近紅外光響應性多烯紫杉醇主動靶向脂質體的制備及其體外抗腫瘤活性*

祝俠麗，李玲華，王莎莎，王白燕，關延彬，賈永艷

(河南中醫(yī)藥大學 1.藥學院；2.基礎醫(yī)學院，鄭州 450046)

脂質體(liposomes，Lip)具有靶向性、良好的生物相容性和生物可降解性[1]，被認為是目前最成熟與最具前景的納米遞藥系統(tǒng)[2]。但是，如何提高脂質體的腫瘤靶向效率，確保藥物在腫瘤細胞內(nèi)的有效濃度仍是目前研究的重點[3]。研究證明，以甘草次酸(glycyrrhetinic acid，GA)修飾的目標化合物可通過細胞內(nèi)吞作用與細胞膜上的甘草次酸受體特異性結合進入細胞內(nèi)而發(fā)揮藥理作用[4]。腫瘤光熱治療(photothermal therapy，PTT)是在臨床上繼手術、放射治療(放療)和化學治療(化療)之后的又一具有很大潛力的腫瘤治療新手段[5]，是目前腫瘤治療領域研究的熱點[6]。本課題以親水性納米硫化銅(PVP/CuS)為光敏劑，GA為腫瘤靶向分子，多烯紫杉醇(DTX)為模型藥物，制備近紅外光響應性多烯紫杉醇主動靶向脂質體(GA-DTX-PVP/CuS-Lip)，并對其理化性質、體外釋藥特性及抗腫瘤活性等進行研究。

1 儀器與試藥

1.1儀器 BSA224S-CW型天平(感量：0.1 mg，賽多利斯科學儀器有限公司)；N-1100-OSB-2100型旋轉蒸發(fā)儀(上海愛郎儀器有限公司)；92-llN型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司，Nano-ZS90電位及粒度分析儀(英國Malvern公司)；JEM-1400型透射電鏡(日本電子)；MW-GX-808/3000mW型激光器(中國科學院長春激光所)；SHA-C型水浴振蕩器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；E191型細胞培養(yǎng)箱(美國Corning公司)；CKX41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；22331 Hamburg小型臺式高速冷凍離心機(德國艾本德股份公司)；iMark BIO RAD型酶標儀(北京友華照欽醫(yī)療器械有限公司)。

1.2試藥 甘草次酸(GA，含量>98%，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司，批號：405310)；多烯紫杉醇(DTX，含量>98%，上海瀚香生物科技有限公司，批號：C338774)；豆磷脂(天津市光夏精細化工研究所，批號：20180417)；膽固醇(鄭州奇華頓化工產(chǎn)品有限公司，批號：20150527)；親水性納米硫化銅(PVP/CuS，本課題組制備，批號：20180317)；甘珀酸十八醇酯(18-GA-Suc，課題組制備，批號：20190112)；RPMI-1640 培養(yǎng)基(上海索萊寶生物科技有限公司，批號：20190124)；無噬菌體胎牛血清(北京四季青生物科技有限責任公司，批號：18090506)；3-(4，5-二甲噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT，美國Sigma公司，批號：298-93-1)；細胞培養(yǎng)級二甲亞砜(DMSO，北京鼎國昌盛生物科技有限公司，批號：8A800160)；甲醇、乙腈、聚山梨酯-80、超純水等均為分析純。

1.3細胞 SMMC-7721人肝癌細胞(中國科學院細胞庫)。

2 方法與結果

2.1GA-DTX-PVP/CuS-Lip的制備與表征 本實驗采用薄膜分散法制備近紅外光響應性多烯紫杉醇主動靶向脂質體[7]，具體步驟如下：精密稱取磷脂、膽固醇、18-GA-Suc和DTX置于250 mL茄形瓶中，加入氯仿10 mL使其全部溶解。40 ℃下旋轉減壓蒸發(fā)以除去有機溶劑，至形成均勻的薄膜。然后加入PVP/CuS的pH值7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)5 mL，超聲(功率500 W，頻率40 KHz)水合15 min，后再探頭超聲處理60 s(功率250 W，頻率25 KHz)每次超聲3 s，間歇3 s，即得近紅外光響應性多烯紫杉醇主動靶向脂質體。

2.2GA-DOX-PVP/CuS-Lip的表征

2.2.1分散性及形態(tài)觀察 采用透射電鏡(TEM)法觀察GA-DTX-PVP/CuS-Lip的微觀形態(tài)，具體方法如下[8]：取適量空白脂質體、GA-DTX-PVP/CuS-Lip，加純化水探超1 min。經(jīng)稀釋10倍后，取適量滴至TEM 專用銅網(wǎng)上，用3%磷鎢酸染色2 min，自然干燥。然后置于透射電鏡下觀察，并記錄結果(圖1)。

由圖1-A可見，GA-PVP/CuS-Lip(左)和GA-DTX-PVP/CuS-Lip(右)水分散性及穩(wěn)定性良好。由圖1-B和圖1-C可見，GA-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/ CuS-Lip均呈圓球形結構，大小較為均勻，平均粒徑約200 nm。

2.2.2粒徑及電位 分別取空白脂質體GA-PVP/CuS-Lip、GA-DTX-PVP/CuS-Lip適量，用超純水稀釋后[9]，采用Nano-ZS90型電位及粒度分析儀測其粒徑和電位，結果見圖2。

由圖2A-B所知，GA-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip的平均粒徑分別為(114.3±0.35) nm 和(226.7±0.17)nm。由圖2A-B所知，GA-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip的平均Zeta電位分別為(-13.8±0.27)mV和(-4.05±0.57)mV。結果表明制備的GA-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip穩(wěn)定性良好。

2.2.3包封率和載藥量 采用超濾離心法測定GA-DTX-PVP/CuS-Lip的包封率，具體操作如下[10]：將GA-DTX-PVP/CuS-Lip置于超濾管(截留相對分子質量30 000)，5000 r·min-1離心15 min，HPLC法測定濾液中游離藥物量，記為W游。高效液相色譜(HPLC)條件如下[11]，色譜柱：Venusil XBP C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，檢測波長：230 nm；流動相：乙腈-水(50：50)，流速：1 mL·min-1；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。GA-DTX-PVP/CuS-Lip中總的藥量記為W總，載體GA-PVP/CuS-Lip的質量記為W載體。按照下列公式計算包封率和載藥量：包封率(%) =[(W總-W游)/W總]×100%；載藥量 (%) =[(W總-W游)/(W總+W載體)]×100%。測定結果顯示GA-DTX-PVP/CuS-Lip的包封率和載藥量分別為(96.33±0.21)%和(6.63±0.39)%。

A.GA-PVP/CuS-Lip(左)和GA-DTX-PVP/CuS-Lip(右)的外觀照片；B.GA-PVP/CuS-Lip的透射電鏡照片；C.GA-DTX-PVP/CuS-Lip的透射電鏡照片。

圖1 不同制劑的外觀照片及透射電鏡照片(×25 000)

A.The appearance of GA-PVP/CuS-Lip (left) and GA-DTX-PVP/CuS-Lip (right)；B.TEM photo of GA-PVP/CuS-Lip；C.TEM photo of GA-DTX-PVP/CuS-Lip.

Fig.1 The appearance and TEM photos of different preparations(×25 000)

A-B.GA-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip 粒徑分布圖；C-D.GA-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip 電位分布圖。

2.3GA-DOX-PVP/CuS-Lip的光熱轉換試驗 取所制備的GA-DTX-PVP/CuS-Lip，用超純水稀釋成藥物濃度分別為0.1，0.3，0.5 mg·mL-1的溶液，分別取出3 mL置于樣品池中[12]，采用808 nm[2.50 W·(cm2)-1]的激光照射，每0.5 min記錄一次溫度。同時設純化水為空白對照組。以時間作為橫坐標，溫度作為縱坐標來繪制光熱轉換曲線，如圖3所示。

由圖3可知，與純化水比較，GA-DTX-PVP/CuS-Lip的溫度隨時間的延長而明顯上升，且濃度越大，溫度上升越快，說明GA-DTX-PVP/CuS-Lip具有濃度時間依賴性的光熱轉換特性。

2.4GA-DOX-PVP/CuS-Lip的體外釋放度試驗 采用透析法進行GA-DTX-PVP/CuS-Lip的體外釋放度試驗，具體方法如下[13]：精密量取DTX溶液或GA-DTX-PVP/CuS-Lip 1 mL，分別置于透析袋(截留相對分子質量3000)中，進行釋放度試驗。釋放介質為pH值7.4的PBS 50 mL(含0.5%聚山梨酯-80)，轉速100 r·min-1，溫度37 ℃或45 ℃，取樣點0.5，1，2，4，6，8，12，24，48 h，取樣體積0.5 mL，每次取樣后及時補充同溫同體積的空白介質。HPLC法測定樣品中的藥物濃度，計算累積釋放百分率，以時間為橫坐標，累積釋放百分率為縱坐標繪制釋藥曲線。

圖3 GA-DTX-PVP/CuS-Lip的光熱轉換曲線

由圖4-A可見，37 ℃條件下，DTX溶液釋藥速度較快，12 h時累積釋放百分率已達到98.56%；DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip釋藥速度較為緩慢，12 h的累積釋放百分率分別為23.63%和28.94%。表明與DTX溶液比較，DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip均具有明顯的緩釋作用。數(shù)學模型擬合結果顯示DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip 均符合 Korsmeyer-Peppas模型，相關系數(shù)r分別為0.959 1和0.992 7。

由圖4-B可見，DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip在45 ℃釋放速度高于37 ℃釋放速度。如24 h，DTX-PVP/CuS-Lip在37 ℃和45 ℃累積釋放百分率分別為33.49%和57.47%，GA-DTX-PVP/CuS-Lip在37 ℃和45 ℃累積釋放百分率分別為35.41%和51.29%。說明高溫可促進DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip中藥物的釋放?？蔀槠浣Y合近紅外光照射進行腫瘤光熱化聯(lián)合治療提供一定的理論基礎。

2.5GA-DTX-PVP/CuS-Lip的細胞抑制率試驗 選擇SMMC-7721肝癌細胞作為細胞模型，采用MTT法測定不同濃度空白載體GA-PVP/CuS-Lip、DTX 溶液、DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip對細胞生長的影響[14]。將處于對數(shù)期的SMMC-7721細胞接種到96孔板(每孔8×103個)，置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

A.37 ℃下的釋藥曲線；B.37 ℃和45 ℃下的釋藥曲線。

每孔加入50，25，10，0.5 μg·mL-1GA-PVP/CuS-Lip或100，50，20，1 μg·mL-1DTX-PVP/CuS-Lip、GA-DTX-PVP/CuS-Lip 200 μL，每個濃度設6個復孔，激光組加藥后立即用808 nm激光[2.5 W·(cm2)-1]照射3 min[15]，空白對照組加培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24，48或72 h，每孔加5 mg·mL-1MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加DMSO 150 μL，置搖床上振蕩10 min。然后用酶標儀在490 nm處測量吸光度(A值)。按照下列公式計算細胞存活率和細胞抑制率[16]：細胞存活率(%) =(實驗組A值/空白組A值)×100%；細胞抑制率(%) =[(實驗組A值-空白組A值)/空白組A值]×100%。

不同制劑組孵育24 h對SMMC-7721細胞生長活性的影響如圖5所示。

由圖5-A可知，隨著GA-PVP/CuS-Lip空白載體的濃度增加，SMMC-7721細胞的生存率呈降低趨勢。但是當其中PVP/CuS濃度在10 μg·mL-1以下時，對SMMC-7721細胞生長的影響較小。由圖5-B可知，GA-DTX-PVP/CuS-Lip濃度越高，對SMMC-7721細胞的生長抑制作用越強(P<0.01)，同時各濃度結合808 nm激光照射后對SMMC-7721細胞的生長抑制作用增強。

圖5 GA-PVP/CuS-Lip(A)和GA-DTX-PVP/CuS-Lip(B)孵育24 h后對SMMC-7721細胞生長的影響(n=6)

另外，DTX 溶液、DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip孵育24，48或72 h對SMMC-7721細胞生長的影響如圖6所示。

由圖6-A(24 h)和圖6-B(48 h)可知，相同濃度下，GA-DTX-PVP/CuS-Lip組SMMC-7721的細胞抑制率均高于DTX溶液(P<0.01)，表明將DTX制成GA-DTX-PVP/CuS-Lip可增加其對SMMC-7721細胞的生長抑制作用。圖6-C為DTX-PVP/ CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip孵育72 h 時的細胞抑制率，由圖6-

A.24 h；B.48 h；C.72 h。

C可見，當DTX濃度為1 μg·mL-1和20 μg·mL-1時，GA-DTX-PVP/CuS-Lip組對SMMC-7721細胞的抑制率高于DTX-PVP/CuS-Lip組(P<0.01)，表明相對于DTX-PVP/CuS-Lip普通靶向制劑，GA-DTX-PVP/CuS-Lip主動靶向制劑對SMMC-7721細胞的生長抑制作用更強。當DTX濃度為50和100 μg·mL-1時，DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip兩組的細胞抑制率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，均接近于100%。

3 討論

本實驗以親水性PVP/CuS為光敏劑，GA為腫瘤靶向分子，DTX為模型藥物，采用薄膜分散法制備了近紅外光響應性多烯紫杉醇主動靶向脂質體(GA-DTX-PVP/CuS-Lip)。透射電鏡下觀察到GA-DTX-PVP/CuS-Lip為類圓球形結構，平均粒徑和電位分別為(226.73± 0.17)nm 和(-4.05±0.57)mV，包封率和載藥量分別為(96.33±0.21)%和(6.63±0.39)%，符合納米制劑設計要求。結合808 nm激光照射進行了光熱轉換實驗，結果顯示GA-DTX-PVP/CuS-Lip具有濃度時間依賴性的光熱轉換特性。

GA-DTX-PVP/CuS-Lip的體外釋放度試驗中，進行了37 ℃和45 ℃兩個溫度的釋放度試驗，分別模擬人體生理環(huán)境和結合外加熱條件下制劑的釋藥特性。實驗結果顯示，與DTX溶液比較，GA-DTX-PVP/CuS-Lip具有明顯的緩釋特征，45 ℃時釋藥速度明顯高于37 ℃釋藥速度。表明GA-DTX-PVP/CuS-Lip給藥后結合局部高溫可促進其中藥物的釋放。因DTX水溶性較差，參考文獻[17]，選擇含有0.5%聚山梨酯-80的磷酸鹽緩沖液(pH值7.4)為釋放介質。

GA-DTX-PVP/CuS-Lip的體外細胞抑制率試驗中，除進行了GA-PVP/CuS-Lip空白載體對SMMC-7721細胞毒性試驗以外，還設計進行不同實驗組不同濃度下的試驗，并作兩兩對比分析[18]。如DTX溶液組和GA-DTX-PVP/CuS-Lip制劑組，GA-DTX-PVP/CuS-Lip和GA-DTX-PVP/CuS-Lip+激光組，DTX-PVP/CuS-Lip普通制劑組和GA-DTX-PVP/CuS-Lip 主動靶向制劑組。實驗結果顯示，與DTX溶液比較，GA-DTX-PVP/CuS-Lip具有較強的細胞抑制作用，并具有濃度和時間依賴性。結合808 nm激光照射，GA-DTX-PVP/CuS-Lip對SMMC-7721細胞的抑制率增高。綜上，本實驗制備的GA-DTX-PVP/CuS-Lip 的工藝穩(wěn)定、可行，可為進一步進行腫瘤光熱化聯(lián)合治療提供一定的理論依據(jù)。