產(chǎn)黃青霉抗真菌幾丁質(zhì)酶的純化及特性分析

高兆建，丁飛鴻，陳 歡，耿云龍，趙宜峰

（1.徐州工程學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州 221018；2.長(zhǎng)江桂柳食品睢寧有限公司，江蘇 徐州 221000）

幾丁質(zhì)，又稱殼多糖，為N-乙酰葡糖胺通過(guò)β連接聚合而成的結(jié)構(gòu)多糖[1]，是真菌細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)部件，也參與組成昆蟲(chóng)的外骨骼、甲殼類動(dòng)物的外殼[2]。是世界上第二豐富的生物高分子，它與纖維素具有相似的特性[3-4]，由于其分解非常緩慢，所以容易大量堆積造成環(huán)境嚴(yán)重污染。

幾丁質(zhì)酶是一種具有降解幾丁質(zhì)能力的不同大小的蛋白質(zhì)，廣泛存在于真菌、節(jié)肢動(dòng)物、人類、植物等生物體內(nèi)[5-6]，也有從湖泊沉積物中分離得到[7]。因幾丁質(zhì)酶能將幾丁質(zhì)水解成N-乙酰葡糖胺[8]，其在幾丁質(zhì)廢物轉(zhuǎn)化為藥理活性產(chǎn)物方面有重要應(yīng)用[2]；另外幾丁質(zhì)酶生產(chǎn)甲殼素衍生物比用化學(xué)方法制備在環(huán)境保護(hù)方具有顯著優(yōu)勢(shì)；在利用幾丁質(zhì)降解微生物及其合成的幾丁質(zhì)酶對(duì)植物致病真菌的生物防治方面也越來(lái)越受到重視[9]；幾丁質(zhì)酶在人體炎癥與免疫調(diào)節(jié)中也有著重要作用，在人類病理學(xué)中擔(dān)任著新的角色[10-12]。

在自然界中，許多微生物都有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的能力。這些微生物分布廣泛，一些海灘、海水、鹽堿地、鹽場(chǎng)等都是幾丁質(zhì)酶產(chǎn)生菌生長(zhǎng)的理想場(chǎng)所，不同場(chǎng)所分離出的幾丁質(zhì)酶也通常帶有不同的生理生化特性，Beltagy等[13]從蘇伊士海灣分離得到的嗜鹽黃曲霉產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶，具有嗜熱的特性；Ray等[7]報(bào)道的從咸水湖泊沉積物中分離得到的幾丁質(zhì)酶RC1830，具有耐高溫、耐堿性金屬鹽的特征；而報(bào)道的耐冷假單胞菌幾丁質(zhì)酶則具有良好的低溫適應(yīng)性，在低溫下依舊有較高的酶活力[14]。Patidar等[15]從富含幾丁質(zhì)的蝦晾曬場(chǎng)土壤中分離到產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)黃青霉菌株，并對(duì)菌株發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化，但未見(jiàn)對(duì)其幾丁質(zhì)酶的進(jìn)一步深入研究。Orwa等[16]從肯尼亞馬加迪湖分離到產(chǎn)黃青霉，其發(fā)酵液對(duì)多種細(xì)菌和真菌有抑制作用，但還未對(duì)抑菌物質(zhì)分離鑒定。目前已有許多關(guān)于幾丁質(zhì)酶的菌種篩選、發(fā)酵生產(chǎn)、分離純化和特性的報(bào)道，但是這些報(bào)道僅限于較少的真菌種類，且這些酶通常在某一特性方面具有優(yōu)勢(shì)，在酶的大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用方面依然存在成本太高、穩(wěn)定性差、催化效率低、不能滿足特定需求等缺陷。因此，有必要圍繞酶的應(yīng)用進(jìn)一步持續(xù)開(kāi)發(fā)新型的具備更好特性的幾丁質(zhì)酶資源。

在幾丁質(zhì)酶應(yīng)用于食品保鮮防腐方面，研究報(bào)道有限，菌種資源更顯不足，加之現(xiàn)有幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)仍不能滿足食品行業(yè)應(yīng)用的需要[17]，也很少涉及其作為食品保鮮劑在食品領(lǐng)域的詳細(xì)研究[18]。本研究從產(chǎn)黃青霉Xch23發(fā)酵液中分離一種耐高溫的幾丁質(zhì)酶，與報(bào)道的產(chǎn)黃青霉幾丁質(zhì)酶相比，該幾丁質(zhì)酶可對(duì)多種真菌有顯著抑菌作用。本研究就幾丁質(zhì)酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)、抗菌特性方面進(jìn)行探究，以評(píng)價(jià)其在食品保鮮防腐中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)室前期從堆積貝殼垃圾處篩選到的1 株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)黃青霉（Penicillium chrysogenum）Xch23。

1.1.2 試劑

柱層析填充材料DEAE-Cellulose A52、Sephadex G-100 美國(guó)Pharmacia公司；幾丁質(zhì)、乙二醇幾丁質(zhì)、乙二醇?xì)ぞ厶?、?幾丁質(zhì)、β-幾丁質(zhì) 美國(guó)Sigma公司；標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子質(zhì)量Marker 生工生物工程（上海）股份有限公司；除另有規(guī)定外，其他化學(xué)品均屬分析級(jí)，從當(dāng)?shù)刭?gòu)買(mǎi)。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加(NH4)2SO41.0 g/L，KH2PO40.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，NH4NO30.5 g/L，CaCl20.01 g/L，pH 6.5（121 ℃、20 min高壓滅菌）。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：膠體幾丁質(zhì)5.0 g/L，酵母提取物4.0 g/L，蛋白胨2.0 g/L，(NH4)2SO42.0 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NH4NO31 g/L，CaCl20.015 g/L，F(xiàn)eSO40.1 g/L，pH 6.5（121 ℃、20 min高壓滅菌）。

1.2 儀器與設(shè)備

AKTA Explorer 100型蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；3K30型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Sigma公司；UV-2450紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；SW-CJ-ZFD型雙人單面超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Cascada LS型超純水系統(tǒng) 美國(guó)Pall公司。

1.3 方法

1.3.1 膠體幾丁質(zhì)的制備與幾丁質(zhì)酶發(fā)酵及活力測(cè)定

膠體幾丁質(zhì)的制備參照Homthong等[19]的方法并稍作修改。將100 g幾丁質(zhì)緩慢加入到1.75 L預(yù)冷的濃縮鹽酸中，在磁力攪拌器上輕輕攪拌3 h。再過(guò)濾至20 L預(yù)冷蒸餾水中并不斷攪拌，待其沉淀出稠密的白色沉淀，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，用冷水反復(fù)清洗沉淀直到pH值達(dá)到6.0，膠質(zhì)幾丁質(zhì)保存4 ℃冰箱備用。

將斜面保藏的產(chǎn)黃青霉Xch23菌株接種于PDA斜面，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d。加無(wú)菌水洗脫下孢子，按4%的量接種于種子培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)3～4 d。再以6%的量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)6 d，得到的發(fā)酵液過(guò)濾后濾液10 000 r/min離心15 min，收集上清液即幾丁質(zhì)酶（Chi-Pc76）粗酶液。

Chi-Pc76活力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[20]方法，并稍作修改。0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶溶液與0.5 mL 1 g/100 mL膠體幾丁質(zhì)（溶于pH 6.0、20 mmol/L磷酸緩沖溶液中）混合，于55 ℃、pH 6.0條件下緩緩振蕩孵育30 min后，向體系中加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸并在沸水中煮沸10 min，然后立即冷卻并于室溫條件下8 000 r/min離心10 min，540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。酶活力定義：每分鐘水解幾丁質(zhì)釋放1 μmol還原糖所需的酶蛋白量。

1.3.2 幾丁質(zhì)酶Chi-Pc76的分離純化

1.3.2.1 DEAE-Cellulose A52離子交換層析

對(duì)制備所得的Chi-Pc76粗酶液用85%的硫酸銨溶液沉淀蛋白，并靜置過(guò)夜。8 000 r/min離心15 min，棄去上清液，使用磷酸緩沖液（20 mmol/L、pH 6.5）溶解沉淀，并透析過(guò)夜。將經(jīng)上述步驟所得酶液上樣于已用磷酸緩沖溶液平衡過(guò)的DEAE-Cellulose A52（2.5 cm×40 cm），用含有0～1.0 mol/L NaCl的上述相同緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，流速為1 mL/min，每管收集3 mL，對(duì)每個(gè)收集峰測(cè)定酶活力。

1.3.2.2 Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析

合并離子交換層析有活性的收集管，經(jīng)過(guò)超濾濃縮后上樣于以20 mmol/L的磷酸緩沖液（pH 6.5）充分平衡過(guò)的層析柱（80 cm×1.5 cm），用20 mmol/L的磷酸緩沖液（pH 6.5）洗脫，流速為0.8 mL/min。收集各洗脫管，并測(cè)定酶活力。

1.3.2.3 Chi-Pc76分子質(zhì)量的測(cè)定

采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）進(jìn)行分子質(zhì)量測(cè)定。采用4%濃縮膠和12%分離膠。并用考馬斯亮藍(lán)R-250在電泳后染色觀察，根據(jù)Marker帶和純品條帶遷移率計(jì)算其分子質(zhì)量。

1.3.3 幾丁質(zhì)酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.3.3.1 溫度對(duì)Chi-Pc76活力的影響

最適溫度測(cè)定：在30～90 ℃范圍內(nèi)測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%，確定最適溫度。溫度穩(wěn)定性：將一定量的Chi-Pc76在30～90 ℃范圍下保溫1 h，快速冷卻至室溫。以未做處理的酶活力為100%，在55 ℃條件下測(cè)定殘余酶活力。

1.3.3.2 pH值對(duì)Chi-Pc76活力的影響

最適pH值測(cè)定：測(cè)定Chi-Pc76在55 ℃不同pH值緩沖液中活力，最高酶活力定義為100%，計(jì)算各pH值相對(duì)酶活力，確定最適反應(yīng)pH值。pH值穩(wěn)定性測(cè)定：將純化后的Chi-Pc76在4 ℃不同pH值孵育12 h，測(cè)定殘余酶活力，將未處理的酶液酶活力定義為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.3.3.3 金屬離子以及部分化學(xué)試劑對(duì)Chi-Pc76活力的影響

向反應(yīng)體系中分別加入不同的金屬離子和化學(xué)試劑，于30 ℃孵育1 h，再按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定酶活力，以不加任何以上金屬離子和化學(xué)試劑的酶液作對(duì)照，分析金屬離子和部分化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響。

1.3.3.4 Chi-Pc76的底物特異性及動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

分別以1 g/100 mL的膠體幾丁質(zhì)、乙二醇幾丁質(zhì)、乙二醇?xì)ぞ厶?、殼聚糖、?幾丁質(zhì)、β-幾丁質(zhì)、可溶性淀粉以及羧甲基纖維素作為反應(yīng)底物，55 ℃分別反應(yīng)30 min，測(cè)定Chi-Pc76活力。

以不同濃度的底物在pH 6.0、溫度55 ℃條件下測(cè)定Chi-Pc76活力，采用雙倒數(shù)作圖法計(jì)算該條件下酶的米氏常數(shù)Km值。底物質(zhì)量濃度依次為0.0、0.04、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.9、1 mg/mL，以質(zhì)量濃度的倒數(shù)1/S為橫坐標(biāo)，反應(yīng)速率的倒數(shù)1/V為縱坐標(biāo)，繪制Chi-Pc76動(dòng)力學(xué)曲線圖并計(jì)算Km。

1.3.3.5 Chi-Pc76對(duì)真菌抑制活性

采用瓊脂孔擴(kuò)散法檢測(cè)抑菌活性，具體參照Farag等[21]的方法，并稍作改進(jìn)。用黑曲霉、產(chǎn)黃青霉、尖孢鐮刀菌以及橘青霉孢子制成懸液，使用接種環(huán)沾取少量孢子懸液，并點(diǎn)接到各自培養(yǎng)平板中間，培養(yǎng)2 d后，在每個(gè)平板上分別用打孔器距離菌落約0.5 cm位置打孔。在平板的1號(hào)孔中加入100 μL Chi-Pc76酶液，在2號(hào)孔中加入100 μL無(wú)菌水，作為對(duì)照。將平板28 ℃培養(yǎng)3～5 d后，觀察真菌抑制情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 Chi-Pc76的分離純化

2.1.1 DEAE-Cellulose A52離子交換層析

粗酶液DEAE-Cellulose A52離子交換層析見(jiàn)圖1，在層析圖譜中出現(xiàn)了4 個(gè)較為明顯的蛋白峰，其中低鹽洗脫（0～0.5 mol/L NaCl）得到1 個(gè)峰，高鹽洗脫（0.5～1.0 mol/L NaCl）得到3 個(gè)峰。檢測(cè)P3峰有幾丁質(zhì)酶活力，說(shuō)明Chi-Pc76在pH 6.5緩沖液中帶有較多的負(fù)電荷，與離子交換劑結(jié)合較強(qiáng)，需要高濃度的NaCl才能將其洗脫下來(lái)。合并收集管，測(cè)定Chi-Pc76比活力為212.4 U/mg，純化倍數(shù)為6.21 倍，回收率為60.5%。

圖1 產(chǎn)黃青霉Xch23產(chǎn)Chi-Pc76 DEAE-Cellulose A52層析Fig.1 Chromatographic separation of Chi-Pc76 from P.chrysogenum Xch23 on DEAE-Cellulose A52

2.1.2 Sephadex G-100凝膠過(guò)濾層析

離子交換層析所得Chi-Pc76酶液Sephadex G-100進(jìn)一步純化，結(jié)果如圖2所示。出現(xiàn)5 個(gè)較為明顯的蛋白洗脫峰，其中P4蛋白峰檢測(cè)到幾丁質(zhì)酶活力。合并收集第28～34號(hào)管，冷凍干燥后備用?？梢钥闯瞿z過(guò)濾層析對(duì)Chi-Pc76純化倍數(shù)較高，體現(xiàn)出對(duì)該酶的高純化效率，適合于Chi-Pc76純化。表1總結(jié)了Chi-Pc76各步純化情況，經(jīng)過(guò)3 步純化后，最終酶活力為747.6 U，酶比活力584.8 U/mg，純化倍數(shù)17.1 倍，回收率21.6%。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶的分離純化，Karthik等[22]通過(guò)以二乙氨乙基-丙烯酸甲酯共聚物為介質(zhì)的離子交換層析和凝膠樹(shù)脂層析純化一種酸性幾丁質(zhì)酶，純化倍數(shù)為12.44，酶比活力為161.35 U/mg；Farag等[21]通過(guò)硫酸銨沉淀、凝膠過(guò)濾層析以及離子交換色譜對(duì)海洋土曲霉中的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行分離純化，回收率為12%；Lee等[23]用異丙醇沉淀法和正丁基瓊脂糖柱層析法從培養(yǎng)基中純化幾丁質(zhì)酶，回收率僅為8.8%。與報(bào)道相比，本研究的純化方法和使用的純化介質(zhì)效果更好，回收率和比活力都較高。

圖2 產(chǎn)黃青霉Xch23產(chǎn)Chi-Pc76 Sephadex G-100層析Fig.2 Chromatographic separation of Chi-Pc76 from P.chrysogenum Xch23 on Sephadex G-100

表1 產(chǎn)黃青霉Xch23 Chi-Pc76純化步驟Table 1Summary of purification steps of Chi-Pc76 from the fermentation broth of P.chrysogenum Xch23

2.1.3 Chi-Pc76分子質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果

如圖3所示，經(jīng)過(guò)系列純化后得到的樣品電泳顯示單一條帶，表明Chi-Pc76達(dá)到電泳純，計(jì)算得Chi-Pc76表觀分子質(zhì)量約為61 kDa，與Patil等[24]報(bào)道的赭綠青霉MTCC 517（64 kDa）、Farag等[21]報(bào)道的土曲霉（60 kDa）幾丁質(zhì)酶分子質(zhì)量類似。但比從嗜鹽黃曲霉（30 kDa）[13]、蠟樣芽孢桿菌IO8（30 kDa）[25]、地衣芽孢桿菌JS（22 kDa）[26]等微生物中分離的幾丁質(zhì)酶大；而低于Guo等[27]報(bào)道的Aeromonas schubertii幾丁質(zhì)酶（75 kDa）。不同來(lái)源的幾丁質(zhì)酶分子質(zhì)量差距較大，在細(xì)菌、酵母、植物、節(jié)肢動(dòng)物等中發(fā)現(xiàn)的幾丁質(zhì)酶的多數(shù)大小在20～90 kDa的范圍[28]。

圖3 純化后產(chǎn)黃青霉Xch23 Chi-Pc76 SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of purified Chi-Pc76 by SDS-PAGE

2.2 Chi-Pc76酶學(xué)性質(zhì)分析

2.2.1 溫度對(duì)Chi-Pc76活力的影響

如圖4A所示，在30～55 ℃范圍內(nèi)，酶活力隨溫度上升而增高，當(dāng)溫度為55 ℃時(shí)，具有最大活力，55 ℃以后酶活力逐漸降低。最適溫度與報(bào)道的從嗜鹽黃曲霉中分離得到的嗜熱幾丁質(zhì)酶[13]60 ℃較為接近，但顯著高于赭綠青霉（40 ℃）[24]、假單胞菌[29]（20 ℃）的幾丁質(zhì)酶最佳溫度。Chi-Pc76熱穩(wěn)定性較好（圖4B），65 ℃以前熱穩(wěn)定性曲線比較平緩，酶活力幾乎保持不變。在65～90 ℃，熱穩(wěn)定性和酶活力均下降，可能是由于高溫使酶變性失活導(dǎo)致。該酶的熱穩(wěn)定性同Liu Dong等[30]報(bào)道的蘇云金芽孢桿菌、Liang等[31]報(bào)道蠟樣芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶類似。

圖4 溫度對(duì)Chi-Pc76的作用Fig.4 Effect of temperature on the stability of Chi-Pc76

2.2.2 pH值對(duì)Chi-Pc76活力的影響

pH值能顯著影響酶反應(yīng)速率，其對(duì)Chi-Pc76活力的影響如圖5A所示。在pH 3～12時(shí)，酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的現(xiàn)象。當(dāng)pH值在3～6時(shí)，酶活力顯著上升，并在pH 6時(shí)達(dá)到最高，與源自玫瑰鏈霉菌[32]、芽孢桿菌[33]、黃單胞菌[34]的幾丁質(zhì)酶一致。

Chi-Pc76的穩(wěn)定性在pH 4～10內(nèi)良好，保留80%以上的酶活力（圖5B）。當(dāng)pH值大于10時(shí)，穩(wěn)定性隨著pH值的升高而有顯著降低。該酶穩(wěn)定性范圍與Nguyen等[35]報(bào)道的幾丁質(zhì)酶、Kopparapu等[36]報(bào)道的嗜熱擬青霉幾丁質(zhì)酶穩(wěn)定性范圍相似。

圖5 pH值對(duì)Chi-Pc76的作用Fig.5 Effect of pH on the stability of Chi-Pc76

2.2.3 金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)Chi-Pc76活力的影響

金屬離子能夠與酶形成絡(luò)合物，維持或破壞三維結(jié)構(gòu)和構(gòu)型，在生物催化中起重要作用[22]。不同濃度金屬離子對(duì)Chi-Pc76活力影響如表2所示。Ca2+、Ba2+、Mg2+、K+、Na+、Li+、Al3+均對(duì)酶起到激活作用；Mn2+、Co2+、Fe2+、Ag2+、Cu2+、Zn2+、Hg2+、Pb2+、Ag+對(duì)酶活力具有抑制作用。其中Ca2+的激活作用最強(qiáng)，使酶活力達(dá)到了156%左右。Ca2+對(duì)幾丁質(zhì)酶的激活作用許多文獻(xiàn)均有報(bào)道，其激活作用原因可能是該陽(yáng)離子在調(diào)節(jié)酶活力構(gòu)象中起重要作用，從而增加幾丁質(zhì)水解活性[2]。Hg2+、Pb2+和Ag+的抑制作用最強(qiáng)，完全抑制酶活力。Hg2+的強(qiáng)抑制作用因?yàn)樗c蛋白鏈半胱氨酸殘基中的—SH基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，破壞三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使蛋白質(zhì)失活所致[22]。這一結(jié)果與Ray等[7]報(bào)道的幾丁質(zhì)酶性質(zhì)以及從鏈霉菌中分離得到的幾丁質(zhì)酶的結(jié)果有相似之處[37-38]。真菌幾丁質(zhì)酶活力通常受Cu2+的抑制[36]在本實(shí)驗(yàn)中也得到驗(yàn)證?；瘜W(xué)試劑中，SDS、Tween 80、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、尿素未見(jiàn)對(duì)酶活力的顯著影響。二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、β-巰基乙醇、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）對(duì)酶活力有抑制作用。此類試劑對(duì)酶活力的影響是基于表面活性劑能破壞水介質(zhì)的表面張力，增加了底物與酶活力位點(diǎn)之間的接觸頻率，從而提高了酶的周轉(zhuǎn)率[39-40]。酶在1% Tween 80或Triton X-100以及濃度5 mmol/L的PMSF或尿素存在下較為穩(wěn)定，這可能是因?yàn)榘被岬慕M成和三維結(jié)構(gòu)支持了酶對(duì)疏水/非極性微環(huán)境的相對(duì)抗性[41]。此外由于PMSF未見(jiàn)對(duì)酶活力的抑制，而是有輕微的激活作用，因此在提取過(guò)程中還可以利用PMSF控制粗提物的絲氨酸蛋白酶活力，防止下游過(guò)程中蛋白質(zhì)的徹底降解[31]。在存在EDTA情況下，酶活力顯著降低，表明該酶可能為金屬酶，絲氨酸占據(jù)了酶的活性位點(diǎn)[42]。DTT和β-巰基乙醇均對(duì)該酶強(qiáng)抑制，表明其活性位點(diǎn)可能有巰基的存在[2]，二硫鍵的形成對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和蛋白質(zhì)功能的維持至關(guān)重要，因此當(dāng)巰基被破壞，酶蛋白的功能便會(huì)喪失。

表2 金屬離子及部分有機(jī)試劑對(duì)Chi-Pc76活力的影響Table 2 Effect of metal ions and some organic reagents on the activity of Chi-Pc76

2.2.4 底物特異性與Km值的測(cè)定結(jié)果

如表3所示，Chi-Pc76對(duì)膠體幾丁質(zhì)相對(duì)酶活力最高，接著是α-幾丁質(zhì)（65.87%）、乙二醇幾丁質(zhì)（55.23%）、β-幾丁質(zhì)（49.64%），對(duì)乙二醇?xì)ぞ厶呛蜌ぞ厶秋@示微量的活性，分別為9.14%和11.36%。對(duì)其他所測(cè)的底物可溶性淀粉、羧甲基纖維素?zé)o活性。整體看，Chi-Pc76對(duì)不同結(jié)構(gòu)形式的幾丁質(zhì)有高的水解活性。與其他報(bào)道的幾丁質(zhì)酶相比，Chi-Pc76顯示出相對(duì)嚴(yán)格的底物特異性，如Yahiaoui等[2]報(bào)道的Paenibacillus timonensis幾丁質(zhì)酶對(duì)膠體幾丁質(zhì)、乙二醇幾丁質(zhì)、乙二醇?xì)ぞ厶?、木聚糖和直鏈淀粉等底物具有高的水解活性?/p>

表3 幾丁質(zhì)酶Chi-Pc76對(duì)不同底物的底物特異性分析Table 3Substrate specificity of Chi-Pc76

根據(jù)雙倒數(shù)曲線計(jì)算可得Chi-Pc76以膠體幾丁質(zhì)為底物時(shí)Km為0.25 mg/mL，Vmax為20 μmol/（min·mg）。Km值為酶的特征常數(shù)，反映其與底物親和性，數(shù)值越大，則反映該酶與底物親和性較低，數(shù)值越小，則反映與底物親和性越高。Cheba等[43]從新型紅海芽孢桿菌中提取的幾丁質(zhì)酶Km為6.971 mg/mL，從青霉菌中分離純化的幾丁質(zhì)酶[24]Km為1.3 mg/mL，報(bào)道的堿性幾丁質(zhì)酶[44]Km為4.41 mg/mL，耐熱性幾丁質(zhì)酶[40]Km為5.6 mg/mL。與這些結(jié)果相比，本實(shí)驗(yàn)所研究的幾丁質(zhì)酶Km值更小，體現(xiàn)出對(duì)底物的更高親和性，適合于幾丁質(zhì)的酶解降解，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

2.2.5 Chi-Pc76對(duì)真菌抑制作用

通過(guò)測(cè)定Chi-Pc76的抗真菌活性，評(píng)價(jià)Chi-Pc76在食品防腐及生物防治方面的應(yīng)用價(jià)值。如圖6所示，Chi-Pc76對(duì)黑曲霉、黃曲霉、尖孢鐮刀菌以及橘青霉都產(chǎn)生了顯著抑制作用。在加入Chi-Pc76的孔1附近真菌生長(zhǎng)受到強(qiáng)烈抑制，而空白對(duì)照4 種真菌的菌絲生長(zhǎng)完全正常，說(shuō)明Chi-Pc76對(duì)供試菌株有抑菌作用。從抑菌強(qiáng)度看，對(duì)黃曲霉和黑曲霉抑菌效果強(qiáng)于尖孢鐮刀菌和橘青霉，這可能與不同真菌其細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)含量及結(jié)構(gòu)形式不同有關(guān)?？拐婢饔玫膸锥≠|(zhì)酶已從多種細(xì)菌和真菌中分離，比如灰黃曲霉[45]、耐冷假單胞菌[14]、海洋土霉菌[21]等菌株，但所產(chǎn)幾丁質(zhì)酶抑制真菌的范圍和抑制效果有顯著差異。盡管幾丁質(zhì)不是所有真菌細(xì)胞壁的主要成分，但大多數(shù)都在細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)[46]，故在真菌菌絲快速生長(zhǎng)延伸時(shí)幾丁質(zhì)酶通過(guò)降解其細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)達(dá)到抑制真菌的效果。Chi-Pc76對(duì)病源真菌及腐敗真菌顯示出較好的抗菌效果，這將有助于開(kāi)發(fā)食品防腐劑或生物農(nóng)藥控制病源真菌的生長(zhǎng)。

圖6 純化Chi-Pc76對(duì)真菌的抑制作用Fig.6 Antifungal activity of Chi-Pc76

3 結(jié) 論

本研究從產(chǎn)黃青霉Xch23發(fā)酵液中分離純化抗真菌特性的幾丁質(zhì)酶。通過(guò)兩步柱層析技術(shù)純化到單一組分的Chi-Pc76，其在較寬的pH值范圍（5.0～8.0）和溫度范圍（45～65 ℃）保持高的催化活性，在pH 4.0～10.0及70 ℃以下Chi-Pc76穩(wěn)定性好。不同金屬離子對(duì)Chi-Pc76有一定影響，Ca2+、Ba2+、K+、Na+對(duì)酶有顯著激活作用，Ca2+激活作用最強(qiáng)。Chi-Pc76對(duì)表面活性劑SDS、Tween 80和Triton X-100耐受性較好。Chi-Pc76有較廣的底物催化特性，對(duì)膠體幾丁質(zhì)催化活力最高。Chi-Pc76具有抗真菌活性，對(duì)黑曲霉、黃曲霉、尖孢鐮刀菌及橘青霉有明顯的抑制作用。綜合Chi-Pc76分子質(zhì)量、酶學(xué)特性及抗真菌性能同已報(bào)道的幾丁質(zhì)酶存在較多差異，推測(cè)Chi-Pc76可能是一種新型的幾丁質(zhì)酶，在食品防腐、生物技術(shù)、農(nóng)業(yè)生防及環(huán)境保護(hù)方面有開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。