棉纖維中Bt蛋白的表達。因此，在育種和栽培時需協(xié)調好棉鈴發(fā)育和Bt蛋白表達的關系。

表6 棉纖維Bt蛋白表達量與棉鈴生長系數(shù)的相關性Table 6 Correlation analysis between the content of Bt protein in fiber and parameters of boll growth

棉纖維Bt蛋白表達量與氮代謝主要物質含量和關鍵酶活性的相關分析(表7)表明，2個Bt棉品種纖維中Bt蛋白表達量與可溶性蛋白含量、GPT和GOT活性均呈極顯著正相關關系,與游離氨基酸含量、蛋白酶和肽酶活性呈極顯著負相關關系。由此可見，棉纖維中Bt蛋白含量的變化與氮代謝合成和分解過程密切相關，這也說明棉鈴成鈴強度和棉鈴大小的變化引起了棉鈴氮代謝的生理變化，從而導致 Bt 蛋白表達量的變化，影響了抗蟲性。因此，調節(jié)棉鈴發(fā)育的氮代謝生理強度，對于協(xié)調棉鈴發(fā)育和抗蟲性具有重要意義。

表7 棉纖維中Bt蛋白表達量與氮代謝主要物質含量和關鍵酶活性的相關性Table 7 Correlation analysis between the content of Bt protein in fibers and the contents of main substances of nitrogen metabolism and the activities of key enzymes

3 討論

3.1 高種植密度抑制棉鈴生長發(fā)育，提高棉纖維Bt蛋白含量

研究表明，棉花產量受密度的影響[18]，在最適種植密度下，可以獲得最高的皮棉產量，而最適種植密度與品種特性、當?shù)貧夂驐l件和耕作制度等有關[25-26]。通過調整種植密度能有效控制棉鈴的發(fā)育并促進集中成鈴[27-29]。此外，棉鈴在植株上的分布也受密度的影響，在較高密度下，內圍成鈴數(shù)增加，外圍成鈴數(shù)減少[16,18]。因此，在棉花生產中，通常采用調整密度來影響株形和棉鈴的生長發(fā)育，以達到控制產量和產量分配的目的。另一方面，Wang等[30]通過剪葉、去蕾等栽培措施形成了不同體積的棉鈴，棉鈴體積越大，鈴殼和棉籽中Bt蛋白表達量越低。另外，有研究表明，施氮量越高，單株鈴數(shù)、單鈴體積和鈴重等生理參數(shù)越大，而棉殼中Bt蛋白表達量越低，棉殼中Bt蛋白表達水平與棉鈴生長參數(shù)呈顯著負相關關系[20]。本研究結果表明，種植密度對棉纖維中Bt蛋白表達量有顯著影響，高密度種植下棉纖維中Bt蛋白含量較高，在最高種植密度下(7.5萬株·hm-2)棉纖維中Bt蛋白的表達量最高。種植密度與Bt蛋白表達量呈正相關關系。提高種植密度在提高Bt蛋白表達量的同時，顯著降低了鈴重、鈴體積和單株鈴數(shù)。即密度變化導致了棉鈴生長發(fā)育的變化，最終引起了棉纖維中Bt殺蟲蛋白表達量的變化。相關分析進一步證實棉纖維中Bt蛋白表達量與單株鈴數(shù)、單鈴體積和鈴重等顯著負相關。因此，植株密度通過對鈴數(shù)、鈴重、鈴體積等的影響，從而提高了棉纖維中Bt蛋白表達量，與前人研究結果基本一致。

3.2 不同種植密度下棉纖維中Bt蛋白含量與氮代謝的關系

Zhang等[4]研究表明極端濕度顯著影響棉花葉片氮代謝，從而導致葉片中Bt蛋白表達量發(fā)生變化。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下Bt蛋白表達量與氮代謝強度密切相關，高溫下葉片Bt蛋白表達量的下降是蛋白質合成能力下降和分解能力增強綜合作用的結果。鹽脅迫也會影響B(tài)t棉葉片中的氮代謝，從而降低葉片中Bt蛋白表達量[4]。增施氮肥能夠提高Bt蛋白表達量，而減施氮肥會降低Bt蛋白表達量，即氮肥用量引起的Bt蛋白表達量變化與氮代謝生理密切相關。因此，Bt蛋白表達量與棉花氮代謝密切相關。本試驗表明，提高種植密度會顯著降低棉纖維中蛋白酶和肽酶的活性，但顯著提高GPT和GOT活性。同時隨著密度的增加，棉纖維中游離氨基酸含量下降，可溶性蛋白含量增加。由此表明，在高種植密度下，蛋白質合成增強，分解減弱。相關性分析進一步表明，棉纖維中Bt蛋白表達量與可溶性蛋白含量、GPT和GOT活性呈顯著正相關；但與游離氨基酸含量、蛋白酶和肽酶活性呈顯著負相關。因此，高密度下Bt蛋白表達量的提高與氮代謝密切相關，是蛋白質合成增強和降解減弱綜合作用的結果。

當前生產中，我國南方棉區(qū)以雜交種應用為主，育種目標以大鈴型品種為主導。體積膨大期是棉鈴蟲危害棉鈴的主要時期，綜上所述，單純追求棉鈴增大將不利于抗蟲性的提高。因此，在促進棉鈴增大的同時，需要協(xié)調棉鈴中 Bt 蛋白的表達。這就要求育種中進行大鈴 Bt 棉新品種的培育時，宜選擇棉鈴氮代謝生理強度高的材料；同時在栽培管理過程中，應注重提高棉鈴的氮代謝生理強度，以協(xié)調形成大鈴和抗蟲性間的關系。