4 株本土非釀酒酵母的發(fā)酵特性

劉沛通，許丹丹，許引虎，段長(zhǎng)青，燕國(guó)梁,

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄與葡萄酒研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.中糧營(yíng)養(yǎng)健康研究院有限公司，北京 102209；3.湖北省酵母功能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443003）

葡萄酒發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的生化反應(yīng)過(guò)程，涉及多種微生物的代謝反應(yīng)。近年來(lái)，非釀酒酵母（non-Saccharomyces）在葡萄酒釀造中的作用越來(lái)越受到重視[1]。非釀酒酵母是有別于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的一大類酵母，主要包括漢遜酵母（Hanseniaspora）、梅奇酵母（Metschnikowia）、畢赤酵母（Pichia）等，其比例和組成受葡萄品種、栽培方式、產(chǎn)區(qū)、氣候和年份等因素的影響[2]。研究表明，非釀酒酵母可以合成大量的酯類、醇類等揮發(fā)性物質(zhì)，部分非釀酒酵母可分泌果膠酶、葡萄糖苷酶等酶類，通過(guò)酶與葡萄汁的相互作用為葡萄酒貢獻(xiàn)不同的品種香和發(fā)酵香[3-4]，在塑造葡萄酒香氣特征、提高葡萄酒復(fù)雜性方面具有積極的作用[5]。例如Hanseniaspora（H.uvarum和H.vineae）具有高產(chǎn)乙酸和乙酸乙酯的特性，對(duì)某些葡萄酒的風(fēng)味特征有積極的影響。與單一接種S.cerevisiae相比，采用H.vineae與S.cerevisiae混合發(fā)酵的‘霞多麗’葡萄酒具有更突出的“白梅”、“梨”、“檸檬水果”和“蜂蜜”等感官特性，而“酵母味”則有所下降[6]。H.uvarum與S.cerevisiae進(jìn)行混合發(fā)酵時(shí)，其較高的乙酸和乙酸乙酯產(chǎn)量可以平衡葡萄酒中揮發(fā)成分和非揮發(fā)成分的含量[7]。美極梅奇酵母（M.pulcherrima）可以提升葡萄酒的香氣品質(zhì)。Benito等[8]采用M.pulcherrima與S.cerevisiae混合發(fā)酵的方式釀造‘雷司令’葡萄酒。與單一接種S.cerevisiae相比，經(jīng)混合發(fā)酵的葡萄酒“柑橘/葡萄果實(shí)”和“梨”的感官得分最高，顯著提高了葡萄酒的果香風(fēng)味。陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）的β-葡萄糖苷酶可以促進(jìn)白色麝香葡萄酒中萜類物質(zhì)及其衍生物的釋放，提高葡萄酒的香氣復(fù)雜性[9]。

一般情況下，非釀酒酵母難以單獨(dú)完成乙醇發(fā)酵，需要與S.cerevisiae進(jìn)行混合發(fā)酵（采取同時(shí)接種或延遲接種）。因此，目前的研究主要集中在非釀酒酵母與S.cerevisiae混合發(fā)酵工藝條件對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響[6,10-12]，但研究非釀酒酵母在純培養(yǎng)條件下的發(fā)酵和產(chǎn)香特點(diǎn)對(duì)于設(shè)計(jì)合理的混合發(fā)酵策略至關(guān)重要[13-14]。目前，國(guó)內(nèi)葡萄酒企業(yè)主要使用商業(yè)S.cerevisiae釀造葡萄酒，盡管使用S.cerevisiae純種發(fā)酵具有易于控制和發(fā)酵均勻的優(yōu)點(diǎn)，但會(huì)導(dǎo)致葡萄酒缺乏由本土酵母帶來(lái)的風(fēng)味、風(fēng)格的差異和年份變化的復(fù)雜性，使葡萄酒風(fēng)味特征出現(xiàn)同質(zhì)化現(xiàn)象[15]，選用適宜的非釀酒酵母與S.cerevisiae進(jìn)行混合發(fā)酵是解決該問(wèn)題的一個(gè)有效手段[11]。為此，我國(guó)學(xué)者對(duì)分離自不同產(chǎn)區(qū)的非釀酒酵母的釀造特性（發(fā)酵活力、產(chǎn)酶特點(diǎn)和耐受性）以及混合發(fā)酵對(duì)葡萄酒香氣品質(zhì)進(jìn)行了較為深入的研究[16-18]，但對(duì)于本土非釀酒酵母在純種發(fā)酵條件下的發(fā)酵性能，特別是產(chǎn)香性能還缺少系統(tǒng)研究[13]。

在前期研究中，從遼寧、新疆、湖南3 個(gè)產(chǎn)區(qū)中分離到若干非釀酒酵母，其中H.uvarumCVE-HU36、H.vineaeCVE-HV6、M.pulcherrimaCVE-MP20和I.terricolaCVE-IT8具有較好的耐低溫、耐高滲和SO2耐受性，且H2S產(chǎn)量低，具有工業(yè)化應(yīng)用的潛力。本研究以這4 株非釀酒酵母作為研究對(duì)象，分析其在純種發(fā)酵時(shí)的發(fā)酵性能和產(chǎn)香特性，從發(fā)酵和產(chǎn)香水平對(duì)這4 株非釀酒酵母進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，以期獲得具有優(yōu)良釀造學(xué)特性的非釀酒酵母，為提高本土葡萄酒香氣品質(zhì)和豐富度提供優(yōu)良的菌種資源及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘赤霞珠’葡萄汁（取自2017年河北承德‘赤霞珠’葡萄果實(shí)），還原糖264.32 g/L。

商業(yè)S.cerevisiaeBDX購(gòu)于法國(guó)Lallemand Inc公司，4 株非釀酒酵母篩選自3 個(gè)不同葡萄酒產(chǎn)區(qū)的自然發(fā)酵過(guò)程中，并通過(guò)26S rDNA（D1/D2）鑒定（同源性達(dá)99%），保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄與葡萄酒研究中心。菌種名稱及編號(hào)如表1所示。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，pH 6.0，115 ℃高壓滅菌20 min。

WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：胰蛋白胨5 g/L，酵母浸粉4 g/L，葡萄糖50 g/L，磷酸二氫鉀0.55 g/L，氯化鉀0.425 g/L，氯化鈣0.125 g/L，硫酸鎂0.125 g/L，硫酸錳0.002 5 g/L，三氯化鐵0.002 5 g/L，溴甲酚綠0.002 2 g/L，瓊脂20 g/L，pH 5.5，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀、6890氣相色譜-5975B質(zhì)譜聯(lián)用儀、G1362A示差折光檢測(cè)器、G1315D二極管陣列檢測(cè)器 美國(guó)Agilent公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)日本島津公司；離子交換色譜柱HPX-87H Aminexionexchange column（300 mm×7.8 mm） 美國(guó)Bio-Rad Laboratories公司；二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭 美國(guó)Supelco公司；PAL-SPME自動(dòng)進(jìn)樣器 瑞士CTC Analytics公司；HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國(guó)J &W Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

取保藏菌株在WL營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)獲得單菌落，將單菌落挑出，接種于含有5 mL YPD液體培養(yǎng)基的試管中進(jìn)行活化，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期。將酵母種子液以1%接種量接種于含有200 mL YPD液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期。

1.3.2 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

低溫（4 ℃）離心收集菌體，經(jīng)無(wú)菌水洗滌后接入經(jīng)巴氏滅菌的葡萄汁中。其中S.cerevisiae與非釀酒酵母接種量均為107CFU/mL。以S.cerevisiaeBDX作為對(duì)照，進(jìn)行純種發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵在250 mL錐形瓶中進(jìn)行，每瓶裝有200 mL葡萄汁，接種后用硅膠塞和發(fā)酵栓封住瓶口。25 ℃恒溫靜置發(fā)酵。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)平行。

在發(fā)酵過(guò)程中，通過(guò)測(cè)定菌體密度（OD600nm）監(jiān)測(cè)發(fā)酵進(jìn)程，直至發(fā)酵結(jié)束。本實(shí)驗(yàn)中S.cerevisiae于12 d發(fā)酵結(jié)束，非釀酒酵母于18 d發(fā)酵結(jié)束。乙醇發(fā)酵結(jié)束后將樣品低溫（4 ℃）離心后棄去菌體，留上清液放置－20 ℃凍藏，用于測(cè)定香氣化合物和其他代謝產(chǎn)物，計(jì)算不同酵母純種發(fā)酵時(shí)的細(xì)胞干質(zhì)量、乙醇產(chǎn)率，公式如下[19-21]：

1.3.3 葡萄酒理化指標(biāo)分析

發(fā)酵液經(jīng)0.22 μm濾膜（PES）過(guò)濾后，采用1200高效液相色譜進(jìn)行葡萄糖、果糖、甘油、乙醇及有機(jī)酸含量分析。檢測(cè)參考Verwaal等[22]的方法，離子交換色譜柱HPX-87H Aminexion-exchange column（300 mm×7.8 mm），流動(dòng)相為5 mmol/L的H2SO4溶液，等度洗脫，流速0.6 mL/min。

葡萄糖、果糖、乙醇和甘油的測(cè)定使用示差折光檢測(cè)器，進(jìn)樣量2 μL，柱溫45 ℃，分析時(shí)間30 min；有機(jī)酸（檸檬酸、乳酸、琥珀酸、蘋果酸和乙酸）的測(cè)定采用二極管陣列檢測(cè)器，進(jìn)樣量10 μL，柱溫60 ℃，分析時(shí)間30 min。每個(gè)樣品做2 個(gè)獨(dú)立重復(fù)。

1.3.4 葡萄酒揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)

利用本實(shí)驗(yàn)室已優(yōu)化的頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的方法測(cè)定[23]。在頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀上進(jìn)行，選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭萃取。萃取前，萃取頭270 ℃老化1 h。將5 mL待測(cè)樣品加入15 mL樣品瓶中，同時(shí)加入1 g氯化鈉、10 μL內(nèi)標(biāo)（4-甲基-2-戊醇）后迅速用帶有聚四氟乙烯隔墊的樣品瓶蓋擰緊密封，在40 ℃恒溫條件下，180 r/min平衡30 min，待瓶中的氣-液相香氣物質(zhì)達(dá)到平衡后，將已活化或熱解吸過(guò)的PDMS/CAR/DVB萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，在40 ℃恒溫下攪拌萃取30 min，使樣品瓶中的香氣物質(zhì)達(dá)到氣-固和氣-液平衡。然后將萃取頭插入氣相色譜-質(zhì)譜進(jìn)樣口，250 ℃熱解吸8 min，不分流進(jìn)樣。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：配置PAL-SPME自動(dòng)進(jìn)樣器。所用毛細(xì)管色譜柱為HP-INNOWAX（60 m×0.25 mm，0.25 μm）。載氣為高純氦氣（純度 99.999%），流速1 mL/min，自動(dòng)進(jìn)樣。柱溫箱升溫程序：50 ℃保持1 min，以3 ℃/min速率升溫至220 ℃，保持5 min，總運(yùn)行時(shí)間62.67 min。質(zhì)譜接口溫度280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電離方式為電子電離源，離子源能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z20～350。每個(gè)樣品做2 個(gè)獨(dú)立重復(fù)。

香氣物質(zhì)的定性和定量分析：利用質(zhì)譜全離子掃描圖譜，對(duì)于已有標(biāo)準(zhǔn)品的物質(zhì)，依據(jù)本實(shí)驗(yàn)已建立的相同色譜條件下該化合物的保留時(shí)間、保留指數(shù)和質(zhì)譜信息進(jìn)行定性分析，制作其在模擬酒溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

繪圖軟件使用Origin 9.0，使用SPSS19進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，顯著性方差分析使用單因素ANOVA，P＜0.05，差異顯著。使用SIMCA 14.1進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母的生長(zhǎng)及發(fā)酵特性

由酵母生長(zhǎng)曲線及糖消耗曲線（圖1）可知，S.cerevisiaeBDX于12 d結(jié)束發(fā)酵，4 株非釀酒酵母于18 d達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)（連續(xù)2 d糖消耗小于2 g/L）[24]。與非釀酒酵母相比，S.cerevisiae生長(zhǎng)能力較強(qiáng)，其最大生物量（干質(zhì)量，下同）可達(dá)到2.96 g/L，且最大生長(zhǎng)速率高于非釀酒酵母（表2）。4 株非釀酒酵母中，CVE-HV6的生長(zhǎng)能力最強(qiáng)，最大生物量與最大生長(zhǎng)速率均高于其他3 株非釀酒酵母。除CVE-HV6外的3 株非釀酒酵母在‘赤霞珠’葡萄汁發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)趨勢(shì)大致相似，不存在顯著差異。4 株非釀酒酵母的最大生長(zhǎng)速率依次為：CVEHV6＞CVE-HU36＞CVE-MP20＞CVE-IT8。

圖1 乙醇發(fā)酵中不同酵母菌株生長(zhǎng)趨勢(shì)（a）及糖消耗（b）曲線Fig.1 Growth (a) and sugar consumption curves (b) of different yeasts during alcoholic fermentation

表2 乙醇發(fā)酵中不同酵母菌株生長(zhǎng)及發(fā)酵動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 2 Growth and fermentation kinetic parameters of different yeasts during alcoholic fermentation

不同酵母菌株的糖消耗趨勢(shì)大致相同：發(fā)酵初期（前4 d）糖被大量消耗，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，糖消耗速率逐漸減慢。除S.cerevisiaeBDX外，非釀酒酵母均不能完全消耗掉葡萄汁中的還原糖（糖耗率為45.69%～79.61%）。這主要是因?yàn)殡S著發(fā)酵的進(jìn)行，葡萄汁中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏和乙醇的積累使非釀酒酵母的生長(zhǎng)和代謝受到抑制所致[25]。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，4 株非釀酒酵母的發(fā)酵液中所剩糖含量為CVE-IT8＞CVE-MP20＞CVE-HU36＞CVE-HV6（表3）。表明與其他菌株相比，CVE-HV6具有最高的發(fā)酵能力，其最大發(fā)酵速率與S.cerevisiae相當(dāng)（表2）。

表3 不同酵母菌株發(fā)酵后葡萄酒的理化指標(biāo)Table 3 Physicochemical parameters of wines fermented with different yeast strains

2.2 葡萄酒理化指標(biāo)

甘油是主要的次級(jí)代謝產(chǎn)物之一，它有助于增加葡萄酒的黏性和柔軟性，為葡萄酒帶來(lái)積極的影響[26]。甘油的感官閾值為5.2 g/L，最高可達(dá)25 g/L[2]。本實(shí)驗(yàn)中，5 株酵母所產(chǎn)甘油含量均在可接受范圍內(nèi)。S.cerevisiae的乙醇產(chǎn)率為0.43 g/g，接近理論乙醇產(chǎn)率0.51 g/g[27]。4 株非釀酒酵母產(chǎn)甘油、乙醇能力均低于S.cerevisiae，其中Hanseniaspora（CVE-HU36與CVE-HV6）的甘油和乙醇產(chǎn)率高于其他兩株非釀酒酵母（CVE-MP20與CVE-IT8）。Escribano等[28]研究表明，與其他非釀酒酵母相比，M.pulcherrima的糖醇轉(zhuǎn)化率最低，在糖分含量較高的葡萄汁混合發(fā)酵中可以降低乙醇含量（與S.cerevisiae單一接種相比）。Benito等[8]也證實(shí)了M.pulcherrima在混合發(fā)酵中具有降低乙醇含量的作用。與本實(shí)驗(yàn)CVE-MP20菌株低產(chǎn)乙醇的結(jié)果一致。

與BDX相比，在非釀酒酵母實(shí)驗(yàn)組中，蘋果酸、乳酸和琥珀酸含量較低。4 株非釀酒酵母實(shí)驗(yàn)組中檸檬酸和琥珀酸含量均無(wú)顯著差異，CVE-HU36、CVE-HV6和CVE-MP20實(shí)驗(yàn)組中蘋果酸含量低于CVE-IT8，CVEHV6和CVE-HU36實(shí)驗(yàn)組中乳酸含量較高。有研究發(fā)現(xiàn)，Hanseniaspora具有高產(chǎn)乳酸的能力[29]。乙酸質(zhì)量濃度在接近感覺(jué)閾值0.7～1.1 g/L時(shí)，會(huì)給葡萄酒帶來(lái)溶劑味和酸敗感等不良影響[30]，Hanseniaspora（CVE-HV6和CVEHU36）實(shí)驗(yàn)組中乙酸含量均高于其他2 株非釀酒酵母，這與前人研究結(jié)果一致[7]。

2.3 揮發(fā)性物質(zhì)含量

測(cè)定發(fā)酵結(jié)束時(shí)葡萄酒中的揮發(fā)性物質(zhì)，共檢測(cè)到香氣物質(zhì)46 種，包括C6醇4 種，高級(jí)醇9 種，乙酯9 種，乙酸酯4 種，酸類7 種，醛類4 種，降異戊二烯與萜烯類5 種及其他化合物4 種（表4）。

C6醇可為葡萄酒帶來(lái)生青味和青草味。本實(shí)驗(yàn)中共檢測(cè)到4 種C6醇（表4）。其中(Z)-2-己烯醇在非釀酒酵母實(shí)驗(yàn)組都存在，而在S.cerevisiae實(shí)驗(yàn)組未檢出。Hanseniaspora（CVE-HV6和CVE-HU36）實(shí)驗(yàn)組中均未檢測(cè)到(E)-2-己烯醇。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，CVE-MP20產(chǎn)C6醇含量最低，其余非釀酒酵母的C6醇產(chǎn)量與S.cerevisiae之間無(wú)顯著差異。

高級(jí)醇是葡萄酒中重要的香氣物質(zhì)，其質(zhì)量濃度低于300 mg/L時(shí)會(huì)增加葡萄酒的復(fù)雜性，超過(guò)400 mg/L會(huì)對(duì)葡萄酒香氣產(chǎn)生負(fù)面影響[27]。本實(shí)驗(yàn)所有實(shí)驗(yàn)組中高級(jí)醇質(zhì)量濃度均低于300 mg/L，其中異丁醇、異戊醇和苯乙醇的含量均高于閾值，對(duì)葡萄酒香氣有積極貢獻(xiàn)（表4）。4 株非釀酒酵母的高級(jí)醇總量均顯著低于S.cerevisiae，但CVE-MP20、CVE-HV6和CVE-HU36具有較好的產(chǎn)異丁醇和苯乙醇能力。其中CVE-MP20的異丁醇和苯乙醇產(chǎn)量與S.cerevisiae相比無(wú)顯著差異。前人研究發(fā)現(xiàn)，M.pulcherrima與S.cerevisiae混合發(fā)酵可促進(jìn)中鏈脂肪酸、苯乙醇和乙酸異戊酯等的生成[28,31-32]。Hanseniaspora（CVE-HV6和CVE-HU36）可高產(chǎn)苯乙醇，其中CVE-HU36組的苯乙醇質(zhì)量濃度是S.cerevisiae組的1.52 倍。苯乙醇是葡萄酒中重要的香氣物質(zhì)之一，能為葡萄酒貢獻(xiàn)豐富的玫瑰味和蜂蜜味[33]。

表4 不同酵母菌株發(fā)酵后葡萄酒中香氣物質(zhì)的含量Table 4 Concentrations of aroma compounds in wines fermented with different yeast strains

乙酸酯是由乙醇或高級(jí)醇與乙酰輔酶A在醇酰基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下形成[33]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯4 種乙酸酯，且含量均高于閾值。除CVE-IT8組外，其余非釀酒酵母的乙酸酯含量均顯著高于S.cerevisiae。在4 株非釀酒酵母中，CVEMP20產(chǎn)乙酸酯能力最強(qiáng)，CVE-IT8產(chǎn)乙酸酯能力最弱。Hanseniaspora的兩株酵母（CVE-HU36與CVE-HV6）均高產(chǎn)乙酸乙酯和乙酸異戊酯，與前人報(bào)道結(jié)果一致[34]。乙酸乙酯在低質(zhì)量濃度時(shí)能夠?yàn)槠咸丫曝暙I(xiàn)令人愉快的果香味，但在150～200 mg/L時(shí)會(huì)為葡萄酒風(fēng)味帶來(lái)指甲油味等消極影響，顯著降低葡萄酒香味[21,24]。本實(shí)驗(yàn)中雖然BDX、CVE-HV6與CVE-HU36實(shí)驗(yàn)組中乙酸乙酯質(zhì)量濃度都處于較高水平，但均未超過(guò)150 mg/L，對(duì)葡萄酒香氣有積極的貢獻(xiàn)。CVE-HV6產(chǎn)乙酸異戊酯和乙酸苯乙酯的能力均高于其他3 株非釀酒酵母，其中乙酸苯乙酯含量是S.cerevisiae組的3.04 倍。乙酸苯乙酯是一種重要的乙酸酯，能為葡萄酒貢獻(xiàn)豐富的花果香和蜜糖味。研究發(fā)現(xiàn)，S.cerevisiae在純種發(fā)酵時(shí)會(huì)比Hanseniaspora（H.vineae和H.uvarum）產(chǎn)更多的異丁醇、異戊醇和苯乙醇，而Hanseniaspora（H.vineae和H.uvarum）通常會(huì)比S.cerevisiae產(chǎn)更多的乙酸乙酯和乙酸苯乙酯[27,35]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

乙酯是葡萄酒中另一類重要的酯類化合物，在酵母發(fā)酵過(guò)程中由?；鵆oA和乙醇反應(yīng)生成。本實(shí)驗(yàn)中共檢測(cè)到9 種乙酯類物質(zhì)，其中丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量超過(guò)閾值。非釀酒酵母的乙酯總量均低于S.cerevisiae，表明在乙酯合成方面，S.cerevisiae的能力很強(qiáng)。與其他3 株非釀菌株相比，CVE-HV6產(chǎn)乙酯能力最強(qiáng)，其癸酸乙酯產(chǎn)量甚至高于S.cerevisiae，可提升葡萄酒的果香風(fēng)味[36]。

葡萄酒中通常表現(xiàn)出的奶酪味及脂肪味與葡萄酒中存在的脂肪酸密切相關(guān)[37]。本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出酸類物質(zhì)7 種，其中己酸和辛酸的含量超過(guò)閾值。5 株酵母酸類物質(zhì)產(chǎn)量由高到底分別為BDX＞CVE-HV6＞CVE-IT8＞CVE-HU36＞CVE-MP20。4 株非釀酒酵母中，CVEMP20具有最高含量的戊酸和苯甲酸；CVE-HV6產(chǎn)己酸、癸酸和十二烷酸能力最強(qiáng)；CVE-IT8實(shí)驗(yàn)組中辛酸含量最高。

本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)到4 種醛類物質(zhì)，其中苯乙醛含量超過(guò)閾值。非釀酒酵母產(chǎn)醛類物質(zhì)能力均低于BDX，除CVE-HV6產(chǎn)醛類物質(zhì)較高外，其余3 株非釀酒酵母在醛類物質(zhì)合成方面無(wú)顯著差異。需要指出的是，CVEMP20與CVE-IT8實(shí)驗(yàn)組具有較高含量的苯甲醛（杏仁味），CVE-HV6實(shí)驗(yàn)組苯乙醛含量最高，能夠?yàn)槠咸丫曝暙I(xiàn)豐富的花香和蜂蜜味。

構(gòu)成葡萄酒芳香物質(zhì)的萜類主要為單萜類，屬于重要的品種香氣物質(zhì)之一。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到4 種萜烯，其中L-4-萜品醇含量高于閾值。除S.cerevisiae外，Hanseniaspora合成萜烯類物質(zhì)的能力最高，主要貢獻(xiàn)源于L-4-萜品醇。β-香茅醇能夠?yàn)槠咸丫曝暙I(xiàn)濃郁的青檸檬香，除CVE-HV6外，其他非釀菌株（CVE-MP20、CVE-HU36和CVE-IT8）產(chǎn)β-香茅醇能力均高于BDX，分別為BDX的1.57、2.05 倍和1.83 倍。有研究證實(shí)，來(lái)源于I.terricola的β-葡萄糖苷酶能夠增加白色麝香葡萄酒中游離的單萜、降碳倍半萜及其衍生物的含量，在提高葡萄酒香氣復(fù)雜性方面具有很好的應(yīng)用潛能[9]。本實(shí)驗(yàn)中只檢測(cè)到一種C13-降異戊二烯物質(zhì)（β-大馬士酮），CVEHV6實(shí)驗(yàn)組中β-大馬士酮含量顯著高于其他3 株非釀酒酵母，能夠賦予葡萄酒濃郁的紫羅蘭花香和甜果香氣[33]。此外，CVE-IT8實(shí)驗(yàn)組具有最高的4-乙基愈創(chuàng)木酚含量，能夠?yàn)槠咸丫曝暙I(xiàn)濃郁的烤面包味[33]。

2.4 揮發(fā)性物質(zhì)PCA

OAV為酒中檢測(cè)到的每種揮發(fā)性香氣化合物含量與其閾值的比值，可以用來(lái)評(píng)價(jià)每種揮發(fā)性化合物對(duì)葡萄酒實(shí)際香氣的貢獻(xiàn)，從而得到一種復(fù)雜的香氣輪廓[42]。為了更好地分析不同酵母合成揮發(fā)性物質(zhì)的差異，選取樣品中OAV＞0.1的香氣物質(zhì)（共19 種）進(jìn)行PCA，結(jié)果如圖2所示。

圖2 發(fā)酵結(jié)束時(shí)不同酵母發(fā)酵酒樣中OAV＞0.1的香氣化合物PCA散點(diǎn)圖（a）和載荷圖（b）Fig.2 PCA scatter plot (a) and loading plot (b) of aroma compounds(OAV > 0.1) in wines after alcoholic fermentation

由圖2可知，兩個(gè)PC的總貢獻(xiàn)率為73.3%，其中PC1的貢獻(xiàn)率為56.8%，PC2的貢獻(xiàn)率為16.5%。由圖2a可以看出，非釀酒酵母與S.cerevisiae在發(fā)酵產(chǎn)香上存在差異。S.cerevisiae位于PC1的負(fù)方向上，特征香氣為乙酸異戊酯、異戊醇、辛酸乙酯、3-乙基苯酚等物質(zhì)。非釀酒酵母均位于PC1的正半軸，其中CVE-HV6位于PC2的負(fù)方向且遠(yuǎn)離其他3 株非釀酒酵母，其特征香氣主要是能夠增加葡萄酒花香和果香的乙酸苯乙酯、癸酸乙酯和己醇。CVE-MP20位于PC2的正半軸，其特征香氣物質(zhì)主要為乙酸乙酯和苯乙醇。

2.5 4 株非釀酒酵母的發(fā)酵與產(chǎn)香特性綜合比較

根據(jù)化合物的類型，將OAV＞0.1的關(guān)鍵香氣化合物香氣值進(jìn)行累加。綜合4 株非釀酒酵母的生長(zhǎng)及發(fā)酵能力，均一化數(shù)值后得到酵母釀造特性雷達(dá)圖（圖3）。

由圖3可知，在4 株非釀酒酵母中，CVE-HV6的最大生長(zhǎng)速率和最大發(fā)酵速率最高，且具有最高的乙醇產(chǎn)率和甘油合成能力。該酵母的香氣表現(xiàn)也比較突出，其中高級(jí)醇、酯類、醛類和萜烯類物質(zhì)的含量顯著高于其他3 株非釀酒酵母。CVE-IT8酵母合成脂肪酸類物質(zhì)的能力最強(qiáng)。CVE-HU36產(chǎn)生乙酸含量最高，其甘油和乙醇生產(chǎn)能力僅次于CVE-HV6，同時(shí)可以合成較高含量的萜烯類物質(zhì)。CVE-MP20各方面表現(xiàn)較為協(xié)調(diào)，其最大發(fā)酵速率僅低于CVE-HV6，具有最低的乙醇產(chǎn)率。

圖3 4 株非釀酒酵母的發(fā)酵與產(chǎn)香特性對(duì)比Fig.3 Comparison of fermentation and aroma production characteristics of four non-Saccharomyces strains

3 結(jié) 論

目前，國(guó)內(nèi)葡萄酒企業(yè)大多采用接種商業(yè)活性干酵母的方式進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵生產(chǎn)，加劇了葡萄酒風(fēng)格單一化、同質(zhì)化的現(xiàn)象[15]。因此，篩選具有優(yōu)良特性的本土非釀酒酵母具有非常重要的實(shí)際意義。本研究以S.cerevisiaeBDX為對(duì)照，研究了4 株本土非釀酒酵母菌株的發(fā)酵性能與產(chǎn)香特性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4 株非釀酒酵母中，CVE-HV6生長(zhǎng)能力最強(qiáng)、具有最大的發(fā)酵速率，高產(chǎn)甘油、乙醇；CVE-HU36高產(chǎn)乙酸；CVE-MP20生長(zhǎng)和發(fā)酵能力處于中等水平，產(chǎn)甘油、乙醇能力最低，具有最低的乙醇產(chǎn)率；CVE-IT8生長(zhǎng)和發(fā)酵能力最弱。不同的非釀酒酵母具有不同的產(chǎn)香特性，CVE-HV6產(chǎn)乙酸苯乙酯、苯乙醇和癸酸能力高于S.cerevisiae和其他3 株非釀酒酵母，其中乙酸苯乙酯含量為S.cerevisiae的3.04 倍。CVE-HU36產(chǎn)苯乙醇能力與CVE-HV6相當(dāng)且高于S.cerevisiae和其他2 株非釀酒酵母，β-香茅醇含量高于S.cerevisiae（2.05 倍）和其他3 株非釀酒酵母；CVEMP20在5 株酵母中產(chǎn)乙酸乙酯和α-萜品醇能力最強(qiáng)，產(chǎn)異丁醇能力與S.cerevisiae相同且在非釀酒酵母中最高；CVE-IT8產(chǎn)辛酸能力與S.cerevisiae相同，產(chǎn)4-乙基愈創(chuàng)木酚能力低于S.cerevisiae，這兩種物質(zhì)的產(chǎn)量均高于其他3 株非釀酒酵母。

本研究中，4 株非釀酒酵母具有不同的釀造特性，與S.cerevisiae進(jìn)行混合發(fā)酵有望進(jìn)一步改善葡萄酒的品質(zhì)，如低產(chǎn)乙醇的CVE-MP20在降醇發(fā)酵方面具有一定潛力，高產(chǎn)乙酸的CVE-HU36可以在混合發(fā)酵中平衡揮發(fā)成分和非揮發(fā)成分的比例，CVE-IT8可為葡萄酒增加香氣的復(fù)雜度。綜合考慮生長(zhǎng)、發(fā)酵和產(chǎn)香能力，認(rèn)為CVE-HV6具有良好的應(yīng)用潛力（較高的生長(zhǎng)速度、發(fā)酵效率以及高產(chǎn)乙酸苯乙酯、苯乙醇和癸酸等），特別是在提升葡萄酒香氣品質(zhì)和豐富度方面，該菌株與S.cerevisiae混合發(fā)酵的研究目前正在進(jìn)行中。