紅景天苷對(duì)人肺腺癌PC9細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用*

張鵬，孫婉瑾，李嫚，徐玉婷

(1.湖北省中醫(yī)院藥事部，武漢 430074；2.湖北省腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430079)

肺癌仍是目前死亡率最高的惡性腫瘤之一。許多肺癌患者在就診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，多數(shù)肺癌患者死亡是由癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移引起[1]，最近研究[2-3]表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用。EMT是指上皮細(xì)胞失去其上皮特征，獲得間質(zhì)特性的過(guò)程，它不僅參與胚胎形態(tài)的形成、心臟的發(fā)育和慢性退行性纖維化，而且促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[4-5]。

紅景天苷(Salidroside)的化學(xué)名為對(duì)羥基苯乙基-β-D-葡萄糖苷，其苷元為對(duì)羥基苯乙醇，即酪醇。紅景天苷具有廣泛的生物活性，如抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)骨骼肌生長(zhǎng)、抗氧化、增體質(zhì)、抗疲勞、抗肌萎縮，保護(hù)肝臟、神經(jīng)、肺、呼吸道、心臟以及降血糖、調(diào)血脂、抗肥胖等作用。WANG等[6]證實(shí)了紅景天苷對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制作用是抑制了胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)與磷酸化p38的表達(dá)。但紅景天苷對(duì)肺癌細(xì)胞的研究鮮有報(bào)道。本研究以非小細(xì)胞肺癌PC9細(xì)胞為研究對(duì)象，以一定濃度的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)處理后，給予不同濃度紅景天苷處理，觀察其對(duì)肺腺癌PC9細(xì)胞EMT的影響。

1 材料與方法

1.1材料及試劑 人肺腺癌PC9細(xì)胞為上海肺科醫(yī)院肺癌免疫研究室常規(guī)傳代培養(yǎng)；小鼠抗人上皮細(xì)胞鈣粘蛋白(E-cadherin)、神經(jīng)型鈣粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、平滑肌肌動(dòng)蛋白-α(α-SMA)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin，美國(guó)Abcam公司，批號(hào)分別為Ab76055，Ab18203，Ab8978，Ab7817，Ab32572)。羊抗小鼠IgG(武漢Bioswamp公司，批號(hào)：PAB150009)；DMEM(美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)：SH30022.01B)；TGF-β1(美國(guó)Peprotech公司，批號(hào)：100-21)；纖維連接蛋白(FN)(北京Solarbio公司，批號(hào)：F8180)；紅景天苷(北京Solarbio公司，批號(hào)：SS8080，純度HPLC≥98%)。紅景天苷用DMSO溶解后，作用于細(xì)胞的濃度現(xiàn)配(1，5，10 和20 μg·mL-1)。

1.2儀器 酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：Multiskan FC)，恒溫培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：311)，顯微鏡(日本Nikon公司，型號(hào)：TS100-F)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司，型號(hào)：FC500 MCL)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) 肺腺癌PC9細(xì)胞在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下用含10%新生牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1慶大霉素、低糖-DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化傳代。細(xì)胞培養(yǎng)至融合70%～80%后，用無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓過(guò)夜，再加入TGFβ1誘導(dǎo)細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化處理48 h，按實(shí)驗(yàn)要求分為6組：對(duì)照組，TGF-β1刺激組，刺激+紅景天苷組1 μg·mL-1(sali 1 μg·mL-1組)，刺激+紅景天苷組5 μg·mL-1(sali 5 μg·mL-1組)，刺激+紅景天苷組10 μg·mL-1(sali 10 μg·mL-1組)，刺激+紅景天苷組20 μg·mL-1(sali 20 μg·mL-1組)，肺腺癌PC9細(xì)胞在5 ng·mL-1的TGF-β1刺激30 min后，再給予紅景天苷干預(yù)，分別在干預(yù)后24，48，72 h后進(jìn)行MTT檢測(cè)，在各時(shí)間段顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并攝像記錄。

1.4MTT繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，接種于96孔板，每孔細(xì)胞密度約1.0×104個(gè)，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔內(nèi)加入MTT(5 mg·mL-1)10 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄去每孔的液體，并以每孔150 μL的計(jì)量加入二甲亞砜，震蕩5～10 min，使甲臜顆粒充分溶解。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm及570 nm的吸光度(A)值，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.5流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人肺腺癌PC9細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，按每孔1.0×104個(gè)，將細(xì)胞均勻的接種到6孔板中，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件培養(yǎng)過(guò)夜；用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞，1000 r·min-1，離心5 min，去上清液，PBS重懸潤(rùn)洗2次；1000 r·min-1，離心5 min，去上清液，PBS重懸細(xì)胞100 μL，緩慢加入預(yù)冷的80%乙醇700 μL，使乙醇終濃度為70% 4 ℃固定4 h以上，1000 r·min-1，離心5 min，預(yù)冷PBS潤(rùn)洗2次，加入100 μL RNase(50 μg·mL-1)，37 ℃水浴30 min加入PI(50 μg·mL-1)400 μL，4 ℃避光染色30 min流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6Western blotting 分析 冰面上RIPA蛋白裂解液裂解細(xì)胞，每5 min振蕩1次，裂解 20 min，4 ℃下15 000 r·min-1，離心30 min，吸取上清液獲取總蛋白。根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳2.5 h，轉(zhuǎn)膜后NC膜TBS稍蕩洗，5% 脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃下分別孵育E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、a-SMA、β-Catenin一抗過(guò)夜，TBST洗10 min×3次，室溫孵育二抗1 h，TBST洗10 min，重復(fù)3次，曝光顯影；采用 BIO-RAD Image Lab 版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS17.0版統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn) 與Con組比較，TGF-β1組細(xì)胞增殖能力顯著上升(t=207.277，P<0.05)。與TGF-β1組比較，sali 1 μg·mL-1、sali 5 μg·mL-1組、sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組的細(xì)胞增殖力均顯著降低(F=1665.398，P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.2細(xì)胞凋亡 與Con組[(4.58±0.27)%]比較，與TGF-β1組[(6.21±1.61)%]的凋亡率上升，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.741，P>0.05)。與TGF-β1組比較，sali 1 μg·mL-1組[(7.33±1.11)%]凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.987，P>0.05)；sali 5 μg·mL-1組[(13.71±1.66)%]，sali 10 μg·mL-1組[(26.15±0.83)%]和sali 20 μg·mL-1組[(28.33±1.11)%]的細(xì)胞凋亡率均顯著升高(F=180.969，P<0.05)，且在一定范圍內(nèi)，凋亡率隨著藥物劑量的增加而增加。sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組細(xì)胞凋亡率均顯著高于sali 5 μg·mL-1組和sali 1 μg·mL-1組。見(jiàn)圖2。

2.3細(xì)胞形態(tài)觀察 Con組細(xì)胞形態(tài)多成橢圓形或者圓形，而經(jīng)過(guò)TGF-β1處理后，大部分細(xì)胞形態(tài)都明顯拉長(zhǎng)，細(xì)胞呈梭形，相鄰細(xì)胞間連接也變得疏松。sali 1 μg·mL-1組的細(xì)胞形態(tài)和TGF-β1組形態(tài)相似，而sali 5 μg·mL-1組，sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組的細(xì)胞形態(tài)均多半呈橢圓形，細(xì)胞之間連接緊密。見(jiàn)圖3。

2.4相關(guān)標(biāo)記蛋白的表達(dá) 與Con組比較，TGF-β1組的N-cadherin、FN、Vimentin、α-SMA的表達(dá)顯著上升(t=66.452，403.664，161.580，136.670，P<0.05)，而E-cadherin、β-catenin的表達(dá)顯著降低(t=261.827，154.260，P<0.05)。與TGF-β1組比較，sali 1 μg·mL-1組、sali 5 μg·mL-1組、sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組的N-cadherin、FN、Vimentin、α-SMA的表達(dá)均顯著降低(F=53 988.214，82 179.748，33 362.584，64 734.791，P<0.05)，而E-cadherin、β-catenin的表達(dá)顯著升高(F=54 726.455，63 095.118，P<0.05)。見(jiàn)圖4和表1。

圖2 6組細(xì)胞凋亡率

圖3 6組細(xì)胞形態(tài)

3 討論

腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤發(fā)展的重要步驟，是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡率高的重要原因[7]。因此，為了控制惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移，研究腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制和特點(diǎn)十分有必要。腫瘤轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的過(guò)程，首先腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)病灶，通過(guò)血管生成和基底膜重建進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，經(jīng)淋巴管、血管，抵達(dá)靶器官，形成轉(zhuǎn)移腫瘤[8-9]。進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞要到達(dá)靶器官要克服循環(huán)系統(tǒng)的種種障礙，而EMT能令上皮細(xì)胞表型和表面抗原均發(fā)生改變，增強(qiáng)細(xì)胞的遷徙能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[10]。上皮細(xì)胞之間連接緊密，游離面和基底面均有顯著極性，且高度有序，形態(tài)相對(duì)穩(wěn)定一致[11-12]；EMT的發(fā)生使細(xì)胞間緊密的連接被打破，失去了原有的有序性，穩(wěn)定性和極性，呈現(xiàn)出形態(tài)各異，排列松散的間質(zhì)細(xì)胞特性。本研究首先探討了紅景天苷對(duì)肺腺癌PC9細(xì)胞增殖和凋亡影響，發(fā)現(xiàn)sali 5 μg·mL-1組，sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組的細(xì)胞增殖力下降且凋亡率顯著升高，表明紅景天苷可以抑制肺腺癌PC9細(xì)胞的增殖并促進(jìn)凋亡；進(jìn)一步，筆者通過(guò)細(xì)胞形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，Con組細(xì)胞形態(tài)多成橢圓形或者圓形，經(jīng)過(guò)TGF-β1處理后，相鄰細(xì)胞間連接也變得疏松。而經(jīng)過(guò)紅景天苷處理的細(xì)胞形態(tài)多半呈橢圓形，細(xì)胞之間連接較緊密，提示紅景天苷減少肺腺癌PC9細(xì)胞EMT的發(fā)生。

1.Con組；2.TGF-β1組；3.sali 1 μg·mL-1組，4.sali 5 μg·mL-1組，5.sali 10 μg·mL-1組，6.sali 20 μg·mL-1組。

表1 6組相關(guān)標(biāo)記蛋白的相對(duì)表達(dá)量

在腫瘤惡性程度進(jìn)展的過(guò)程中上皮細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白E-cadherin下調(diào)，表明腫瘤細(xì)胞的粘附能力下降，運(yùn)動(dòng)和浸潤(rùn)能力增強(qiáng)[13-15]，而在神經(jīng)系統(tǒng)和間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的N-cadherin上調(diào)[16]。Vimentin和α-SMA是間質(zhì)樣細(xì)胞的標(biāo)志性分子，通常在上皮細(xì)胞中不表達(dá)。具有高侵襲性的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞則通常伴有Vimentin和α-SMA的高表達(dá)，而將細(xì)胞中Vimentin或α-SMA沉默之后，細(xì)胞明顯減弱甚至失去侵襲遷移能力[17-18]。在本研究中，sali 5 μg·mL-1組，sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組的Vimentin和α-SMA的表達(dá)均顯著降低，而E-cadherin的表達(dá)顯著升高，N-cadherin顯著降低，提示TGF-β1組的細(xì)胞發(fā)生上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，經(jīng)不同濃度紅景天苷處理后，sali 5 μg·mL-1組，sali 10 μg·mL-1組和sali 20 μg·mL-1組的Vimentin，F(xiàn)N，α-SMA表達(dá)下調(diào)，提示細(xì)胞的EMT減弱，紅景天苷能明顯減少肺腺癌PC9細(xì)胞EMT的發(fā)生，預(yù)防腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，與形態(tài)學(xué)觀察的結(jié)果一致。

β-catenin蛋白肽鏈中部arm區(qū)域，可以和E-cadherin、上皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)等蛋白結(jié)合而發(fā)揮多種功能[19]。β-catenin對(duì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和EMT有關(guān)鍵的調(diào)控作用，同時(shí)也是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白[20]，其在細(xì)胞質(zhì)中的濃度直接影響著Wnt信號(hào)通路。在正常的上皮細(xì)胞中，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin含量較少，大量的外源性轉(zhuǎn)錄因子并不能引發(fā)細(xì)胞的EMT現(xiàn)象，而在腫瘤細(xì)胞中，由于β-catenin的調(diào)控系統(tǒng)障礙使β-catenin在核內(nèi)聚集，外源性的轉(zhuǎn)錄因子可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生的EMT改變。另一方面，β-catenin和E-鈣黏素胞內(nèi)區(qū)相連，形成β-catenin/E-cadherin復(fù)合體，該復(fù)合體在維持上皮極性，穩(wěn)定性和完整性中發(fā)揮重要作用[21]。本研究中sali 20 μg·mL-1組β-catenin表達(dá)顯著升高，說(shuō)明紅景天苷通過(guò)上調(diào)β-catenin抑制細(xì)胞中EMT的發(fā)生。

綜上所述，TGF-β1可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，紅景天苷可能通過(guò)上調(diào)β-catenin抑制肺癌細(xì)胞中EMT的發(fā)生，減少間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，延緩腫瘤細(xì)胞的遷移。