益生菌干預(yù)肝臟組織DAG-PKC的表達(dá)對肥胖小鼠胰島素抵抗的影響*

易嘉岱，常向云，王曉麗，程運(yùn)杰

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝科，石河子 832002；2.浙江省立同德醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝科，杭州 310012)

肥胖是一種常見病，屬于世界性公眾健康問題，當(dāng)機(jī)體的能量消耗遠(yuǎn)小于攝入時(shí)便會(huì)導(dǎo)致體脂沉積，從而造成體質(zhì)量增加[1]，臨床上定義身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)≥30 kg·(m2)-1為肥胖[2]。研究顯示糖尿病、冠心病的患病風(fēng)險(xiǎn)會(huì)隨著BMI的增加而增加[3]，因此肥胖不僅對人類的身體健康帶來傷害，也給社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展以及醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)帶來巨大的負(fù)擔(dān)。肥胖是引起胰島素抵抗(IR)的主要潛在原因[4]。肥胖引起IR的機(jī)制可能與胰島素信號(hào)通路受損、糖脂代謝紊亂、慢性炎癥以及氧化應(yīng)激有關(guān)[5]。近年來多個(gè)研究顯示二酰甘油(DAG)-蛋白激酶C(PKC)與IR有關(guān)，在多種包括飲食介導(dǎo)的肥胖大鼠和肥胖人群、輸注葡萄糖或2型糖尿病的嚙齒動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)存在IR狀態(tài)時(shí)，機(jī)體內(nèi)的DAG、PKC含量增加，且PKC的分布、活性也發(fā)生了改變[6]。DAG是PKC的生理激活因子，當(dāng)循環(huán)中血糖升高時(shí)，DAG主要依賴于從頭合成磷脂，DAG的含量增加，PKC的活性及分布發(fā)生改變，使得DAG-PKC通路的活性升高，引起胰島素受體的磷酸化和下調(diào)[10]，這一過程導(dǎo)致了脂質(zhì)代謝紊亂和IR。益生菌作為微生態(tài)制劑，在維持腸道菌群的平衡方面起著重要作用[8]。多項(xiàng)研究顯示腸道菌群失調(diào)與肥胖等多種慢性疾病相關(guān)[9]。補(bǔ)充益生菌可改善2型糖尿病的IR狀態(tài)[10]，但相關(guān)的機(jī)制暫不明確。故本研究旨在通過研究益生菌干預(yù)飲食介導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟組織中 DAG、 PKC的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討益生菌對改善脂代謝及IR的可能機(jī)制。為肥胖及IR的預(yù)防和治療提供新的思路及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 C57BL/6N雄性野生型小鼠60只，5周齡，無特定病原體(SPF)級(jí)，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)-2016-0006]，平均體質(zhì)量(19±1.0) g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。所有小鼠分籠飼養(yǎng)于清潔動(dòng)物房，每籠 5只，保持溫度在17～21 ℃，相對濕度保持在約50%，每日光照12 h。

1.1.2主要試劑和儀器 DAG酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)：JL18401)；PKC酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(上海江萊生物科技有限公司，批號(hào)：JL13990)；磷酸鹽緩沖液(Biosharp公司，批號(hào)：69010707)(pH值7.4)；小鼠飼料均購于華雅思創(chuàng)生物科技有限公司(高脂飼料，批號(hào)：D12492；普通飼料，批號(hào)：D12450B)；益生菌VSL#3購于美國VSL公司(V1209-0917)(成分包括乳酸桿菌屬、擬桿菌屬、鏈球菌屬)；血糖儀和血糖試紙(Roche，德國)；酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國) ；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(Roche，德國)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及VSL#3干預(yù) C57BL/6N雄性野生型小鼠60只，采用配對比較法進(jìn)行隨機(jī)分為2組，正常脂肪飲食(NFD)30只給予普通飼料(脂肪熱卡占10%)，高脂肪飲食(HFD)30只給予高脂飼料(脂肪熱卡占 60%)，飼養(yǎng)8周后，將兩組小鼠稱質(zhì)量并記錄其體質(zhì)量(WT)，評估造模結(jié)果，HFD組小鼠體質(zhì)量相較于NFD組小鼠平均體質(zhì)量增加20%定義為肥胖小鼠[11]。將造模成功的肥胖小鼠及NFD組小鼠分別隨機(jī)分為活性益生菌干預(yù)(VSL#3)、滅活益生菌干預(yù)(滅活VSL#3)、空白對照(等量純化水)繼續(xù)干預(yù)4周。VSL#3劑量及給藥方式：參照人的口服劑量換算出小鼠所需VSL#3為1.2 g·kg-1·d-1；以每只小鼠體質(zhì)量20 g計(jì)算，VSL#3的劑量約為每只24 mg·d-1，溶于普通純化水，每日一次灌胃；滅活益生菌干預(yù)組將VSL#3溶于60 ℃ 熱純化水中滅活后，同等劑量灌胃?？瞻讓φ战M予以等量蒸餾水灌胃。

1.2.2血糖、血脂檢測 干預(yù)結(jié)束后，所有小鼠空腹8 h，內(nèi)眥靜脈采血，抗凝管收集小鼠靜脈血，靜置30 min，3000 r·min-1(r=10 cm)，離心5 min，取上清液，采用化學(xué)發(fā)光法測量空腹胰島素(FINS)，酶比色法測量三酰甘油(TG)、膽固醇(TC)；胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR(insulin resistance index，IRI)，IRI=INS(mU·L-1)×FBG(mmol·L-1)/22.5。

1.2.3標(biāo)本制備及ELISA 干預(yù)結(jié)束后，所有小鼠禁食8 h，稱定質(zhì)量并記錄，處死小鼠，在無菌環(huán)境下打開腹腔，摘取肝臟，放入無菌凍存管，并取小鼠肝臟組織(50±5)mg，進(jìn)行稱定質(zhì)量并記錄，加入1000 μL的磷酸鹽緩沖液，用干燥無菌玻璃研磨器將肝臟標(biāo)本研磨充分，研磨好的組織勻漿轉(zhuǎn)入 1.5 mL EP管內(nèi)，4 ℃，3000 r·min-1(r=10 cm)，離心20 min，小心吸取上清液轉(zhuǎn)入另一新EP管中，備用。

向預(yù)先包被相關(guān)抗體的酶標(biāo)孔中依次分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、稀釋后的待測樣本，再依次加入酶標(biāo)試劑，使其形成抗體抗原酶標(biāo)抗體復(fù)合物，隨后將酶標(biāo)包被板置于37 ℃溫箱中溫育60 min，經(jīng)過5次充分洗滌未結(jié)合的成分，再分別向每孔中先后加入顯色劑，置于37 ℃溫箱中避光溫育15 min后，向每孔加入終止液，終止反應(yīng)后15 min內(nèi)上機(jī)檢測，以空白孔調(diào)零，450 nm波長測定各反應(yīng)孔的吸光度(A值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度與其對應(yīng)的A值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各孔的濃度，再乘以樣本稀釋濃度后得出每個(gè)樣品DAG、PKC的濃度。

2 結(jié)果

2.1肥胖小鼠模型制備結(jié)果 高脂飼養(yǎng)8周后，HFD組小鼠體質(zhì)量每只為(32.91±0.25) g，NFD組體質(zhì)量每只為(26.80±0.21) g，HFD組小鼠平均體質(zhì)量相較于NFD組小鼠平均體質(zhì)量增加20%，造模成功率為100%。

2.2益生菌對小鼠體質(zhì)量、糖代謝指標(biāo)及IR的影響 在益生菌干預(yù)第4周末，對小鼠的體質(zhì)量及糖代謝水平進(jìn)行評估。在給予相同活性益生菌干預(yù)的條件下，HFD各組較NFD各組小鼠具有較高水平的體質(zhì)量、FBG、FINS及HOMA-IR水平(P<0.05)；經(jīng)過益生菌干預(yù)，VSL#3+HFD組的體質(zhì)量、FBG、FINS及HOMA-IR水平相較與HFD空白對照組及滅活VSL#3+HFD組明顯降低(P<0.05)；HFD空白對照組與滅活VSL#3+HFD組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；VSL#3+NFD組體質(zhì)量、糖代謝水平及HOMA-IR較NFD空白對照組及滅活VSL#3+NFD組無明顯差異(P>0.05)。見表1。

2.3益生菌對小鼠脂代謝水平的影響 益生菌干預(yù)4周后，檢測各組小鼠血TC、TG水平。在相同活性的益生菌干預(yù)條件下，HFD各組TC、TG水平較對應(yīng)的NFD各組小鼠升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)過益生菌干預(yù)后，VSL#3+HFD組相較于HFD空白對照組小鼠以及滅活VSL#3+HFD組小鼠的TC、TG水平下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而滅活VSL#3+HFD組與HFD空白對照組比較水平稍低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；VSL#3+NFD組TC、TG水平與NFD空白對照組及滅活VSL#3+NFD組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4益生菌對小鼠肝臟組織中DAG、PKC表達(dá)的影響 HFD各組較NFD各組小鼠肝臟組織中均具有較高水平的DAG、PKC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；經(jīng)過活性益生菌干預(yù)后，VSL#3+HFD組DAG、PKC水平較HFD空白對照組及滅活VSL#3+HFD組均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；HFD空白對照組與滅活VSL#3+HFD組之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而VSL#3+NFD組較滅活VSL#3+NFD組及NFD空白對照組比較較其肝臟組織中DAG表達(dá)水平稍降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PKC在NFD3組間的表達(dá)無明顯差異(P>0.05)。見表3。

2.5代謝指標(biāo)與肝臟組織內(nèi)DAG及PKC的相關(guān)性分析 通過對各組小鼠體質(zhì)量的評估以及其TC、TG、FBG、FINS、HOMA-IR及肝臟組織中DAG、PKC水平的檢測，并以Pearson法行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示DAG與PKC表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；DAG水平的升高與體質(zhì)量、FBG及HOMA-IR呈正相關(guān)(P<0.05)；PKC水平的升高與TG、FBG、HOMA-IR呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

3 討論

2型糖尿病發(fā)病機(jī)制主要為IR。IR是指靶細(xì)胞(肝臟、骨骼肌等)對循環(huán)中正常水平的胰島素反應(yīng)性降低，導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，進(jìn)而引起了機(jī)體胰島素水平的升高[12]。目前已知引起IR有多個(gè)危險(xiǎn)因素，包括吸煙、服用噻嗪類利尿藥、使用糖皮質(zhì)激素等，最關(guān)鍵的是肥胖[13]。肥胖主要是因?yàn)槟芰看x失衡導(dǎo)致脂質(zhì)在體內(nèi)蓄積，而肝臟在機(jī)體能量代謝中有著重要的作用，同時(shí)肝臟也是重要的胰島素靶器官。正常狀態(tài)下，胰島素可促進(jìn)肝臟脂肪的合成，抑制糖異生，脂肪酸與甘油骨架縮合形成TG，而當(dāng)營養(yǎng)攝入過剩時(shí)，脂肪酸向肝臟的輸送遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了脂肪氧化和TG的合成和儲(chǔ)存的速度，引起肝內(nèi)脂質(zhì)含量的凈增加，進(jìn)而引起肝臟組織內(nèi)DAG含量增加，這是導(dǎo)致肝臟IR的主要原因[6-7]。DAG作為PKC的激活劑，既往在多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)了DAG-PKC通路在肥胖介導(dǎo)的IR中發(fā)揮著作用[6]。在一項(xiàng)對肥胖患者的研究中顯示，糖尿病(DM)較非DM患者細(xì)胞中DAG水平增加，同時(shí)伴隨著PKC的增加，DAG水平與胰島素敏感性呈負(fù)相關(guān)[14]。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠經(jīng)過高脂飼養(yǎng)后體質(zhì)量、TC、TG、FBG、HOMA-IR水平上升，提示小鼠經(jīng)過高脂喂養(yǎng)出現(xiàn)了肥胖與IR，這與既往研究一致[15]。進(jìn)一步檢測顯示HFP各組小鼠肝臟組織中DAG、PKC水平增加，經(jīng)Pearson相關(guān)性分析提示DAG-PKC表達(dá)增加與IR的發(fā)生有正相關(guān)關(guān)系。

表1 益生菌干預(yù)對高脂飲食小鼠WT、FBG、FINS及HOMA-IR的影響

表2 益生菌干預(yù)對高脂飲食小鼠血脂的影響

表3 益生菌干預(yù)對高脂飲食小鼠肝臟組織內(nèi)DAG、PKC表達(dá)的影響

表4 代謝指標(biāo)與肝臟組織內(nèi)DAG及PKC的相關(guān)性分析

益生菌作為一種微生物制劑，在調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群的平衡方面起著重要作用。研究顯示腸道微生物群的變化可能在代謝疾病的發(fā)展中發(fā)揮重要作用[16]。既往多個(gè)研究中顯示，IR可通過短期內(nèi)高脂肪含量飲食干預(yù)引起，當(dāng)血糖異常升高時(shí)，腸道菌群在構(gòu)成上發(fā)生改變，因此高脂飲食不僅會(huì)改變腸道菌群組分，還可對肥胖患者/小鼠的能量代謝產(chǎn)生影響，而益生菌補(bǔ)充已被證明能改善肥胖或糖尿病等存在IR狀態(tài)的患者/小鼠的糖脂代謝水平[10，17]。在使用不同種類益生菌(嗜酸性乳桿菌、短雙歧桿菌)對高脂飲食飼養(yǎng)大鼠進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示兩種益生菌都可改善IR相關(guān)指標(biāo)，同時(shí)對大鼠的生長發(fā)育無干擾。并提出兩種益生菌在調(diào)脂、減重方面的作用相差不大，但在調(diào)節(jié)IR方面，前者則略差于后者[18]。益生菌補(bǔ)充可能是改善代謝健康和預(yù)防飲食誘導(dǎo)的IR和2型糖尿病的有效策略。本實(shí)驗(yàn)中，在經(jīng)過活性VSL#3干預(yù)后肥胖小鼠糖脂代謝相關(guān)指標(biāo)水平有所下降，肝臟組織中的DAG和PKC的表達(dá)降低，而滅活VSL#3+HFD組較HFD空白對照組無明顯變化；活性/滅活VSL#3干預(yù)對于普通飲食組小鼠的糖脂代謝指標(biāo)及肝臟組織中DAG、PKC變化則無明顯差異，這表明活性益生菌和DAG-PKC途徑在肥胖介導(dǎo)的IR發(fā)生中起重要作用，補(bǔ)充益生菌可緩解高脂飲食誘導(dǎo)的IR，這種機(jī)制可能與DAG-PKC信號(hào)通路降低有關(guān)。

肥胖誘導(dǎo)代謝綜合征機(jī)制十分復(fù)雜，且多種機(jī)制之間可能存在著相互影響。本實(shí)驗(yàn)通過飲食誘導(dǎo)肥胖，證實(shí)了肥胖可通過介導(dǎo)DAG-PKC信號(hào)通路引起IR及脂代謝的紊亂，進(jìn)一步通過研究益生菌干預(yù)對IR的影響，驗(yàn)證了活性益生菌可改善肥胖引起的IR及脂代謝紊亂，該機(jī)制可能與DAG-PKC信號(hào)通路有關(guān)。為益生菌對肥胖等代謝綜合征的影響及其相關(guān)機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ)和思路。但益生菌的種類繁多，且DAG、PKC存在多種分型，參與多種生理傳導(dǎo)活動(dòng)，在今后的研究中，應(yīng)對不同亞型的DAG、PKC以及不同種類和劑量的益生菌進(jìn)行深入研究。