當歸-川芎藥對治療原發(fā)性痛經的網絡藥理學研究

張 科，谷冬梅，李 波，宋 崟，李正翔，袁恒杰

（天津醫(yī)科大學總醫(yī)院藥劑科1，檢驗科2，天津 300052）

原發(fā)性痛經（primary dysmenorrhea，PD）是一種青春期女性在月經前后或經期常見疾病，輕者為下腹疼痛、墜脹，重者會出現(xiàn)惡心嘔吐、冷汗淋漓甚至昏厥等癥狀，影響患者的正常生活。PD 的發(fā)病機制目前尚未完全闡明，臨床很難根治[1]。PD 治療以藥物治療為主，常用藥物為非甾體抗炎藥，但治療效果不佳，且不良反應明顯[2]。中醫(yī)治療PD 具有獨特的優(yōu)勢，痛經在中醫(yī)辨證上屬于“經行腹痛”的范疇，是由于氣滯血瘀、經血不暢引起的或者是由于著涼受寒所引起的[3]，治則以活血化瘀、行氣止痛為法[4]。當歸-川芎是于補血活血、化瘀止痛的經典藥對。當歸性溫味甘辛，歸心、肝、脾經，善補血活血，調經止痛，潤腸通便，并能散寒，凡血虛血瘀有寒癥均宜，為婦科調經之要藥。川芎性溫味辛，歸肝、膽、心包經，善活血行氣，祛風止痛，治血瘀氣滯諸痛，兼寒者最宜[5]。近年來，基于網絡藥理學探究中藥多成分、多靶點作用機制成為研究熱點，本文擬采用該方法探究當歸-川芎藥對治療PD 的作用機制，以期為其臨床應用提供參考。

1 資料與方法

1.1 活性成分及靶點的篩選 基于TCMSP 數(shù)據庫，以“當歸”“川芎”為關鍵詞檢索，收集藥材的化學成分，然后以OB≥30%和DL≥0.18 為條件篩選有效成分[6，7]。收集數(shù)據庫中成分對應的靶點，并使用Uniprot 數(shù)據庫，將靶點轉換標準基因名。

1.2 當歸-川芎藥對治療PD 的靶點的篩選 基于Genecards 數(shù)據庫，以“Primary Dysmenorrhea”為關鍵詞檢索，收集UC 疾病靶點，以Excel 格式導出，然后將1.1 中成分靶點的標準基因與疾病靶點基因取交集，作為當歸-川芎藥對治療PD 的靶點。

1.3 活性成分-靶點網絡的構建 將1.1 中成分和靶點信息處理后導入Cytoscape 軟件中繪制活性成分-靶點網絡圖，然后對網絡進行拓撲結構分析，其中不同類型節(jié)點分別代表有效成分和靶點，邊代表兩者之間的關系。再根據節(jié)點連接度（Degree）和介數(shù)中心性（BC）對網絡圖進行調整，節(jié)點的大小反映Degree 的大小。

1.4 蛋白質相互作用網絡（PPI）的構建及其核心靶點的篩選 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網絡是從生物化學、信號轉導和遺傳網絡的角度研究成分和疾病相關蛋白之間的相關性[8]。使用在線韋恩圖工具，獲取藥對成分靶點和疾病靶點的交集基因，將交集基因導入STRING 數(shù)據庫進行分析，將分析數(shù)據以TSV 格式導出，導入Cytoscape 軟件，繪制當歸-川芎藥對與PD 靶點的PPI 網絡，并對網絡進行拓撲結構分析，再使用“Generate style from statistics”工具對網絡節(jié)點的大小和顏色進行設置。網絡圖中節(jié)點的大小、顏色深淺代表Degree 值的大小，邊的粗細反映了Combine Score 的大小，從中篩選出Degree 值和接近中心度排名靠前的靶點作為核心靶點。

1.5 核心靶點的通路分析 DAVID 數(shù)據庫能提供系統(tǒng)的生物功能注釋信息，進行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和KEGG 通路分析，由此挖掘特定基因或蛋白的生物學意義[9]。將當歸-川芎藥對治療PD 靶點導入DAVID 數(shù)據庫，并限定物種為人，進行基因功能注釋分析和功能富集分析，然后導出數(shù)據，對生物過程（P＜0.01）和信號通路（P＜0.05）進行篩選，并進行繪圖。

2 結果

2.1 當歸-川芎藥對活性成分的確定 在TCMSP 數(shù)據庫中檢索到“當歸”“川芎”得到化學成分314 個，其中125 個來自當歸，189 個來自川芎。以OB≥30%和DL≥0.18 篩選出活性成分9 個，其中2 個來自當歸，7 個來自川芎，包括β-谷甾醇、豆甾醇、谷甾醇、葉酸、亞油酸乙酯、楊梅酮、川芎哚、川芎萘呋內酯、洋川芎醌堿，具體信息見表1。檢索得到9 個成分對應靶點111 個：β-谷甾醇對應靶點38 個，豆甾醇對應靶點31 個，谷甾醇對應靶點3 個，葉酸對應靶點3 個，亞油酸乙酯對應靶點3 個，楊梅酮對應靶點25 個，川芎哚對應靶點4 個，川芎萘呋內酯對應靶點4 個，洋川芎醌沒有對應靶點。將所得靶點蛋白名稱轉換為標準基因名，刪除重復和無效靶點，共獲取當歸-川芎藥對成分作用靶點69 個。

表1 當歸-川芎中9 個活性成分的基本信息

2.2 活性成分-靶點網絡 活性成分-靶點網絡共包括77 個節(jié)點（8 個活性成分節(jié)點，其中1 個成分沒有對應靶點，69 個靶點節(jié)點）和111 條邊，見圖1。分析網絡可知，1 個活性成分平均作用13.88 個靶點，1 個靶點平均作用1.61 個活性成分。從活性成分的角度，8 個活性成分中作用靶點數(shù)量最多的前3個成分為DG-1（β-谷甾醇）、DG-2（豆甾醇）、CX-4（楊梅黃酮），分別能與38、31、25 個靶點發(fā)生相互作用。從靶點的角度，度值排名前5 位的是PTGS2、NCOA2、PTGS1、PRKACA、SCN5A，分別能與6、5、4、3、3 個活性成分發(fā)生相互作用。

圖1 當歸-川芎活性成分-靶點網絡圖

2.3 成分靶點與疾病靶點的交集 通過數(shù)據庫獲得當歸活性成分作用靶點69 個，川芎活性成分作用靶點42 個，PD352 個相關基因。通過在線韋恩圖得出當歸、川芎與PD 共有基因4 個，分別是PTGS1、PTGS2、PGR、ADRB2；當歸與PD 的共有基因8 個，分別是BAX、BCL2、CASP3、CHRM2、CHRM3、OPRM1、TGFB1、PLAU；川芎與PD 的共有基因4 個，分別是ESR1、ESR2、PPARG、KDR。當歸-川芎藥對活性活性成分作用靶點與PD 共有16 個交集基因，見圖2。

圖2 交集基因的韋恩圖

2.4 PPI 網絡分析 將交集基因導入STRING 數(shù)據庫進行分析顯示，PPI 網絡包含15 個節(jié)點（其中CHRM3 靶點與其他靶點沒有連接關系），34 條邊，平均節(jié)點Degree 值為4.25。網絡中Degree 值排名前5 的靶點分別是CASP3、PTGS2、ESR1、TGFB1、KDR、PPARG。從STRING 數(shù)據庫中將分析數(shù)據以TSV 格式導出，然后導入Cytoscape 軟件中，繪制當歸-川芎藥對與UC 靶點的PPI 網絡圖，見圖3。

圖3 當歸-川芎作用靶點與PD 蛋白互作網絡圖

2.5 功能注釋分析和富集分析 當歸-川芎藥對與PD 的交集基因共在108 個（P＜0.05）GO term 上富集，其中生物過程（BP）78 個，分子功能（CC）11 個，細胞組成（MF）19 個，見圖4。主要涉及生物學功能與過程包括雌二醇調節(jié)、類固醇激素介導的信號通路、NO 生物合成過程的正向調節(jié)、糖皮質激素反應等；交集基因共在62 條（P＜0.05）通路上富集，主要通過調控雌激素信號通路、NF-κB 信號通路、細胞凋亡等發(fā)揮作用，見圖5。

圖4 GO 富集分析圖

圖5 KEGG 富集分析的16 條通路圖

3 討論

原發(fā)性痛經的發(fā)病機制可能與前列腺素水平升高、白細胞介數(shù)水平升高、血管內皮細胞功能障礙和經期體內激素水平的變化密切相關[1]。前列腺素水平升高可使子宮平滑肌的血流量減少，出現(xiàn)收縮甚至痙攣，增加周圍神經對疼痛的敏感性。研究表明[10]，與生殖系統(tǒng)密切相關的前列腺素是PGE2和PGF2α，在月經周期的不同階段子宮內膜中二者的含量呈周期性變化。黃體期及月經期子宮內膜產生的前列腺類產物增多，黃體期PGE2的含量比PGF2α 高，而月經期則相反。此外，原發(fā)性痛經與經期性激素變化也有關，雌二醇（E2）可使子宮肌細胞的鈣離子內流，引起子宮收縮，同時還可以通過激活磷酸肌醇循環(huán)，促進PGF2α 的合成，降低疼痛閾值。本研究藥對中當歸為氣中之血藥，擅補血活血、調經止痛；川芎為血中之氣藥，可活血行氣、祛瘀止痛，二藥配伍，既可補血活血以調經，又能行氣祛瘀以止痛[5]。

本研究活性成分-靶點網絡中當歸-川芎藥對中8 個活性成分通過作用于69 個靶點發(fā)揮藥理作用，同時網絡中度值排名前2 個活性成分分別是β-谷甾醇和豆甾醇，二者均證實有明顯的抗炎作用。β-谷甾醇通過提高抗炎因子IL-10 的活性，減小趨化因子和促炎因子活性等抑制核轉錄因子（NF-κB）的遷移[11]。豆甾醇可明顯減少由脂多糖刺激增多的致炎因子環(huán)氧化酶-2 和誘生型一氧化氮合酶mRNA 的表達，進而減少PGE2 和NO 的釋放發(fā)揮抗炎作用[12]。從活性成分-疾病交集靶點可知，當歸-川芎藥對治療原發(fā)性痛經是多靶點協(xié)同作用的，如調節(jié)炎癥細胞因子TGFB1 和PTGS2，作用于阿片樣物質受體OPRM1 等；GO 富集分析顯示，疾病靶點主要富集在BP 環(huán)節(jié)，如雌二醇調節(jié)、類固醇激素介導的信號通路、NO 生物合成過程的正向調節(jié)、糖皮質激素反應等；從DAVID 通路分析顯示，疾病靶點涉及的通路與PD 相關包括雌激素信號通路、NF-κB 信號通路、細胞凋亡等，其中雌激素信號通路涉及的靶點有IL6、TNF、SLC2A4、PTPN1、INSR，NF-κB 信號通路涉及的靶點有TNF、SLC2A4、INSR，細胞凋亡涉及的靶點有SLC2A4、PTPN1、INSR。

綜上所述，當歸-川芎藥對中多個成分作用于多個靶點和通路，可發(fā)揮治療PD 的作用。