椎間盤組織冷凍切片制作技術的應用

吳 拮，王 棟，李 靜，趙成相

（空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院骨科研究所，陜西 西安 710032）

含有鈣鹽的組織是一種堅硬的結締組織，如骨組織，其基質中含有大量固定的無機鹽，必須脫鈣除去骨鹽才可進行冷凍切片和石蠟切片，因此在制作病理切片過程中，常常需要經過脫鈣處理，才能進行切片染色[1]。而選擇合適的切片法至關重要，常規(guī)石蠟包埋切片，制作過程時間長，在制作過程中要經過酒精、二甲苯和包埋劑有機溶劑處理，對組織抗原有一定的損害及遮蔽，使組織內抗原活性發(fā)生改變。脫鈣稍不徹底，部分標本切片出現(xiàn)“返砂”現(xiàn)象，易出現(xiàn)“刀痕”，水浴鍋攤片過程易散爛。冷凍切片操作快捷，染色過程簡便，還可以保存組織內可溶性物質，防止蛋白變性和酶的失活，從而減少了抗原的丟失。近年來的研究對椎間盤退變的機制研究更加深入，不僅要求有常規(guī)的組織結構化學染色，更要保留組織的免疫原性，因此冷凍切片的優(yōu)勢非常適合應用到研究椎間盤的過程。下面我們將對椎間盤骨組織進行冷凍切片具體操作過程進行深入探討。

1 材料與方法

1.1 材料 標本來自空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院骨科動物實驗中心提供的大鼠。取大鼠尾椎標本，在4%多聚甲醛固定液（Beyotime，P0099）固定48 h，投入10%EDTA 脫鈣液（西安赫特生物科技公司）中，置于陰涼通風處中持續(xù)脫鈣。儀器：恒溫式冷凍切片機（德國Leica，M1850）。試劑：OCT 冷凍切片包埋劑，蔗糖。

1.2 方法 脫鈣及脫鈣終點標本用脫鈣液在常溫通風下進行脫鈣，每間隔3 d 更換1 次脫鈣液，當用手術縫針輕松無阻力穿過組織或可用手術刀輕力切開即為脫鈣完成。流水沖洗30 min 后，投入30%蔗糖溶液中脫水，蔗糖會逐漸滲透入細胞間，并增加組織的比重，所以組織間隙被蔗糖填充后一定會沉底的，將其取出，并用濾紙吸去多余液體。利用高滲蔗糖溶液是減少組織含水量，降低冷凍切片時組織中冰晶的產生。

1.3 切片 ①先將冷凍切片機冷臺啟動預冷，切片時，冷凍室溫度在-18 ℃～-22 ℃；②將椎體組織切成大小適宜的組織塊；③滴加少許OCT 包埋液在組織托上，待冷凍后修平，將組織放置于修平的面上，用OCT 液包埋，置于冷臺上冷凍5～10 min；④冷凍切片厚度為6～8 μm，直接貼于掛膠載玻片上。

1.4 染色

1.4.1 HE 染色 使用蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒染色。冷凍切片PBS 潤洗，入蘇木精染液3 min，水洗2 min，用1%鹽酸乙醇分化15 s，水洗2 min，稀氨水返藍1 min，水洗2 min，80%乙醇1 min，伊紅2 min，水洗1 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

1.4.2 番紅O 染色（saframin o stain）索萊寶公司改良番紅O-固綠軟骨染色試劑盒染色。切片水洗，Weigert 染液染色3 min，流水沖洗1 min。酸性分化液分化5 s，水洗10 min，固綠染色5 min，弱酸洗滌10 s，滴加Safranin O 染液內浸染5 min。95%酒精，無水酒精脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

1.4.3 免疫熒光染色 從冰箱取出切片，在室溫下進行復溫。使用PBS 清洗2 遍；用免疫染色強力通透液打孔15 min，PBS 清洗3 次；封閉液封閉，室溫孵育30 min，傾去勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗（Aggreacan，髓核細胞細胞外基質的主要成分之一，Millipore 公司，AB1031，使用1∶100 稀釋），4 ℃過夜，PBS 清洗；滴加一定比例稀釋的熒光標記的二抗（本例選取了1∶200 的FITC 標記的抗兔二抗），37 ℃避光孵育1 h，PBS 清洗3 遍；用含DAPI封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 HE 染色和番紅O 染色 HE 染色和番紅O 染色切片顯示，椎間盤結構完整，整個髓核組織清淅可見，纖維環(huán)的結構相對完整，軟骨終板的軟骨樣結構和椎體的骨性結構區(qū)分明顯，見圖1、圖2。

圖1 HE 染色

圖2 番紅O 染色

2.2 免疫熒光染色 結果顯示，椎間盤組織的免疫原性保存較好，抗體著色均勻，特異性較強，見圖3。不論是常見的化學染色還是免疫熒光染色，冷凍切片均顯示出對椎間盤組織較好的染色效果。

圖3 免疫熒光

3 討論

脫鈣是利用化學或物理方法，將骨組織中的鈣鹽和膠原纖維進行分離“除去鈣鹽”，使骨組織軟化，目的是獲得完整的骨切片。選擇脫鈣液是制作骨切片的重要環(huán)節(jié)，即要切出完整的切片，又要能完整的保存骨組織內部成分的完整性。對組織內的酶、抗原都有一定保護作用。否則脫鈣過度或不足會影響染色效果，嚴重影響結果的判讀。固定和脫鈣的時間不宜過長，且盡量保持在相對陰冷的環(huán)境中，避免組織免疫活性的喪失[2，3]。脫鈣時間過短，容易造成切片過程中椎間盤髓核和纖維環(huán)的組織結構分離和纖維環(huán)層狀結構的破壞，在研究椎間盤退變過程中，容易和纖維環(huán)穿刺退變模型引起的纖維環(huán)結構破壞相混淆。冷凍切片是一種借助低溫環(huán)境，使組織在短時間內達到一定硬度而進行切片的方法。由于冷凍切片比石蠟切片相對省時且能較好地保護抗原活性，在科學研究中，特別是在進行免疫組化和免疫熒光染色實驗比較適用。

本實驗中椎間盤骨組織通過冷凍切片法，制作能夠較好地保存細胞抗原的活性，并最大程度的保留了椎間盤的組織結構。在操作的過程中減少了對組織脫水、包埋等中間環(huán)節(jié)，在科研實驗的免疫組化染色中的應用中有著不可取代的地位，因此在科研以及臨床工作中的應用較為廣泛。同時，冷凍切片的容錯率較高，可以對短時間內脫鈣的樣本進行試切，如脫鈣不徹底，其余組樣本可以從脫水狀態(tài)再次進入脫鈣液中，相較于石蠟切片方法更為簡便。本例中外層的纖維環(huán)外圍有輕微的損壞，而大部分外層纖維環(huán)內層纖維環(huán)和髓核結構保留非常完整，尤其是纖維環(huán)的板層結構和纖維走行非常清晰，判斷主要原因是組織取材固定前，對周圍軟組織剝離過多造成的物理損傷，并非是切片過程中產生的誤差。因此，在以后的大鼠椎間盤取材過程中，盡量保持組織結構的完整性，不能為達到快速脫鈣的目的而過度剝離外周組織[4，5]。

在整個制作過程中應注意以下幾點：①取材時刀片要鋒利，組織塊不易過長；②脫鈣液要充足，一般為標本體積的20 倍，3 d 換1 次脫鈣液，脫鈣時將瓶口不要蓋嚴，在通風處放置，縮短脫鈣時間；③切片時溫度很重要，溫度過低容易導致組織過硬，切片易碎，溫度過高則由于組織硬度不夠，切片不成形，產生搓板狀或粉末狀；④切片時刀要鋒利，最好是一次性刀片，不要有劃痕；⑤染色時特點注意水洗步驟，流水沖洗時不要對著組織沖洗，以免脫片[6-8]。

綜上所述，通過本實驗說明冰凍切片在研究椎間盤相關課題的應用中有很好的應用前景，在最大保留抗原性的同時也極好的保護了組織結構的完整性，對未來椎間盤相關實驗的組織切片選擇提供了指導意義。