‘翠香’獼猴桃離體再生研究

丁光雪,楊迪,辛納慧,李鈺媛,張乃群*

‘翠香’獼猴桃離體再生研究

丁光雪1,楊迪2,辛納慧3,李鈺媛3,張乃群3*

1. 南陽幼兒師范學校, 河南 南陽 474150 2. 南陽農(nóng)業(yè)職業(yè)學院, 河南 南陽 473000 3. 南陽師范學院生命科學與農(nóng)業(yè)工程學院, 河南 南陽 473061

本文以‘翠香’獼猴桃?guī)б秆壳o段為外植體，研究了不同激素配比對‘翠香’獼猴桃莖段腋芽誘導、增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的影響，并進行移栽。研究表明：‘翠香’獼猴桃最優(yōu)的莖段腋芽誘導培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA，誘導率為88.89%；最優(yōu)的增殖培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+5 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA，增殖系數(shù)達6.20，三代連續(xù)增殖穩(wěn)定；生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.9 mg·L-1IBA，生根率為94.44%，根數(shù)為11.40，根長為2.94；煉苗后移栽成活率達88.33%。此研究為‘翠香’獼猴桃的組織培養(yǎng)工廠化育苗提供了技術支持。

‘翠香’獼猴桃; 離體培養(yǎng); 育苗

美味獼猴桃（var.）又稱硬毛獼猴桃，是中華獼猴桃的一個變種，屬大型落葉藤本[1]，在秦嶺一帶廣為分布，休眠枝條冬季抗凍閾值在-10 ℃～18 ℃之間[2]，果實大，被有刺狀長硬毛，維生素C含量40～350 mg·100 g-1，還含有豐富的糖類、有機酸、氨基酸等，不僅食用價值高，且具備清熱、消炎、抗癌等藥用價值。隨著人們對美味獼猴桃的認識及現(xiàn)代育種技術的不斷發(fā)展，選育出了大量的優(yōu)質(zhì)獼猴桃品種，如‘徐香’[3]、‘華美二號’[4]、‘秦美’[5]、‘貴長’[6]等。但對于苗木繁殖，生產(chǎn)上主要采用扦插、嫁接等方式[7]，美味獼猴桃類扦插成活率普遍較低[8]，春季嫁接又是獼猴桃潰瘍病多發(fā)季節(jié)[9]，影響獼猴桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。水果產(chǎn)業(yè)重在品質(zhì)，組織培養(yǎng)具有不受生長季節(jié)限制、繁殖快、遺傳性狀穩(wěn)定等特點[10]，已成為獼猴桃苗木繁育的重要手段。

‘翠香’獼猴桃也是選自美味獼猴桃，果肉呈翠綠色，味香且質(zhì)地細膩[11]，抗逆性強，是目前綜合性狀最好的中早熟品種，經(jīng)濟效益顯著，廣受消費者歡迎[12]。當前國內(nèi)外對‘翠香’獼猴桃組織培養(yǎng)的研究尚未見報道，因此，本研究利用帶腋芽莖段為外植體，研究了‘翠香’獼猴桃腋芽誘導、多代增殖、生根培養(yǎng)、煉苗移栽的情況，建立了離體快繁體系，以期為‘翠香’獼猴桃種質(zhì)資源的保存及優(yōu)質(zhì)苗木生產(chǎn)提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料取自西峽縣獼猴桃種植基地，取健壯的幼嫩枝條用于組培試驗。

1.2 方法

1.2.1 取材時間、培養(yǎng)條件與消毒處理取材時間為4～6月。培養(yǎng)條件為光照時間12 h·d-1，光照強度為1500～2000 Lx，培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃，下述所有培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂6.0 g·L-1、pH調(diào)整為5.8～6.2。取來的枝條需清水沖洗約0.5 h，再剪切為長約2～3 cm、帶1～2個腋芽的莖段，置于超凈工作臺內(nèi)消毒處理。消毒處理先以75%酒精浸泡莖段30 s，再以0.1%的升汞消毒7 min，無菌水沖洗5次，后接種于腋芽誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.2 ‘翠香’獼猴桃莖段腋芽的誘導腋芽誘導的基本培養(yǎng)基為MS，分別添加質(zhì)量濃度不同的6-BA（2.0、3.0、4.0 mg·L-1）、NAA（0.1、0.2 、0.3 mg·L-1），共9個處理，每個處理30瓶，每瓶1個莖段，重復3次，記錄帶腋芽莖段狀態(tài)變化，于25 d后統(tǒng)計結果。

1.2.3 ‘翠香’獼猴桃增殖培養(yǎng)選擇誘導出的健壯腋芽，切下接種至增殖培養(yǎng)基MS，分別添加質(zhì)量濃度不同的6-BA（3.0、4.0、5.0 mg·L-1），NAA（0.4、0.5、0.6 mg·L-1），共9個處理，每個處理30個芽，3次重復，50 d時記錄增殖系數(shù)。再選擇最優(yōu)的增殖培養(yǎng)基，進行第二代、第三代增殖培養(yǎng)，30個芽，3次重復，記錄數(shù)據(jù)，比較三代增殖系數(shù)的差異性。

1.2.4 ‘翠香’獼猴桃生根培養(yǎng)叢生芽長至2～4 cm后，分別切下進行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)以1/2MS為基本培養(yǎng)基，分別添加不同質(zhì)量濃度（0.7、0.9、1.1 mg·L-1）NAA、IBA，共6個處理，每個處理30個芽，重復3次，40 d后統(tǒng)計結果。

1.2.5 煉苗移栽生根培養(yǎng)得到的長勢優(yōu)良的幼苗放到自然環(huán)境條件下放置3～5 d，再開蓋煉苗2 d，定時進行葉片噴水保濕。然后，取出組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到細沙土中，定時淋水，移栽20株，重復3次，30 d后統(tǒng)計移栽成活率。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及分析誘導率（%）=誘導出芽的莖段（葉片、葉柄）數(shù)/接種的莖段（葉片、葉柄）總數(shù)×100%；

增殖系數(shù)=誘導后不定芽總數(shù)/原接種芽數(shù)；

生根率（%）=生根芽數(shù)/接種芽數(shù)×100%；

移栽成活率（%）=存活苗數(shù)/移栽苗數(shù)×100%。

數(shù)據(jù)整理采用Excel 2019，顯著性分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件和Duncan多重比較法。

2 結果與分析

2.1 腋芽誘導

表1 激素配比對‘翠香’獼猴桃莖段腋芽誘導的影響

注：不同小寫字母表示同列差異顯著（<0.05）。下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatment groups (<0.05). These same below.

‘翠香’獼猴桃?guī)б秆壳o段經(jīng)約7 d培養(yǎng)，基部的切口處略顯肥大，約14 d會出現(xiàn)愈傷組織，呈淺綠色。由表1可知，‘翠香’獼猴桃的腋芽誘導率隨6-BA濃度的增加，在NAA濃度為0.1 mg·L-1時，呈現(xiàn)為“低-高-低”，在NAA濃度為0.2、0.3 mg·L-1時，逐漸降低；當6-BA濃度一定時，隨NAA濃度的升高，6-BA的濃度為2.0 mg·L-1時，誘導率呈現(xiàn)為逐步升高，6-BA的濃度為3.0、4.0 mg·L-1時，逐漸降低；在6-BA的濃度為2.0 mg·L-1、NAA的濃度為0.3 mg·L-1時，腋芽誘導率達到最高88.89%，其次是6-BA 2.0 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1，達到87.78%，接著是6-BA 3.0 mg·L-1、NAA 0.1 mg·L-1，達83.33%，三者間在無顯著差異（<0.05），但顯著差異于其余處理，誘導率最低的是6-BA 4.0 mg·L-1、NAA 0.3 mg·L-1，僅3.33%，莖段多褐化。

表2 ‘翠香’獼猴桃莖段腋芽誘導的方差分析

從表2方差分析可以看出，在‘翠香’獼猴桃莖段腋芽誘導過程中，細胞分裂素6-BA對誘導率影響最大，其值270.279，在0.01水平達到顯著，6-BA、NAA、6-BA與NAA組合均在0.01水平顯著影響誘導率。結合表1可得，‘翠香’獼猴桃莖段腋芽誘導最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA，具有顯著的誘導效果（圖1）。

圖1 莖段腋芽萌發(fā)

2.2 增殖培養(yǎng)

在增殖培養(yǎng)的過程中，接種的芽7 d左右會長出少量的愈傷組織，約第14 d會發(fā)現(xiàn)愈傷組織上長出了芽點。接種后21 d左右會發(fā)現(xiàn)所有不定芽的基部都會形成愈傷組織塊且有大量的芽點產(chǎn)生，在30～40 d間，之前觀察到的不定芽點會長成健壯的不定芽，葉和莖也都有適當?shù)姆只▓D2:左）。在40～50 d間叢生芽基本上不會繼續(xù)增殖，只有葉和莖會繼續(xù)生長。50 d以后，部分芽會出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。表1呈現(xiàn)的是50 d時記錄的接種芽增殖情況，由表1可以看出，7號激素組合的試驗結果最好，增殖系數(shù)為6.20，其培養(yǎng)瓶內(nèi)的叢生芽莖葉分化適中，長勢好，與其他增殖系數(shù)在0.05水平上差異顯著；3號激素組合的增殖系數(shù)最低，為2.11，培養(yǎng)瓶中的芽黃、畸形且只有個別芽增殖。試驗結果表明，當NAA濃度為0.4 mg/L時，增殖系數(shù)依據(jù)6-BA濃度的增加而升高；當NAA濃度為0.5、0.6 mg/L時，增殖系數(shù)也隨6-BA濃度的增加而升高，但其增殖系數(shù)的最大值均小于NAA為0.4 mg/L時的最大值，故增殖系數(shù)在6-BA為5 mg/L時取得最大值。當6-BA的濃度一定時，增殖系數(shù)依據(jù)NAA濃度的增加而減小，可見，NAA濃度為0.4 mg/L時適于‘翠香’獼猴桃不定芽的增殖。因此，‘翠香’獼猴桃不定芽增殖的最佳激素組合為MS+5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA。

圖2 增殖培養(yǎng)

a:第一代 The first generation；b:第二代 The second generation；c:第三代 The third generation

表3 不同濃度組合的6-BA、NAA對‘翠香’獼猴桃不定芽增殖的影響

選擇MS+5 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA培養(yǎng)出來的芽，繼續(xù)進行第2代、第3代增殖。試驗中發(fā)現(xiàn)，第2代增殖的芽長勢正常，大部分芽可清晰觀察，增殖效果較好（圖2b），第3代增殖芽大多數(shù)都長勢好，葉片平展（圖2c），只有個別葉片卷曲，稍有畸形。由圖3可知，培養(yǎng)三代的增殖系數(shù)在0.05水平上無顯著差異，第2代繼代培養(yǎng)的增殖系數(shù)略高于第1代的，到第3代時略有下降，但總體上增殖系數(shù)還是比較穩(wěn)定的。

圖3 ‘翠香’猴猴桃3次繼代增殖的差異比較

注: 相同字母表示在0.05水平上差異不顯著

Note: The same letter means that the difference is not significant at the 0.05 level

2.3 生根培養(yǎng)

由表4可知，NAA或IBA單獨作用時，‘翠香’獼猴桃芽的生根率均較高，IBA 1.1 mg·L-1處理最高，達95.56%，IBA 0.9 mg·L-1處理次之，為94.44%，NAA 0.7 mg·L-1最低，為86.67%，所有的處理生根率無顯著差異。根數(shù)最多的為IBA 0.9 mg·L-1處理，達11.40條，與其余5個處理有顯著差異，而其余5個處理根數(shù)間無顯著差異，根數(shù)最少為NAA 1.1 mg·L-1，根數(shù)的變化隨IBA或NAA濃度的升高先增后減。根長最長處理為IBA 0.9 mg·L-1，平均長度為2.94 cm，除IBA 0.7 mg·L-1處理的根長外，顯著長于其他處理，而IBA 0.7 mg·L-1根長的平均長度為2.69 cm，兩者有一定差距，根長最短處理為NAA 0.7 mg·L-1，平均長度為2.30 cm，根長的變化也是隨IBA或NAA濃度的升高先增后減。綜上所述，篩選出‘翠香’獼猴桃生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+0.9 mg·L-1IBA，生根效果良好（圖4）。

表4 不同濃度激素對‘翠香’獼猴桃生根的影響

2.4 煉苗移栽

移栽30 d后統(tǒng)計，‘翠香’獼猴桃組培苗的移栽成活率為（88.33%±7.63%），長勢健壯。

3 討 論

在已報道的獼猴桃組織培養(yǎng)中，除了莖段，葉片[13]、葉柄[14]、花藥[15]等培養(yǎng)也有報道，而帶腋芽莖段培養(yǎng)是離體快繁最有效、遺傳最穩(wěn)定的途徑。本研究采用‘翠香’獼猴桃的帶腋芽莖段為外植體，腋芽誘導率為88.89%，與源自美味獼猴桃的其他品種相比[16,17]，誘導率略低，說明‘翠香’獼猴桃莖段腋芽誘導有待進一步優(yōu)化。經(jīng)過方差分析，發(fā)現(xiàn)6-BA對腋芽誘導影響最大，NAA也有顯著影響，兩者共同作用于腋芽誘導，但當激素濃度過高時，誘導效果很差。這與隆前進等[18]在‘紅陽’獼猴桃中、楊迪等[19]在‘楊氏金紅50號’中的研究結果一致，因此，激素配比決定著初代培養(yǎng)的是否成功。

增殖培養(yǎng)基中，6-BA、NAA組合能有效促進叢生芽形成，最高增殖系數(shù)為6.20，與其他研究有一定差異。隆前進等[18]培養(yǎng)‘紅陽’的最高增殖系數(shù)為4.5，吳秀華等[20]培養(yǎng)‘海沃德’的最高增殖系數(shù)為6.38，張艷玲等[21]培養(yǎng)‘秦美’獼猴桃的最高增殖系數(shù)為6.43?？梢?，不同品種獼猴桃對激素濃度組合的響應有一定差異，這與基因型差異關系很大。本研究在做了3代增殖后發(fā)現(xiàn)，增殖系數(shù)第3代有降低，個別葉片出現(xiàn)畸形，趙芮[22]以軟棗獼猴桃組培苗為材料進行繼代增殖，發(fā)現(xiàn)其最佳的增殖周期為40 d，當繼代的時間大于40 d時，增殖系數(shù)降低，葉片開始失綠、畸形甚至脫落。最佳的繼代次數(shù)為6次，在第3～5次時，增殖系數(shù)逐漸增大，在第6次時增殖系數(shù)達到最大值，在第7～9次時，增殖系數(shù)逐漸降低，叢生芽生長變慢，葉片卷曲且畸形較多；張玉杰[23]以狗棗獼猴桃為材料做了7代繼代培養(yǎng)，在1～5代時增殖系數(shù)會逐漸增加，不定芽長勢健壯，葉片平展，6～7代時葉片開始出現(xiàn)卷曲、畸形，增殖系數(shù)降低。本次試驗的增殖周期為40 d，與趙芮[22]、張玉杰[23]所得的結論一樣，多代增殖效果的差異再次說明基因型的不同影響著獼猴桃的組織培養(yǎng)效果。

生根培養(yǎng)在組織培養(yǎng)中直接影響組培苗的移栽成活率，“1/2MS+IBA”對獼猴桃生根效果顯著。黃勝男等[24]所做的‘金魁’獼猴桃的最佳生根培養(yǎng)基為“1/2MS+0.7 mg·L-1IBA”，呂海燕等[25]所做的‘東紅’獼猴桃的最佳生根培養(yǎng)基為“1/2MS+0.5 μg·mL-1IBA”，本研究得出的最佳生根培養(yǎng)基為“1/2MS+0.9 mg·L-1IBA”，生根率、根數(shù)、根長均表現(xiàn)良好，移栽30 d后的苗根系明顯更加健壯發(fā)達。因此，本研究可為‘翠香’獼猴桃種苗快繁提供技術支持。

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志:第49(2)卷[M].北京:科學出版社,1984:260-261

[2] 林苗苗,孫世航,齊秀娟,等.獼猴桃抗寒性研究進展[J].果樹學報,2020,37(7):1073-1079

[3] 衛(wèi)行楷.美味獼猴桃優(yōu)良品種‘徐香’[J].中國果樹,1993(2):22-23

[4] 楊艷杰,何弘水.華美二號獼猴桃根提取物保肝作用的實驗研究[J].食品科技,2009,34(1):191-194

[5] 李夏,李學宏,潘曉紅.8個獼猴桃品種在陜西安康地區(qū)的生長表現(xiàn)[J].西北農(nóng)林科技大學學報(自然科學版), 2019,47(5):85-91

[6] 魯敏,黃亞欣,王國立,等.‘貴長’獼猴桃果實內(nèi)源激素的動態(tài)分布及含量變化與果實形狀發(fā)育的關系[J].植物生理 學報,2020,56(10):2159-2167

[7] 屈德洪,吳景芝,吳興恩,等.野生軟棗獼猴桃種子萌發(fā)及離體快繁技術研究[J].西部林業(yè)科學,2017,46(6):56-60

[8] 鐘彩虹,劉小莉,李大衛(wèi),等.不同獼猴桃種硬枝扦插快繁研究[J].中國果樹,2014(4):23-26,86

[9] 宋雅林,林苗苗,鐘云鵬,等.獼猴桃品種(系)潰瘍病抗性鑒定及不同評價指標的相關性分析[J].果樹學報,2020,37(6):900-908

[10] 薛蓮,古咸彬,王國軍,等.獼猴桃實生組培快繁體系的建立[J].中國南方果樹,2020,49(1):126-129

[11] 郭樂音,裴嘩嘩,趙倩兮,等.低溫貯藏對‘翠香’獼猴桃冷害和品質(zhì)的影響[J].食品工業(yè),2020,41(3): 175-179

[12] 郭樂音.溫度和限氣包裝對‘翠香’獼猴桃冷害及品質(zhì)的影響[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學,2019

[13] 趙許朋,趙曉朋,施豪,等.‘貴長’獼猴桃葉片高效直接再生體系的建立[J].中國生物工程雜志,2018,38(10):48-54

[14] 林苗苗,方金豹,齊秀娟,等.軟棗獼猴桃‘天源紅’離體再生體系的建立[J].廣西植物,2016,36(11):1358-1362,1302

[15] 王廣富.軟棗獼猴桃花藥培養(yǎng)及再生體系建立[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學院,2017

[16] 王羽悅.獼猴桃組織培養(yǎng)快速繁育技術研究[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學,2016

[17] 于紅梅,趙密珍,錢亞明,等.海沃德獼猴桃?guī)а壳o段的組織培養(yǎng)快繁技術[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學,2014,42(11):78-79

[18] 隆前進,吳延軍,謝鳴.‘紅陽’獼猴桃葉片和帶芽莖段的組織培養(yǎng)快繁技術[J].浙江農(nóng)業(yè)學報,2010,22(4):429-432

[19] 楊迪,趙新仕,鄒婷婷,等.‘楊氏金紅50號’獼猴桃的離體快繁研究[J].廣西植物,2018,38(12):1667-1674

[20] 吳秀華,張艷玲,周月,等.‘海沃德’獼猴桃葉片高頻直接再生體系的建立[J].植物生理學報,2013,49(8):759-763

[21] 張艷玲,吳秀華,周月,等.‘秦美’獼猴桃葉片高頻直接再生體系的建立[J].西南大學學報(自然科學版),2016,38(2):20-24

[22] 趙芮.軟棗獼猴桃離體快繁技術的研究[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學,2016

[23] 張玉杰.狗棗獼猴桃離體快繁的研究[D].長春:吉林農(nóng)業(yè)大學,2014

[24] 黃勝男,張計育,毛妮妮,等.美味獼猴桃品種‘金魁’離體葉片不定芽誘導及生根培養(yǎng)基篩選[J].植物資源與環(huán)境學 報,2016,25(1):105-107

[25] 呂海燕,李大衛(wèi),鐘彩虹.‘東紅’獼猴桃高效再生體系的建立[J].廣西植物,2019,39(4):464-471

Study on the Regeneration in Vitro ofvar.‘cuixiang’

DING Guang-xue1, YANG Di2, XIN Na-hui3, LI Yu-yuan3, ZHANG Nai-qun3*

1.4741502.4730003.473061

The stems with axillary buds ofvar.‘cuixiang’ was used as explants to study the effects of combinations of different plant growth regulator on induction of axillary buds, multiplication culture, rooting culture, and of transplanting. The most appropriate medium of induction of axillary buds was MS+2.0 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA, and a maximum induction rate was 88.89%. The most appropriate medium of multiplication culture was MS+5 mg·L-16-BA+0.4 mg·L-1NAA, and a maximum multiplication coefficient was 6.20, and stable multiplication effect within three generations. The most appropriate medium of rooting culture was 1/2MS+0.9 mg·L-1IBA, and a maximum rooting rate was 94.44%, rooting number was 11.40, roots length was 2.94. The survival rate of transplanting after refining seedlings reaches 88.33%. This study provides technical support for factory seedling ofvar.‘cuixiang’.

var.‘cuixiang’; in vitro; seeding

S663.4

A

1000-2324(2021)03-0388-06

2021-02-25

2021-04-20

河南省科技攻關項目(102102110159);河南省科技攻關計劃項目(172102110108)

Author for correspondence. E-mail:1361007227@qq.com

丁光雪(1969-),女,本科,高級講師,主要研究方向為植物資源保護與利用. E-mail:2858392540@qq.com