• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法優(yōu)化保護(hù)劑提高羅伊氏乳桿菌抗凍性能

    2021-07-28 08:34:24潘海博覃璐琪黃燕婷梁曉琳黃國(guó)宏聶夢(mèng)琳饒川艷梅麗華李全陽(yáng)
    食品科學(xué) 2021年14期
    關(guān)鍵詞:保護(hù)劑人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)凍干

    潘海博,覃璐琪,黃燕婷,梁曉琳,黃國(guó)宏,聶夢(mèng)琳,饒川艷,梅麗華,李全陽(yáng),

    (1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院,廣西 南寧 530004;2.廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物技術(shù)學(xué)院,廣西 南寧 530226)

    羅伊氏乳桿菌是脊椎動(dòng)物腸道的天然共生菌[1],可分泌非蛋白的羅伊氏素[2]、B族維生素[3]和抗炎性組胺[4]等多種物質(zhì),通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制病原體,增強(qiáng)與腸上皮細(xì)胞的黏附調(diào)節(jié)宿主免疫能力[5-7],已成為全世界消費(fèi)較高的膳食補(bǔ)充劑菌種之一[8]。目前國(guó)內(nèi)外益生菌的主要載體有發(fā)酵乳、活性乳飲料和凍干粉[9-10]。前兩者由于其豐富的營(yíng)養(yǎng)和獨(dú)特的口感受到眾多消費(fèi)者的青睞,但保質(zhì)期短且受冷藏儲(chǔ)運(yùn)的限制。真空冷凍干燥技術(shù)基于微生物的生長(zhǎng)代謝特點(diǎn),通過(guò)提高真空度使處于冰晶狀態(tài)的菌體在低溫條件下升華成干粉狀態(tài),抑制代謝活性的同時(shí)維持了菌株原有特性[11],制品不僅體積小、質(zhì)量輕,而且可以在常溫下較長(zhǎng)時(shí)間保持菌體的益生活性。物流和倉(cāng)儲(chǔ)價(jià)格低廉、菌株活力保持較好的特性,使其在工業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[12]。而凍干的瞬時(shí)低溫和高真空度的失水環(huán)境會(huì)使菌體活性呈現(xiàn)數(shù)量級(jí)下降甚至死亡[13],經(jīng)濟(jì)損失和資源浪費(fèi)程度高。如何降低菌體在真空冷凍干燥過(guò)程中的損傷程度已成為目前亟待解決的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。

    相關(guān)研究表明,導(dǎo)致乳酸菌凍干后失活死亡的主要原因有胞內(nèi)酶及相關(guān)蛋白質(zhì)變性、細(xì)胞膜通透性增加、膜流動(dòng)性降低和核糖核酸結(jié)構(gòu)變化等[14]。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)乳酸菌真空冷凍干燥過(guò)程的優(yōu)化主要集中在菌體的凍干存活率[15-17],而提高抗凍性能的報(bào)道較少。Shekh等[18]發(fā)現(xiàn),由菊粉、低聚果糖、乳果糖和脫脂乳組成的保護(hù)劑,對(duì)植物乳桿菌GP的保護(hù)效果最好,凍干存活率達(dá)(98±2.8)%。蔣文鑫等[19]發(fā)現(xiàn),山梨糖醇、棉子糖與膠原蛋白以質(zhì)量比3∶3∶2組成,菌泥與保護(hù)劑質(zhì)量比為1∶1.2時(shí),短雙歧桿菌的凍干存活率接近80%。譚莎莎等[20]發(fā)現(xiàn),低聚糖較單糖、二糖、多糖、蛋白質(zhì)和聚合物而言,對(duì)羅伊氏乳桿菌的保護(hù)效果最為顯著,但不同低聚糖間差異不顯著。當(dāng)菌泥與保護(hù)劑干物質(zhì)的最優(yōu)質(zhì)量比為1∶1.2時(shí),凍干存活率可達(dá)93.02%。何宗柏等[21]發(fā)現(xiàn),在MRS培養(yǎng)基中添加0.1 g/L的油酸可維持細(xì)胞膜的完整性,降低β-半乳糖苷酶泄漏量和促進(jìn)脂肪酸合成,提高植物乳桿菌LIP-1的凍干存活率。通過(guò)添加不同類型的保護(hù)劑可有效改善菌體凍干微環(huán)境,緩解菌株凍干損傷,提高抗凍性能。研究表明,提高乳酸菌凍干抗逆性的保護(hù)劑類型有糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸和醇類等,將上述類型的保護(hù)劑進(jìn)行合理復(fù)配可使保護(hù)效率顯著提升。但保護(hù)劑成分復(fù)雜且與菌株存活率之間存在非線性關(guān)系,再加不同菌株對(duì)凍干的反應(yīng)特性不盡相同,所以常規(guī)回歸模型[22]篩選效果難盡人意。人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)通過(guò)先自主學(xué)習(xí)試驗(yàn)結(jié)果、再進(jìn)行預(yù)測(cè)的方式為解決非線性函數(shù)關(guān)系的問(wèn)題提供了更好的選擇。而人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)缺少具體數(shù)學(xué)模型,多與模擬“自然選擇”壓力的遺傳算法結(jié)合求解最優(yōu)值[23-26]。

    為此,本研究以提高羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)LTR1318在冷應(yīng)激下的抗凍性能為指標(biāo),擬通過(guò)單因素試驗(yàn)對(duì)保護(hù)劑的類型和添加量進(jìn)行優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上,采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法擬合出羅伊氏乳桿菌LTR1318的最佳凍干保護(hù)劑配方,并對(duì)使用該配方凍干后的菌體關(guān)鍵代謝酶活力和抗凍基因的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定,以評(píng)價(jià)上述策略制備的保護(hù)劑對(duì)菌體抗凍性能的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    羅伊氏乳桿菌LTR1318分離自廣西巴馬健康百歲老人糞便,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號(hào):CCTCC M 2019017)。

    TPY培養(yǎng)基(水解酪蛋白10.0 g/L,大豆蛋白胨5.0 g/L,酵母粉2.0 g/L,葡萄糖5.0 g/L,L-半胱氨酸0.5 g/L,K2HPO42.0 g/L,MgCl20.5 g/L,ZnSO40.25 g/L,CaCl20.15 g/L,F(xiàn)eCl30.000 001 g/L,瓊脂15.0 g/L,吐溫80 1.0 g/L) 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;蔗糖、海藻糖、低聚果糖、谷氨酸、天冬氨酸、抗壞血酸、大豆蛋白、谷胱甘肽、山梨糖醇 廣東康達(dá)生物科技有限公司;脫脂乳 內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司;細(xì)菌總RNA提取試劑盒、SYBR qPCR Master Mix 南京諾唯贊生物科技有限公司;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    真空冷凍干燥機(jī) 上海優(yōu)普實(shí)業(yè)有限公司;LightCycler?96實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)儀 上海羅氏制藥有限公司;Infinite MP200連續(xù)波長(zhǎng)多功能微孔檢測(cè)器瑞士Tecan公司。

    1.3 方法

    1.3.1 菌株的真空冷凍干燥及活菌數(shù)的測(cè)定

    羅伊氏乳桿菌LTR1318經(jīng)TPY固體培養(yǎng)基活化后接種于TPY液態(tài)培養(yǎng)基中,接種量為2%。37 ℃恒溫培養(yǎng)14 h后,4 000 r/min、4 ℃離心15 min獲得濕菌泥并稱質(zhì)量。保護(hù)劑與菌泥按10∶1混合均勻后立即用自封帶封裝并于-80 ℃預(yù)凍4 h。預(yù)凍結(jié)束后立即放入真空冷凍干燥機(jī)凍干24 h,凍干條件為溫度-50 ℃,真空度<15 Pa。將凍干粉復(fù)水于生理鹽水并進(jìn)行10 倍梯度稀釋,取100 μL由高到低3 個(gè)梯度下的稀釋液分別涂布于TPY瓊脂培養(yǎng)基后計(jì)數(shù)。凍干存活率計(jì)算如下式所示:

    式中:A1為冷凍干燥前的活菌數(shù);A2為樣品冷凍干燥后的活菌數(shù)。

    1.3.2 保護(hù)劑的單因素篩選

    保護(hù)劑可按照類型分為糖類、氨基酸類、蛋白質(zhì)類和醇類。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)初步得到的結(jié)果,選取每個(gè)大類中凍干存活率最高的3 種保護(hù)劑為單因素篩選的因素。確定糖類為蔗糖2.0%、海藻糖2.0%和低聚果糖1.75%,氨基酸類為谷氨酸0.8%、天冬氨酸1.0%和抗壞血酸1.5%,蛋白質(zhì)為脫脂乳12%、大豆蛋白12%和谷胱甘肽4%,醇類為山梨糖醇1.0%、甘油1.0%和甘露醇1.25%。

    1.3.3 徑向基函數(shù)(radial basis function,RBF)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的建立

    采用MATLAB R2019a中Neural Network Tool構(gòu)建RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型。模型由一個(gè)輸入層、單隱含層和一個(gè)輸出層構(gòu)成。通過(guò)單因素試驗(yàn)確定Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的4 個(gè)因素低聚果糖、谷氨酸、脫脂乳和山梨糖醇添加量作為模型的輸入層,凍干結(jié)束后的菌株存活率為輸出層。隨即選取Box-Behnken試驗(yàn)組合中的23 個(gè)試驗(yàn)結(jié)果構(gòu)成模型的訓(xùn)練集,剩余6 個(gè)作為測(cè)試集樣本,以完成人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的自我學(xué)習(xí)訓(xùn)練和預(yù)測(cè)。本研究對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)的29 個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行隨機(jī)劃分,數(shù)據(jù)集中的80%為訓(xùn)練集,20%為測(cè)試集。最大訓(xùn)練次數(shù)為100 次,學(xué)習(xí)步長(zhǎng)為0.05,學(xué)習(xí)目標(biāo)精度為10-5。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平見(jiàn)表1。

    表1 Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

    1.3.4 遺傳算法尋優(yōu)設(shè)計(jì)

    通過(guò)MATLAB的遺傳算法工具箱模擬物種的繁殖、雜交、變異、競(jìng)爭(zhēng)和選擇等自然現(xiàn)象以進(jìn)行遺傳算法尋優(yōu)。對(duì)凍干過(guò)程中的低聚果糖、谷氨酸、脫脂乳和山梨糖醇4 個(gè)因素在各自添加量范圍內(nèi)進(jìn)行人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬運(yùn)算,以模型擬合值建立個(gè)體適應(yīng)度函數(shù)進(jìn)行全局尋優(yōu)。菌株存活率越高,個(gè)體適應(yīng)度值越大。初始種群數(shù)、交叉概率、變異概率和進(jìn)化代數(shù)的取值根據(jù)實(shí)際進(jìn)行選取,其他參數(shù)選擇默認(rèn)值。

    1.3.5 關(guān)鍵酶活力的測(cè)定

    乳酸脫氫酶活力的測(cè)定參照李寶坤[27]的方法。具體如下:反應(yīng)體系3 mL,含有0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.3)、30 mmol/L丙酮酸鈉及6.6 mmol/L NADH,加入0.1 mL無(wú)細(xì)胞提取液進(jìn)行催化反應(yīng),每0.5 min讀取一次,連續(xù)5 min,以吸光度對(duì)時(shí)間作圖,取初始的線性范圍,計(jì)算每分鐘降低的吸光度。以每分鐘降低1 個(gè)吸光度為1 個(gè)酶活力單位,以U表示。

    β-半乳糖苷酶的測(cè)定采用崔樹(shù)茂[28]的方法并改進(jìn)。具體操作如下:取0.25 mL粗酶液,添加1.75 mL 0.05 mol/L鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenylβ-D-galactopyranoside,ONPG)溶液,混勻后在37 ℃條件下孵育5 min,添加1 mL Na2CO3溶液(濃度0.5 mol/L)終止反應(yīng)。然后測(cè)定420 nm波長(zhǎng)吸光度,反應(yīng)生成的鄰硝基酚(o-nitrodiphenol,ONP)通過(guò)ONP濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到。每分鐘每克蛋白質(zhì)分解ONPG生成1 μmol ONP的量為1 個(gè)β-半乳糖苷酶活力單位。

    1.3.6 冷脅迫應(yīng)激相關(guān)功能基因的挖掘

    課題組前期已完成了羅伊氏乳桿菌LTR1318的全基因組測(cè)序,基因組序列已上傳美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI),登錄號(hào)為CP045049。根據(jù)文獻(xiàn)[29]的報(bào)道尋找與冷脅迫應(yīng)激壓力相關(guān)的編碼基因并注釋。

    1.3.7 冷休克蛋白基因表達(dá)量的測(cè)定

    使用細(xì)菌總RNA提取試劑盒提取總RNA,具體操作按說(shuō)明書(shū)。根據(jù)基因組比對(duì)結(jié)果,利用Primer Premier 5引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)real-time PCR的特異性引物(F:5’-G TGTAGCGGTGGAATGCGTAGA AGGCACTGAAGGG CGGAAAC-3’),real-time PCR引物和16S rRNA內(nèi)參基因引物(R:5’-GTGAAAGTGGCGATGATGACGACAT TTGCTGCTTGA-3’)均由北京擎科生物有限公司合成。采用SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)試劑盒real-time PCR。反應(yīng)體系為20 μL,其中SYBR qPCR Master Mix10 μL,10 μmol/L上下游引物各0.4 μL,cDNA模板2 μL,去離子水補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,40 個(gè)循環(huán)。real-time PCR在StepOneTMreal-time PCR儀上進(jìn)行。以室溫下的表達(dá)量為空白對(duì)照,根據(jù)2-ΔΔCt法[30]測(cè)定冷脅迫下該基因的相對(duì)表達(dá)量。

    1.4 數(shù)據(jù)與圖像處理

    Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)軟件用于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練和測(cè)試數(shù)據(jù)集的建立;OriginPro 2020和Graphpad Prism 7.0用于顯著性分析和作圖;MATLAB 2019a數(shù)學(xué)軟件進(jìn)行人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法尋優(yōu)代碼的實(shí)現(xiàn)。所有實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次重復(fù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同保護(hù)劑對(duì)羅伊氏乳桿菌的保護(hù)效果

    不同類型保護(hù)劑的復(fù)配可大幅度提高保護(hù)劑對(duì)菌株的保護(hù)作用。由圖1可知,低聚果糖1.75%、谷氨酸0.8%、脫脂乳12%和山梨糖醇1.0%對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318的凍干保護(hù)效果最好。菌株存活率較未添加保護(hù)劑顯著提高,存活率分別達(dá)到(38.47±3.63)%、(35.66±2.66)%、(44.68±4.35)%和(39.89±4.55)%。據(jù)此選擇低聚果糖、谷氨酸、脫脂乳和山梨糖醇作為進(jìn)一步優(yōu)化的試驗(yàn)因素。

    圖1 不同保護(hù)劑對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318的凍干保護(hù)效果Fig.1 Effect of different protectants on the freeze-drying survival rate of L.reuteri LTR1318

    2.2 RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

    RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)具有最佳逼近和全局最優(yōu)的性能,可將在低維空間內(nèi)的線性不可分問(wèn)題在高維空間內(nèi)線性可分[31]。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練和測(cè)試數(shù)據(jù)集見(jiàn)表2,模型的訓(xùn)練和預(yù)測(cè)效果見(jiàn)圖2。

    表2 RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型訓(xùn)練和測(cè)試樣本數(shù)據(jù)集Table 2 Training and test set data of RBF artificial neural network

    圖2A反映對(duì)訓(xùn)練樣本的訓(xùn)練情況,實(shí)際值和預(yù)測(cè)值重合度越高說(shuō)明訓(xùn)練效果越好。本研究訓(xùn)練集經(jīng)過(guò)50 次的學(xué)習(xí)訓(xùn)練后,R2達(dá)到0.984 4,說(shuō)明該神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的擬合度較高,可以用于后續(xù)的測(cè)試;圖2B反映測(cè)試結(jié)束后程序自動(dòng)將剩余的測(cè)試集帶入模型進(jìn)行測(cè)試的結(jié)果,除第5個(gè)樣本出現(xiàn)較大偏離外,整體預(yù)測(cè)趨勢(shì)良好,可以用來(lái)進(jìn)行菌株凍干存活率的后續(xù)模擬。

    圖2 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的訓(xùn)練樣本(A)與測(cè)試樣本(B)中的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值對(duì)比結(jié)果Fig.2 Comparison of actual (A) and predicted (B) values for training and test sets of artificial neural network

    2.3 遺傳算法尋優(yōu)

    遺傳算法通過(guò)計(jì)算機(jī)程序模擬優(yōu)勝劣汰的自然法則,對(duì)目的函數(shù)進(jìn)行計(jì)算。本研究設(shè)定的最大遺傳代數(shù)50,變量的二進(jìn)制位數(shù)為8。遺傳算法對(duì)RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行全局尋優(yōu)的過(guò)程見(jiàn)圖3,模型預(yù)測(cè)最優(yōu)條件下的結(jié)果驗(yàn)證見(jiàn)表3。

    圖3 遺傳算法50 次迭代尋優(yōu)結(jié)果Fig.3 Results of optimization with 50 iterations of genetic algorithm

    表3 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法與響應(yīng)面優(yōu)化模型下的預(yù)測(cè)值和實(shí)際值比較Table 3Comparison of optimization results of ANN-GA and RSM for protectants

    圖3縱坐標(biāo)為每代變異存活率最優(yōu)值。適應(yīng)度曲線經(jīng)歷了向下數(shù)次的迭代尋優(yōu),個(gè)體適應(yīng)度所處平臺(tái)時(shí)間逐步延長(zhǎng)。這表明個(gè)體的適應(yīng)能力隨著適應(yīng)度函數(shù)的減小而增強(qiáng)。通過(guò)運(yùn)行遺傳算法程序,模擬生物進(jìn)化過(guò)程中的選擇、交叉、變異等自然選擇壓力,在經(jīng)過(guò)近40 代的遺傳模擬后,適應(yīng)度曲線最終趨于平穩(wěn),尋得最優(yōu)值,最終得到模型擬合預(yù)測(cè)的最大存活率為100.78%,此存活率下的保護(hù)劑組成為:脫脂乳10.93%,谷氨酸1.20%,低聚果糖1.29%和山梨糖醇0.80%。實(shí)際驗(yàn)證選擇保護(hù)劑的添加量分別為10.90%、1.20%、1.30%和0.80%,測(cè)得凍干存活率為(95.74±5.07)%。響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的最大預(yù)測(cè)凍干存活率為96.64%,最優(yōu)條件下的實(shí)測(cè)凍干存活率為(86.87±5.06)%。就最大值預(yù)測(cè)和實(shí)際值而言,人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法優(yōu)化的凍干存活率較響應(yīng)面模型分別提高了4.14%和8.87%。

    2.4 保護(hù)劑對(duì)低溫脅迫下關(guān)鍵酶活力的影響

    乳酸脫氫酶是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶,該酶活力大小直接影響菌株的產(chǎn)酸能力和代謝能力,該酶的失活是凍干過(guò)程菌株存活率降低的主要原因。β-半乳糖苷酶作為乳酸菌分解乳糖的重要酶,其活力可以直接反映乳酸細(xì)胞膜的通透性的變化情況。如圖4所示,乳酸脫氫酶和β-半乳糖苷酶在無(wú)保護(hù)劑下活力分別為(11.58±1.65)U和(2.67±0.56)U,加入保護(hù)劑的酶活力分別達(dá)到(17.74±2.85)U和(12.10±2.19)U。無(wú)保護(hù)劑的菌株在凍干后,乳酸脫氫酶和β-半乳糖苷的酶活力分別只有常溫下的51.08%和19.07%。與未添加保護(hù)劑相比,保護(hù)劑的加入使得菌體的乳酸脫氫酶和β-半乳糖苷酶活力顯著增加,分別提升53.19%和3.53 倍。加入保護(hù)劑凍干后,與常溫下酶活力相比,菌體的酶活力分別是原來(lái)的78.25%和86.43%。蔣艾廷等[32]也通過(guò)優(yōu)化噴霧干燥過(guò)程中的德氏乳桿菌保護(hù)劑,提高了ATP酶、己糖激酶與乳酸脫氫酶的活力,降低了噴霧干燥對(duì)德氏乳桿菌的損傷作用。結(jié)果表明,本研究復(fù)配的保護(hù)劑有效降低了冷應(yīng)激對(duì)菌體關(guān)鍵代謝酶活力的影響。

    圖4 保護(hù)劑對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318關(guān)鍵酶活力的影響Fig.4 Effects of protectants on key enzyme activities of L.reuteri LTR1318

    2.5 冷脅迫應(yīng)激相關(guān)功能基因的挖掘

    環(huán)境溫度驟降會(huì)導(dǎo)致微生物生理代謝異常,此時(shí)細(xì)胞會(huì)自發(fā)響應(yīng)冷脅迫產(chǎn)生冷應(yīng)激蛋白和蛋白酶,從而提高酶活力、穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、維持DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)及轉(zhuǎn)錄、翻譯功能,降低冷凍干燥對(duì)乳酸菌的損傷[33]。通過(guò)羅伊氏乳桿菌LTR1318的全基因組序列挖掘與冷脅迫應(yīng)激相關(guān)的同源蛋白,結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4 與冷脅迫應(yīng)激相關(guān)的功能基因注釋結(jié)果Table 4 Results of functional annotation of genes related to cold stress

    由表4可知,羅伊氏乳桿菌LTR1318的基因組上存在2 個(gè)冷休克蛋白和3 個(gè)熱休克蛋白的編碼基因。同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)F9294_RS08130編碼的冷休克蛋白與同菌屬的羅伊氏乳桿菌DSM 20016的休克蛋白一致性較高(99%),屬于目前已知的冷休克蛋白。DEAD-Box蛋白是RNA解旋酶中的一種,所需活化能較低,在低溫下更加活躍,與冷脅迫密切相關(guān)[34]。3 個(gè)預(yù)測(cè)到的熱休克蛋白分別是低分子質(zhì)量熱休克蛋白、熱休克蛋白X和熱誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白。相關(guān)研究表明,熱激處理可以降低細(xì)胞膜透性,提高自身抗冷性[35]。

    2.6 冷休克蛋白基因表達(dá)量的變化

    根據(jù)基因組對(duì)冷脅迫相關(guān)基因的挖掘結(jié)果設(shè)計(jì)冷休克蛋白real-time PCR的特異性引物,將編碼基因在凍干前后表達(dá)量作為保護(hù)劑對(duì)菌體保護(hù)效果的評(píng)價(jià)指標(biāo),室溫下表達(dá)量作為空白對(duì)照。由圖5可知,實(shí)驗(yàn)組中冷休克蛋白基因的表達(dá)量在凍干前后均有顯著性差異,較室溫對(duì)照分別上調(diào)18.35 倍和16.90 倍。保護(hù)劑的加入可小幅上調(diào)冷休克蛋白的基因表達(dá)量(上調(diào)8.29%),但與不含保護(hù)劑組相比無(wú)顯著差異。

    圖5 不同保護(hù)劑對(duì)菌體冷休克蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of the optimized protectant on relative expression of Cold shock protein gene

    3 討 論

    真空冷凍干燥過(guò)程雖然會(huì)引起菌體的失活甚至死亡,但仍是目前乳酸菌應(yīng)用和貯藏的主要方式。本研究先選定預(yù)凍條件和凍干工藝等其他影響因素,著重探討保護(hù)劑對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318抗凍性能的影響。

    細(xì)胞失水是乳酸菌凍干過(guò)程中經(jīng)歷的主要過(guò)程。以糖類為代表的多羥基化合物能夠代替原有水分子的位置并包裹在蛋白表面,維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[36]。譚莎莎等[20]以分子質(zhì)量為篩選依據(jù),發(fā)現(xiàn)低聚糖較單糖、二糖、多糖、蛋白質(zhì)和聚合物對(duì)羅伊氏乳桿菌的保護(hù)效果更為顯著,而不同低聚糖間差異不顯著,優(yōu)化后的菌體凍干存活率為93.02%。本研究低聚果糖顯示了比經(jīng)典保護(hù)劑蔗糖和海藻糖更高的保護(hù)效率,與譚沙沙等[20]的結(jié)論一致。擴(kuò)培羅伊氏乳桿菌LTR1318時(shí)發(fā)現(xiàn),低聚果糖的增菌效果強(qiáng)于其他碳源。這種低聚果糖的高代謝活性可能會(huì)加速其在細(xì)胞內(nèi)的積累,從而更高效地保護(hù)菌體。同時(shí),低聚果糖作為一種效果明確的益生元[37],可與菌體協(xié)同增強(qiáng)益生菌在宿主菌群的定植[38]。研究表明,凍干時(shí)的細(xì)胞失水速率對(duì)其活性有顯著影響。氨基酸可通過(guò)維持冰點(diǎn)下水的表面張力平衡細(xì)胞內(nèi)外的水交換速率,降低冰晶對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷[39]。與天冬氨酸和抗壞血酸相比,谷氨酸保留小部分水維持細(xì)胞活性的特點(diǎn)可能提高了氨基酸對(duì)LTR1318的保護(hù)作用。該結(jié)果也與李冰等[40]通過(guò)谷氨酸聚合物提高蛋白質(zhì)凍干穩(wěn)定性的研究結(jié)論一致。目前有關(guān)蛋白質(zhì)增強(qiáng)凍干存活率的報(bào)道表明[41-43],蛋白質(zhì)可通過(guò)穩(wěn)定細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)、減少?gòu)?fù)水對(duì)細(xì)胞膜的沖擊,提高乳酸菌凍干存活率;也有報(bào)道表明大分子保護(hù)劑并不能滲透進(jìn)細(xì)胞壁[20],無(wú)法有效保護(hù)細(xì)胞膜功能和完整性。而本研究的脫脂乳作為蛋白質(zhì)類保護(hù)劑,對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318有較好的保護(hù)效果。本研究確定的保護(hù)劑配方能夠有效提高乳酸菌降低低溫和真空等不利環(huán)境對(duì)細(xì)胞膜的損傷,達(dá)到保護(hù)菌體的作用。

    合理的復(fù)配方式有助于保護(hù)劑間的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),更大程度地發(fā)揮保護(hù)效果。目前在發(fā)酵領(lǐng)域應(yīng)用較多的回歸模型和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型分別是響應(yīng)面和誤差逆向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),而RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的應(yīng)用較少。與響應(yīng)面通過(guò)回歸分析預(yù)測(cè)的方式相比,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)不需使用數(shù)學(xué)模型,而是通過(guò)已有的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行自我學(xué)習(xí)、訓(xùn)練,從而得出結(jié)果。有研究表明,RBF模型比BP模型有更快的收斂速度且更能逼近函數(shù)的最優(yōu)值[44]。神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)通常需要較大訓(xùn)練數(shù)據(jù)量,而本研究29 組RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練數(shù)據(jù)仍然使模型的擬合度接近0.98。較響應(yīng)面模型而言,經(jīng)過(guò)人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法優(yōu)化的預(yù)測(cè)凍干存活率提高了4.14%,實(shí)際凍干存活率提高近9%,在工業(yè)生產(chǎn)中有實(shí)際意義。

    除從外部環(huán)境干預(yù)菌株的抗凍能力,菌體適應(yīng)環(huán)境驟變時(shí)的應(yīng)激反應(yīng)對(duì)自身的存活也起到關(guān)鍵作用。針對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318個(gè)體冷應(yīng)激的耐受性,本研究結(jié)合乳酸菌基因組學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn),與LTR1318適應(yīng)冷脅迫相關(guān)的應(yīng)激蛋白有冷休克蛋白和熱休克蛋白兩種。目前報(bào)道的通過(guò)熱休克蛋白影響抗凍性能的研究主要與植物耐冷有關(guān),而對(duì)乳酸菌抗凍性能影響的研究相對(duì)缺乏。郭麗紅等[45]發(fā)現(xiàn)熱激處理能夠提高冷脅迫條件下玉米幼苗的主要抗氧化酶活性,減少質(zhì)膜透性的增加程度,提高玉米幼苗的抗冷性能;黃上志等[46]發(fā)現(xiàn)萌發(fā)的水稻種子經(jīng)42 ℃熱激處理后,幼苗耐冷性明顯增強(qiáng),并且熱激誘導(dǎo)萌發(fā)的水稻胚合成的熱休克蛋白與水稻幼苗耐寒性的提高有關(guān)。另外,無(wú)保護(hù)劑添加的羅伊氏乳桿菌LTR1318在經(jīng)過(guò)冷凍干燥后,冷休克蛋白基因的相對(duì)表達(dá)量較高,表明該菌株個(gè)體擁有較強(qiáng)的冷脅迫適應(yīng)能力。

    4 結(jié) 論

    本研究以高活性羅伊氏乳桿菌凍干菌粉為制備目標(biāo),采用RBF人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與遺傳算法結(jié)合的新手段,獲得了一種可以有效提高菌株活性和抗凍能力的工藝配方:脫脂乳10.90%、谷氨酸1.20%、低聚果糖1.30%和山梨糖醇0.90%。結(jié)合菌株抗凍的表型和基因型,對(duì)羅伊氏乳桿菌LTR1318抗凍的遺傳學(xué)基礎(chǔ)進(jìn)行初步探索。經(jīng)過(guò)與國(guó)內(nèi)外報(bào)道對(duì)比,本研究通過(guò)人工網(wǎng)絡(luò)模型提高乳酸菌抗凍性能并從基因組學(xué)角度給出菌株自身抗凍性能的遺傳基礎(chǔ),這些技術(shù)和理論對(duì)乳酸菌凍干制劑的制備和真空冷凍干燥技術(shù)的進(jìn)一步應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)作用和參考價(jià)值。

    猜你喜歡
    保護(hù)劑人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)凍干
    凍干益生菌微膠囊保護(hù)劑及抗性研究
    利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)快速計(jì)算木星系磁坐標(biāo)
    微流控法低溫保護(hù)劑添加及去除線型優(yōu)化研究
    人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)單字母的識(shí)別
    電子制作(2019年10期)2019-06-17 11:45:10
    HPLC法測(cè)定注射用清開(kāi)靈(凍干)中6種成分
    中成藥(2018年4期)2018-04-26 07:12:47
    《豬瘟高免血清凍干粉的初步研究》圖版
    嗜酸乳桿菌NX2-6凍干發(fā)酵劑的研究
    基于聲發(fā)射和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的混凝土損傷程度識(shí)別
    低溫保護(hù)劑熱物性分析與冰晶的顯微研究
    發(fā)光菌凍干粉保護(hù)劑及貯藏效果的研究
    1024视频免费在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 99国产精品99久久久久| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 91国产中文字幕| 免费搜索国产男女视频| 日韩大码丰满熟妇| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 99riav亚洲国产免费| 精品国产一区二区久久| 精品国内亚洲2022精品成人| 热re99久久精品国产66热6| avwww免费| 成人免费观看视频高清| 在线看a的网站| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 大型av网站在线播放| www.999成人在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 免费av中文字幕在线| 亚洲在线自拍视频| 999精品在线视频| 深夜精品福利| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品国产国语对白av| www.自偷自拍.com| 日韩视频一区二区在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 日韩免费高清中文字幕av| 亚洲全国av大片| 午夜a级毛片| 日韩成人在线观看一区二区三区| 久久草成人影院| 高清av免费在线| 级片在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 国产高清videossex| 黄色怎么调成土黄色| 最近最新中文字幕大全电影3 | 黑人操中国人逼视频| 精品久久久久久电影网| 免费搜索国产男女视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产成人av激情在线播放| 精品久久久精品久久久| ponron亚洲| 日本精品一区二区三区蜜桃| 天堂动漫精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 五月开心婷婷网| 日本黄色日本黄色录像| 1024视频免费在线观看| 国产亚洲欧美98| 成人18禁在线播放| 国产成人av激情在线播放| av天堂久久9| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲av片天天在线观看| 国产单亲对白刺激| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲专区国产一区二区| 一级毛片高清免费大全| 咕卡用的链子| 欧美精品一区二区免费开放| 操美女的视频在线观看| 国产精品成人在线| 日本vs欧美在线观看视频| 一进一出抽搐动态| 超碰97精品在线观看| 久久久久久人人人人人| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 涩涩av久久男人的天堂| 两人在一起打扑克的视频| 国产国语露脸激情在线看| 欧美色视频一区免费| 一级,二级,三级黄色视频| 在线看a的网站| av网站免费在线观看视频| 1024视频免费在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 真人一进一出gif抽搐免费| 中出人妻视频一区二区| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久久国产成人精品二区 | 一进一出好大好爽视频| 国产精品偷伦视频观看了| 9色porny在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 黄频高清免费视频| svipshipincom国产片| 麻豆成人av在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 一级作爱视频免费观看| 韩国av一区二区三区四区| 91成人精品电影| 国产精品av久久久久免费| 亚洲七黄色美女视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久精品国产综合久久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 麻豆一二三区av精品| 一级a爱视频在线免费观看| 18禁观看日本| 涩涩av久久男人的天堂| 三上悠亚av全集在线观看| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲七黄色美女视频| av超薄肉色丝袜交足视频| 电影成人av| 满18在线观看网站| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久香蕉激情| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲国产欧美网| 国产野战对白在线观看| 亚洲人成电影观看| 国产成人精品久久二区二区免费| 日韩精品免费视频一区二区三区| 香蕉国产在线看| 看片在线看免费视频| 国产片内射在线| 大码成人一级视频| 999久久久精品免费观看国产| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久99久视频精品免费| 91九色精品人成在线观看| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 电影成人av| 精品久久久久久久久久免费视频 | 免费搜索国产男女视频| 国产成人免费无遮挡视频| 久久久国产欧美日韩av| 大香蕉久久成人网| 韩国av一区二区三区四区| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 国产欧美日韩精品亚洲av| 免费不卡黄色视频| 国产亚洲av高清不卡| 啦啦啦 在线观看视频| 十分钟在线观看高清视频www| 手机成人av网站| 欧美激情 高清一区二区三区| bbb黄色大片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 宅男免费午夜| www国产在线视频色| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看| www.熟女人妻精品国产| av天堂在线播放| 久久久久久久精品吃奶| 国产1区2区3区精品| 色在线成人网| 成年人黄色毛片网站| 亚洲av片天天在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 精品国产一区二区久久| 国产精品一区二区精品视频观看| 美女高潮到喷水免费观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 叶爱在线成人免费视频播放| 黑人欧美特级aaaaaa片| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 韩国av一区二区三区四区| 精品人妻在线不人妻| 一区在线观看完整版| 日韩免费高清中文字幕av| 久久天堂一区二区三区四区| x7x7x7水蜜桃| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 成人黄色视频免费在线看| 91在线观看av| 老汉色av国产亚洲站长工具| 久久久国产成人精品二区 | 精品久久久久久电影网| 在线观看www视频免费| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 一级片免费观看大全| 欧美最黄视频在线播放免费 | 极品人妻少妇av视频| 手机成人av网站| 国产精品九九99| 成人三级做爰电影| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲黑人精品在线| 国产精品野战在线观看 | 久久青草综合色| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产亚洲欧美98| 国产高清视频在线播放一区| 国产午夜精品久久久久久| av网站在线播放免费| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产成人系列免费观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 一级毛片高清免费大全| 1024香蕉在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品一区二区三区视频在线观看免费 | 人人妻人人澡人人看| 午夜激情av网站| av有码第一页| 久久久久久久久免费视频了| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲欧美精品综合久久99| 麻豆久久精品国产亚洲av | 超碰97精品在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产又爽黄色视频| 操美女的视频在线观看| 18禁观看日本| 亚洲五月婷婷丁香| av免费在线观看网站| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 91大片在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 日本wwww免费看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 久久国产精品影院| 国产高清激情床上av| 啪啪无遮挡十八禁网站| 大码成人一级视频| x7x7x7水蜜桃| 国产99久久九九免费精品| 一级黄色大片毛片| 美女大奶头视频| 日本免费a在线| 极品人妻少妇av视频| 色综合婷婷激情| 欧美日韩黄片免| 亚洲精品美女久久av网站| 国产熟女午夜一区二区三区| 美女福利国产在线| 久热这里只有精品99| 两人在一起打扑克的视频| 妹子高潮喷水视频| 中国美女看黄片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 久久香蕉国产精品| 在线播放国产精品三级| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产精品一区二区精品视频观看| 嫩草影院精品99| 国产精品一区二区免费欧美| 两个人免费观看高清视频| 国产麻豆69| 热re99久久精品国产66热6| cao死你这个sao货| 不卡av一区二区三区| 美女高潮到喷水免费观看| 搡老乐熟女国产| 一级a爱片免费观看的视频| 久久久国产成人免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 性欧美人与动物交配| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 亚洲五月天丁香| 91九色精品人成在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 宅男免费午夜| av天堂久久9| 99re在线观看精品视频| 成人国语在线视频| 色在线成人网| 十分钟在线观看高清视频www| 国产精品综合久久久久久久免费 | 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩免费av在线播放| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 午夜久久久在线观看| 亚洲美女黄片视频| 一进一出抽搐动态| 国产精品综合久久久久久久免费 | 极品人妻少妇av视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产av又大| 国产精品1区2区在线观看.| 91av网站免费观看| 91在线观看av| 大陆偷拍与自拍| 国产99久久九九免费精品| 亚洲成人国产一区在线观看| av天堂久久9| 日本 av在线| 久久草成人影院| www.自偷自拍.com| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 自线自在国产av| 欧美乱妇无乱码| 一级黄色大片毛片| 久久久久国内视频| 久热爱精品视频在线9| 亚洲av第一区精品v没综合| 色播在线永久视频| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲午夜理论影院| 99精国产麻豆久久婷婷| 咕卡用的链子| 露出奶头的视频| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美黑人精品巨大| 黑人猛操日本美女一级片| 午夜福利欧美成人| 一级片'在线观看视频| 美女大奶头视频| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 午夜视频精品福利| 一区在线观看完整版| 亚洲精品在线美女| 国产精华一区二区三区| 日本黄色视频三级网站网址| 久久久久九九精品影院| 欧美成人午夜精品| 日韩高清综合在线| 丰满饥渴人妻一区二区三| 丝袜人妻中文字幕| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲一区二区三区欧美精品| 午夜两性在线视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 免费在线观看日本一区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久狼人影院| 日韩av在线大香蕉| 成人影院久久| 纯流量卡能插随身wifi吗| 黄色a级毛片大全视频| 18禁观看日本| av网站免费在线观看视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 欧美在线黄色| 国产欧美日韩一区二区精品| 欧美人与性动交α欧美软件| 欧美黑人欧美精品刺激| 少妇的丰满在线观看| 一区二区三区激情视频| 黄色视频,在线免费观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 男女高潮啪啪啪动态图| 成人国产一区最新在线观看| 在线观看日韩欧美| 18禁观看日本| 国产亚洲欧美98| 亚洲成人免费av在线播放| 精品无人区乱码1区二区| 国产深夜福利视频在线观看| 性少妇av在线| 亚洲成人精品中文字幕电影 | 一本大道久久a久久精品| 欧美日韩乱码在线| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产精品综合久久久久久久免费 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 老司机福利观看| 美女大奶头视频| 婷婷丁香在线五月| 国产av一区二区精品久久| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 精品国产美女av久久久久小说| 日本wwww免费看| 亚洲五月色婷婷综合| 美女福利国产在线| 亚洲欧美激情在线| 国产精品一区二区三区四区久久 | 成人永久免费在线观看视频| 深夜精品福利| 久久久国产一区二区| 日韩免费av在线播放| 在线观看午夜福利视频| 一级毛片高清免费大全| 男人舔女人的私密视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 亚洲在线自拍视频| 精品国产亚洲在线| 精品国产乱码久久久久久男人| 高潮久久久久久久久久久不卡| 精品一品国产午夜福利视频| 操美女的视频在线观看| 12—13女人毛片做爰片一| 男女下面插进去视频免费观看| 欧美成人午夜精品| 久久精品国产亚洲av高清一级| 激情在线观看视频在线高清| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | av国产精品久久久久影院| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 多毛熟女@视频| 美女大奶头视频| 免费不卡黄色视频| 99久久人妻综合| 无人区码免费观看不卡| 日韩免费av在线播放| 亚洲人成电影免费在线| 12—13女人毛片做爰片一| 国产黄色免费在线视频| 欧美性长视频在线观看| 在线天堂中文资源库| 夫妻午夜视频| 亚洲第一av免费看| x7x7x7水蜜桃| 欧美日韩亚洲高清精品| 这个男人来自地球电影免费观看| 岛国在线观看网站| 黑丝袜美女国产一区| 高潮久久久久久久久久久不卡| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | bbb黄色大片| 丝袜在线中文字幕| 大香蕉久久成人网| 少妇 在线观看| 亚洲av熟女| 中文字幕av电影在线播放| 午夜福利在线免费观看网站| www日本在线高清视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 9191精品国产免费久久| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久九九热精品免费| 男人舔女人的私密视频| 99久久综合精品五月天人人| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 午夜福利免费观看在线| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 视频在线观看一区二区三区| 午夜精品国产一区二区电影| 性欧美人与动物交配| 两个人免费观看高清视频| 国产成人av激情在线播放| 午夜福利免费观看在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 黄片大片在线免费观看| 97碰自拍视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产精品免费一区二区三区在线| 韩国精品一区二区三区| 欧美性长视频在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 色精品久久人妻99蜜桃| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产激情欧美一区二区| 欧美激情 高清一区二区三区| 多毛熟女@视频| 久久人人精品亚洲av| 欧美日韩福利视频一区二区| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩欧美免费精品| 夜夜躁狠狠躁天天躁| av视频免费观看在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 少妇粗大呻吟视频| 母亲3免费完整高清在线观看| 免费在线观看日本一区| 国产91精品成人一区二区三区| 久久久国产成人精品二区 | 美女 人体艺术 gogo| 亚洲av五月六月丁香网| 亚洲性夜色夜夜综合| 看免费av毛片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 精品欧美一区二区三区在线| 91字幕亚洲| 99香蕉大伊视频| 久久精品91蜜桃| 免费看十八禁软件| 97人妻天天添夜夜摸| 日本a在线网址| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美成狂野欧美在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 国产高清videossex| 亚洲中文av在线| 国产精品国产高清国产av| 啪啪无遮挡十八禁网站| a级毛片黄视频| 久久久久久久午夜电影 | 国产精品一区二区在线不卡| 韩国精品一区二区三区| 青草久久国产| 一区二区三区激情视频| 国产成人影院久久av| 午夜激情av网站| 亚洲五月天丁香| 一级黄色大片毛片| 日韩高清综合在线| 少妇 在线观看| 亚洲人成电影观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| tocl精华| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品一区二区三区av网在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 国产区一区二久久| 老汉色∧v一级毛片| 精品熟女少妇八av免费久了| 嫩草影视91久久| 久久这里只有精品19| 免费看a级黄色片| 女人精品久久久久毛片| 美女大奶头视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| av视频免费观看在线观看| 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲av美国av| 免费在线观看日本一区| 国产成人精品无人区| 黄色 视频免费看| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品一区二区三区四区久久 | 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲熟妇熟女久久| 女性被躁到高潮视频| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品国产一区二区三区四区第35| 免费观看精品视频网站| 免费人成视频x8x8入口观看| 好男人电影高清在线观看| 黑人猛操日本美女一级片| 一个人免费在线观看的高清视频| 在线观看66精品国产| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 搡老岳熟女国产| 国产激情欧美一区二区| 日韩人妻精品一区2区三区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 黄色丝袜av网址大全| 露出奶头的视频| 久久香蕉精品热| av片东京热男人的天堂| 欧美黑人欧美精品刺激| 女性被躁到高潮视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 日本 av在线| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲av电影在线进入| 日韩中文字幕欧美一区二区| 久久草成人影院| 欧美激情极品国产一区二区三区| 黄色成人免费大全| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 十八禁网站免费在线| 9热在线视频观看99| 黄色片一级片一级黄色片| 丰满的人妻完整版| 搡老熟女国产l中国老女人| 久久九九热精品免费| 精品国产一区二区三区四区第35| 麻豆一二三区av精品| 国产成人影院久久av| 国产成人系列免费观看| 窝窝影院91人妻| 一级,二级,三级黄色视频| 午夜免费成人在线视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 51午夜福利影视在线观看| 男人舔女人的私密视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日本a在线网址| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产高清videossex| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 久久久久久大精品| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 久久久国产成人精品二区 | a级毛片黄视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产精品二区激情视频| 真人做人爱边吃奶动态| 大型av网站在线播放| 激情视频va一区二区三区| 两人在一起打扑克的视频| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 51午夜福利影视在线观看| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 免费不卡黄色视频| 国产主播在线观看一区二区| 窝窝影院91人妻| 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久精品91蜜桃| 在线av久久热| 18禁国产床啪视频网站|