野生樹舌靈芝菌株的分子鑒定

蘭玉菲 孔 怡唐麗娜 李秀梅

（泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東泰安271000）

樹舌靈芝（Ganoderma applanatum）隸屬于靈芝屬（Ganoderma），為我國(guó)傳統(tǒng)的藥用真菌。樹舌靈芝性平、味苦，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抑菌消炎等多種功效，且無(wú)任何毒性，臨床多用于治療乙型肝炎、食道癌、肺結(jié)核、神經(jīng)衰弱等[1-4]。

2009年以來(lái)，筆者從山東省泰安市及其周邊地區(qū)采集野生樹舌靈芝，用組織分離法分離并純化，3次純化后獲得純培養(yǎng)，并用分子生物學(xué)手段獲得ITS序列并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，明確了分類地位，為進(jìn)一步馴化栽培和育種提供遺傳背景清晰的種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株均由筆者從泰安市、曲阜市等采集的野生樹舌靈芝子實(shí)體分離純化所得，保存于泰安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院食用菌研究所。

1.2 主要試劑與儀器

真菌總DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.?Fungal DNA Kit）、2×EasyTaq PCR SuperMix等購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；常規(guī)試劑為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?。My Cycle PCR儀，美國(guó)伯樂(lè)儀器公司。

1.3 培養(yǎng)基

PDA加富培養(yǎng)基：配方參照文獻(xiàn)[5]。

1.4 組織分離和培養(yǎng)

參照《植病研究方法》[6]，將采集的野生樹舌靈芝子實(shí)體生長(zhǎng)點(diǎn)表面用70%酒精擦洗后，用解剖刀切取5 mm2組織塊，接入PDA加富培養(yǎng)基中，置于25℃黑暗培養(yǎng)。待菌絲萌發(fā)后，3次純化培養(yǎng)獲得菌絲純培養(yǎng)。

1.5 菌絲體制備及DNA的提取

切取PDA加富斜面培養(yǎng)基上保存的5 mm2菌株純培養(yǎng)，將其接種于PDA加富平板培養(yǎng)基中央，25℃黑暗培養(yǎng)5~7 d，待菌絲長(zhǎng)至平板邊緣，刮取菌絲體（用于基因組DNA的提取）。

利用DNA提取試劑盒提取真菌總DNA。取200 mg新鮮菌絲體，于液氮中研磨成粉末轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，加入600μL Buffer FG1，混勻后65℃保溫10 min，其間輕柔攪動(dòng)2次；之后加入140μL Buffer FG2混勻，≥10 000g離心10 min；小心吸取上清，加入0.7倍體積的異丙醇混勻，10 000g，離心2 min；倒掉上清液并排出離心管中的殘留液體，加入300μL含有RNase的ddH2O重懸沉淀，加入150μL Buffer FG3和300μL無(wú)水乙醇混勻；將混合液加入HiBind DNA柱中，10 000g離心1 min，加700μL DNA Wash Buffer，10 000g，離心1 min，漂洗2次；將柱子移至干凈的1.5 mL離心管上，加入100μL Elution Buffer，室溫放置2~3 min，10 000g離心1 min，洗脫DNA，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 ITS擴(kuò)增

采用真菌ITS區(qū)域擴(kuò)增的通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增[7]。PCR反應(yīng)體系（50μL）：2×EasyTaqPCR SuperMix 25μL，ddH2O 22μL，模板DNA 1μL（約20 ng），正向和反向引物各1μL（0.4 nmol/L）。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.7 PCR產(chǎn)物測(cè)序

PCR結(jié)束后，取4μL反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將有目的條帶的PCR產(chǎn)物送山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心測(cè)序。

1.8 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

將所得DNA序列輸入GenBank進(jìn)行Blast檢索，采用Clustalx1.81、DNASTAR、DNAMAN和MEGA 5軟件對(duì)所得到的核苷酸序列與GenBank中收錄分離物的相應(yīng)序列進(jìn)行比較和分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生樹舌靈芝的采集及分離純化

采集到野生樹舌靈芝10份（表1）。調(diào)查發(fā)現(xiàn)野生樹舌靈芝常生于楊、樺、柳、櫟等闊葉樹的枯立木、倒木或伐樁上，多年生，屬重要的木腐菌，導(dǎo)致木材木質(zhì)部形成白色腐朽。采用組織分離方法，并在PDA培養(yǎng)基上經(jīng)過(guò)3次純化后獲得純培養(yǎng)。

表1 供試菌株來(lái)源、采集時(shí)間及編號(hào)

2.2 野生樹舌靈芝的形態(tài)特征

野生樹舌靈芝子實(shí)體大，無(wú)柄；菌蓋半圓形，基部常下延，有同心環(huán)紋棱及大小不等的瘤狀突起，邊緣薄或圓鈍，無(wú)油漆樣光澤（圖1）；菌肉棕褐色至深褐色，有輪紋，無(wú)黑色殼質(zhì)層；菌管褐色，有白色菌絲填充，一層至多層，孔面污白色或淡灰褐色，老后褐色至深褐色，管口近圓形。孢子卵圓形，一端有截頭，壁雙層，外壁光滑，無(wú)色，內(nèi)壁有刺狀突起，褐色，大小為（6.5~9.5）μm×（5~6.5）μm（圖2）。

圖1 部分野生樹舌靈芝

圖2 野生樹舌靈芝孢子形態(tài)（×40）

2.3 ITS基因的擴(kuò)增

利用DNA提取試劑盒提取樹舌靈芝菌株的總DNA，用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，10個(gè)供試菌株均擴(kuò)增得到長(zhǎng)度約為600 bp的目的片段，與預(yù)期片段大小一致。

2.4 序列測(cè)定與分析

序列測(cè)定結(jié)果表明，樹舌靈芝ITS序列長(zhǎng)度為560 bp（GenBank登錄號(hào)分別為KM249934、KM249935、KM249936、MG657360、MG657361、MG657362、MG657363、MG657364、MG657365、MG657366），其中包括204 bp內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS1）、155 bp 5.8S編碼序列、201 bp內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS2）。同源性比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)10個(gè)分離物與GenBank中的3個(gè)樹舌靈芝分離物（DQ424996、DQ425009、JN008873）聚為一簇，ITS核苷酸一致率為99.46%~100%，從分子水平上證明10個(gè)分離物為G.applana?tum。

圖3 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 小結(jié)

泰山市及其周邊地區(qū)具有豐富的野生樹舌靈芝種質(zhì)資源，但目前尚未對(duì)其野生種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)研究，且鑒定手段多為形態(tài)學(xué)描述，尚未開展分子水平鑒定，對(duì)其遺傳背景了解甚少，嚴(yán)重影響其馴化栽培和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。筆者采集泰山市及其周邊地區(qū)野生樹舌靈芝，采用組織分離法培養(yǎng)，3次純化后獲得了10個(gè)樹舌靈芝菌株的純培養(yǎng)，從分子水平上證明10個(gè)分離物為G.applanatum。

研究從分子水平上對(duì)泰山市及其周邊地區(qū)野生樹舌靈芝進(jìn)行了分離鑒定，明確了其分類地位，為育種工作提供遺傳背景清晰的野生種質(zhì)資源，同時(shí)為野生樹舌靈芝的馴化栽培和產(chǎn)業(yè)化開發(fā)奠定基礎(chǔ)。