康復訓練介導NGF/VEGF/CD34表達對腦缺血再灌注大鼠血管再生的影響

何文娟,尹偉英,魏妮,謝輝

腦卒中與神經(jīng)運動功能障礙密切相關，是世界范圍內與四肢殘疾相關的重要疾病。腦卒中后神經(jīng)功能障礙嚴重影響了患者的生活質量，對國家、社會和家庭都帶來了沉重的經(jīng)濟、生活和精神負擔。腦卒中會伴隨多種病理變化，包括血管損傷，腦水腫，神經(jīng)元丟失和突觸功能障礙，血腦屏障破壞并最終會造成四肢運動能力下降[1-2]。臨床前研究顯示，MCAO后48h開始的早期運動訓練能夠升高梗死區(qū)周圍半影區(qū)巨噬細胞遷移抑制因子(Macrophage migration inhibitory, MIF)與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor, BDNF)，改善缺血性中風后的神經(jīng)元恢復[3]。此外，持續(xù)的康復性訓練能夠幫助缺血后大鼠腦中神經(jīng)再生與軸突再生，促進腦缺血后認知功能的恢復[4]。然而，這些研究尚不足以完全闡明康復訓練對缺血性腦卒中大鼠神經(jīng)運動功能改善的機制，因此，本研究擬探究康復訓練對于腦缺血再灌注大鼠腦中神經(jīng)血管再生的影響，為康復訓練在腦卒中患者中的應用提供更多的理論支持，為后期腦卒中患者輔助運動器械的開發(fā)提供思路。

1 資料與方法

1.1 實驗動物與方案設計 SPF級雄性健康SD大鼠，7周齡，體重(180±10)g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2014-0002。所有大鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房內，自由飲食及飲水，適應性喂養(yǎng)1周后，進行腦缺血再灌注動物模型制備。動物模型制備結束后24h選取神經(jīng)行為學評分2～3分的大鼠進行隨機分組，分為腦缺血組(24只)，康復組(16只)，假手術組(8只)，共48只大鼠。如圖1所示，康復組每天進行2次跑步訓練，跑步速率為5～10m/min遞增，每次30 min。

圖1 大鼠跑步訓練圖

1.2 實驗試劑與儀器 圓頭尼龍線栓由廣州佳靈生物科技公司提供；CD34鼠源單克隆抗體(1∶200)由武漢博士德生物制劑公司提供，血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)兔源多克隆抗體(1∶1000)、神經(jīng)生長因子(Nerve growth factor, NGF)兔源多克隆抗體(1∶1000)、β-肌動蛋白(β-actin)鼠源單克隆抗體(1∶1000)均由北京博奧森生物公司提供；HRP標記Goat anti-rabbit 二抗(1∶2000)與HRP標記rat anti-mouse 二抗(1∶2000)均由CST公司提供；2, 3, 5-氯化三苯四唑溶液由美國Thermo公司提供，BCA試劑盒由上海碧云天生物公司提供。

1.3 腦缺血再灌注模型制備 參考改良的Zea Longa法制備左側頸動脈栓塞再灌注模型[5]。術前大鼠禁食不禁水，術中完全麻醉大鼠(3%戊巴比妥鈉，劑量30mg/kg)，頸前正中位置開口，充分暴露組織并鈍性分離出左側頸總動脈，頸內動脈與頸外動脈，結扎頸外動脈遠心端，血管夾封閉頸內動脈與頸總動脈。在頸外動脈分叉部位開口，使用圓頭尼龍線栓插入頸總動脈，撤去頸內動脈血管夾，推動線栓進入顱腦中，以圓頭遠端距離分叉處約為15mm，固定線栓，縫合傷口。動物置于28℃溫室中蘇醒，待缺血2h后取出線栓。假手術大鼠僅打開皮膚，暴露血管，不進行插線栓操作。

1.4 評定標準 腦缺血24h后在缺血組中隨機挑選8只大鼠取腦組織用于檢測?？祻陀柧?d后對動物進行神經(jīng)功能評分并在腦缺血組與康復組中隨機各選取8只大鼠取腦組織用于檢測。14d后，完整取出剩余大鼠腦組織用于檢測。

1.4.1 神經(jīng)行為學評分 根據(jù)Zea Longa評分法對大鼠神經(jīng)行為學進行評分[5]。評分標準如下：0分，大鼠四肢正常，可以直線行走；1分，大鼠可直線行走，但右側前爪蜷縮；2分，大鼠不能直線行走，僅能向左對側轉圈；3分，大鼠運動呆滯，并易向左側傾倒；4分，大鼠意識喪失，完全癱瘓；5分，大鼠死亡。

1.4.2 腦梗死體積的檢測 大鼠康復訓練1周后，大鼠深度麻醉(3%戊巴比妥鈉，劑量40mg/kg)，冰上迅速開顱取腦，-20℃冰箱中冰凍10min，用鋒利刀片將腦組織切成6片薄片并置于2%的2, 3, 5-氯化三苯四唑(5-triphenyltetrazole chloride，TTC)溶液中，37℃溫箱中避光孵育30min，每5 分鐘翻動一次腦片，保證組織切片完全接觸到染液。

1.4.3 免疫組化 大鼠深度麻醉后(3%戊巴比妥鈉，劑量40mg/kg)，經(jīng)左心室使用生理鹽水沖洗血液，再以4%多聚甲醛灌注，取出腦組織使用梯度酒精進行脫水。脫水后，將腦組織置于乙醇和二甲苯混合溶液中透化，再經(jīng)石蠟包埋后切成5μm切片并進行下一步操作。取切片脫蠟至水，高壓、高溫條件下抗原修復15min，取4% BSA溶液封閉2h。洗去BSA溶液，滴加CD34抗體稀釋液(1∶200)，4℃孵育過夜，沖洗一抗，滴加堿性磷酸酶標記的二抗，室溫孵育1h后，洗去二抗后使用二氨基聯(lián)苯胺顯色30s，再次沖去二氨基聯(lián)苯胺后使用蘇木精復染20s，蒸餾水分化，最后在梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在顯微鏡下觀察并拍攝照片，應用Image Pro Plus軟件對CD34陽性染色區(qū)域進行光密度分析統(tǒng)計，以腦缺血再灌注后24h腦組織中CD34陽性染色區(qū)域光密度為基礎進行歸一化統(tǒng)計分析。

1.4.4 免疫印跡 大鼠深度麻醉后，冰上迅速取腦，分離出海馬組織，將裂解液按體積質量比5:1加入海馬組織中，冰上研磨勻漿，4℃再靜置裂解30min。高速冰凍離心機在4℃條件下12000rpm/min離心10min。取上清液，使用BCA試劑盒進行蛋白濃度定量，加入上樣緩沖液，沸水浴中使蛋白變性，以20μg組織蛋白量進行等量上樣，采用SDS-PAGE凝膠電泳法，濃縮膠為4%，分離膠為12%，調節(jié)電壓30min/60V，90min/90V進行凝膠電泳，以上樣緩沖液跑至膠底為終點。濕法轉膜法進行電泳轉膜，結束后使用脫脂奶粉封閉2h，再使用一抗稀釋液(1:1000)孵育過夜。次日，使用HRP標記的二抗稀釋液(1:2000)進行孵育，洗凈多余二抗后，均勻添加ECL發(fā)光液，顯影儀顯影后使用Image J軟件進行灰度值分析。

2 結果

2.1 3組大鼠神經(jīng)功能比較 無論何時，假手術組大鼠神經(jīng)功能評分均為0分。腦缺血24d后，腦缺血組和康復組神經(jīng)行為學評分差異無統(tǒng)計學意義，腦缺血7d及14d時，康復組神經(jīng)行為學評分明顯低于腦缺血組(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠腦缺血24h、7d及14d后神經(jīng)行為學評分比較 分，

2.2 3組大鼠缺血側腦區(qū)梗死面積比較 如圖2A所示，假手術組大鼠TTC染色腦組織為紅色，腦缺血組大鼠冠狀切片左側均能看見不同程度白色的梗死區(qū)域且與周圍正常的腦組織界限清晰。隨著時間的推移，雖然大鼠出現(xiàn)一定程度的自愈，但腦缺血組各個時間點大鼠缺血側組織梗死仍然很嚴重。與腦缺血組相比，康復組在腦缺血7d、14d時大鼠缺血區(qū)梗死面積顯著減少(P<0.05)。見圖2B。

圖2A 各組大鼠腦組織TTC染色(紅色代表非梗死區(qū)，白色代表梗死區(qū)域)

2.3 3組大鼠缺血側腦區(qū)血管新生情況比較 CD34是血管新生的標志性抗原，CD34陽性染色呈棕色條狀分布。如圖3所示，假手術組新生血管極少，腦缺血組誘導了血管新生，且與腦缺血組相比，無論是術后7d還是14d，康復組大鼠腦中新生血管都顯著多于腦缺血組大鼠(P<0.05)。

2.4 3組大鼠缺血側腦區(qū)NGF/VEGF蛋白量比較 如圖4所示，與腦缺血組相比，康復組腦缺血7d，14d時大鼠腦中NGF與VEGF表達均顯著升高(P<0.05)。

圖3A 3組大鼠缺血區(qū)CD34染色(黑色箭頭代表CD34陽性染色區(qū)域)

圖4 3組大鼠缺血區(qū)NGF/VEGF表達與量化統(tǒng)計(與腦缺血組/24h比較，aP<0.05；與腦缺血組/7d比較，bP<0.05；與腦缺血組/14d比較，cP<0.05)

3 討論

腦卒中損傷涉及病理生理機制復雜，主要有炎癥反應，氧化應激反應，血腦屏障損傷，離子動態(tài)平衡紊亂等[6]。此外，腦組織結構復雜，但對缺血缺氧耐受性低，修復性差，臨床上不僅需要使用藥物干預幫助患者康復，而且增加患者自身的自愈能力也是治療腦卒中的重點[7]。本研究中，腦缺血再灌注模型成功造成大鼠四肢運動障礙，與臨床患者缺血對側身體部分或完全癱瘓一致，因此本研究中腦缺血再灌注介導大鼠運動功能損傷模型造模成功。雖然隨著時間推移，大鼠行為功能也會出現(xiàn)了部分緩解，但持續(xù)的康復訓練更顯著加速了大鼠的恢復速率，改善了大鼠的運動功能。

近年來，缺血區(qū)血管微循環(huán)再生對于神經(jīng)系統(tǒng)的改善作用正逐漸引起關注。陸方等[8]研究顯示針刺能夠促進腦缺后亞急性期側支循環(huán)微血管的再生，改善大鼠局灶性腦缺血區(qū)的血供。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)是目前發(fā)現(xiàn)可作用于血管內皮細胞的生長因子，是一種特異性的有絲分裂原，在血管生成過程中起重要調節(jié)作用，并發(fā)揮著營養(yǎng)神經(jīng)，刺激軸突生長，延長神經(jīng)元存活時間的作用。VEGF主要作用機制是與其受體結合，增加微血管通透性，提高微血管增殖和遷移水平，促進完全阻塞的血管中側支血管循環(huán)形成，改變內皮細胞基因表達，促進再生的毛細血管穿透組織內，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用[9]。生理狀態(tài)下VEGF及其受體表達較低，對血管的密度及整體的滲透功能僅起到一個基本的維持作用，誘導VEGF及其受體表達的主要因素為腦組織的缺血缺氧[10]。Falk等[11]研究顯示，外源性VEGF可促進腦組織中VEGF受體的表達增加，減少帕金森患者腦中運動神經(jīng)元的退化，發(fā)揮神經(jīng)性保護作用。此外，Chen等[12]研究表明，VEGF抑制劑PD173074能夠顯著逆轉運動訓練對腦缺血大鼠認知功能和運動功能的改善作用。與文獻中報道一致，本研究中，腦缺血再灌注介導的缺血缺氧誘導VEGF表達增加，而康復訓練對腦中VEGF表達也是正向調節(jié)。

與VEGF協(xié)同發(fā)揮作用的神經(jīng)生長因子(Nerve Growth Factor, NGF)是一類支持神經(jīng)元存活并延長其生物活性，促進神經(jīng)突觸生長的營養(yǎng)因子。生理狀態(tài)下，NGF是維持神經(jīng)生長的重要因子，病理狀態(tài)下，NGF是促進神經(jīng)元再生與神經(jīng)元修復必不可少的促進物質[13]。NGF本身具有促進神經(jīng)細胞存活及延長其生物活性，促進神經(jīng)突觸生長的生物效應。在缺血損傷時，NGF在缺血區(qū)表達會明顯增加，促進血管再生及炎癥的趨化作用，增強神經(jīng)元的修復功能，發(fā)揮神經(jīng)保護作用，甚至有學者認為NGF在誘導血管再生的作用比其神經(jīng)保護作用更顯著[14]。劉鵬等[15]研究腦缺血再灌注過程中，應用免疫組化檢測缺血區(qū)NGF表達，結果顯示缺血半暗影帶區(qū)NGF陽性細胞數(shù)顯著增加，證實NGF表達的上調由腦缺血誘導調控。而Chen等[16]在NGF對缺血性損傷的研究中也證實了NGF能上調VEGF表達，促進血管再生作用從而改善腦部血液微循環(huán)。本研究中腦缺血再灌注造成腦中缺血半影區(qū)NGF表達增加，而長期康復訓練則進一步升高腦卒中大鼠腦中NGF表達，且呈時間依賴性。

此外，CD34是一種高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要表達于骨髓中造血干細胞和血管內皮祖細胞表面，是血管新生標志性抗原。腦缺血后，體內內源性保護機制啟動，骨髓中CD34+內皮祖細胞快速轉運至外周血中，在趨化因子作用下聚集于損傷部位，參與新生血管的形成。Tsuji等[17]研究顯示，外源性臍血CD34+細胞靜脈注射可以減少新生小鼠腦卒中后組織缺血性腦損傷，增加神經(jīng)生長因子和血管內皮生長表達，減少梗死區(qū)域。因此，應用免疫組化對應腦缺血部位CD34+細胞染色能夠有效反應大鼠腦缺血后神經(jīng)血管新生的情況。本研究中，假手術組大鼠腦中基本不表達CD34+，而腦缺血有效激活了機體內神經(jīng)血管的修復再生功能，快速轉運CD34+內皮細胞至腦組織部位，促進血管微循環(huán)再生。

綜上所述，本研究從分子水平結合行為學測試探討了康復訓練對腦缺血再灌注大鼠認知功能改善的作用及可能的作用機制。證實了持續(xù)的康復訓練可以顯著改善腦缺血再灌注后運動功能障礙，其機制可能是通過增加VEGF與NGF表達，促進缺血區(qū)血管微循環(huán)的建立，改善腦缺血再灌注后大鼠運動功能障礙。