• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    分子對接和光譜法研究原兒茶醛和阿魏酸與牛血清白蛋白的互作機(jī)理

    2021-07-28 08:34:18呂艷芳梁倩倩郭雨晴李學(xué)鵬劉欣欣勵建榮
    食品科學(xué) 2021年14期
    關(guān)鍵詞:鍵長內(nèi)源殘基

    呂艷芳,梁倩倩,郭雨晴,李學(xué)鵬,劉欣欣,沈 琳,勵建榮,

    (1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧 錦州 121013;2.上海交通大學(xué)分析測試中心,上海 200240;3.大連東霖食品股份有限公司,遼寧 大連 116007)

    多酚是指存在于植物體內(nèi)、化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含多個酚羥基的一類化合物的總稱。多酚類物質(zhì)是重要的功能性成分,具有抗氧化、抗菌和抗癌等多種功能,而這些功能可能是由于多酚與體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等靶分子直接或間接相互作用所致[1]。目前,關(guān)于多酚的研究報道有很多,Chen Xiaowei等[2]研究了蘆丁對大豆蛋白界面性能和乳液穩(wěn)定性的影響。黃淵等[3]分別研究了白藜蘆醇、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)和沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)對鰱魚肌球蛋白(silver carp myosin,SCM)空間結(jié)構(gòu)的影響。

    原兒茶醛(protocatechuic aldehyde,PCA)的結(jié)構(gòu)如圖1A所示,化學(xué)名稱為3,4-二羥基苯甲醛,多見于烏蕨、四季青和丹參的根葉部,具有多種生理活性。近年來,對于PCA的研究主要集中在醫(yī)藥領(lǐng)域。祝友文等[4]和高麗[5]分別研究發(fā)現(xiàn)PCA對環(huán)磷酰胺引起雄性小鼠的生殖損傷和順鉑介導(dǎo)的小鼠急性腎臟損傷具有保護(hù)作用。張寒等[6]發(fā)現(xiàn)PCA具有舒張血管的功能。另外,PCA也是合成其他香料和藥物的中間體[7]。PCA由于具有鄰二酚母核結(jié)構(gòu)而展現(xiàn)出顯著的抗氧化活性,Bountagkidou等[8]通過研究添加5 種天然多酚防腐劑的木桶裝紅酒的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)只有PCA在所有測定環(huán)境中均對紅酒表現(xiàn)出高抗氧化活性,因此有望將其用作食品抗氧化劑,但目前PCA在食品領(lǐng)域的研究及應(yīng)用都比較少,這可能與其作用機(jī)制不明有一定關(guān)系。

    圖1 PCA(A)、FA(B)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of PCA (A) and FA (B)

    阿魏酸(ferulic acid,F(xiàn)A)的結(jié)構(gòu)如圖1B所示,化學(xué)名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸,主要存在于麥麩等谷物和川芎等中草藥中。FA的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性良好,且毒性較低,又因其具有良好的藥理作用和生物活性,越來越多的國家開始將其用于食品、醫(yī)藥等各個領(lǐng)域。李黎云[9]發(fā)現(xiàn)在待宰育肥豬的日糧中添加FA,會增加豬肉產(chǎn)品的嫩度,且延長保質(zhì)期。魏延玲等[10]發(fā)現(xiàn),F(xiàn)A能夠抑制風(fēng)干鱸魚中N-二甲基亞硝胺的生成以及微生物的生長繁殖,并能有效清除鱸魚中殘留的亞硝酸鹽,從而降低人類患高血壓、癌癥等疾病的機(jī)率。饒文婷等[11]發(fā)現(xiàn)FA能夠調(diào)節(jié)腸道菌群。近年來,F(xiàn)A的多功能性使其成為食品添加劑領(lǐng)域的研究熱點[12],因此對其作為食品添加劑的安全性進(jìn)行評估至關(guān)重要,通過研究FA與生物大分子的相互作用,從而深入理解FA結(jié)構(gòu)變化對其毒理性質(zhì)和功能特性的影響,對新型天然食品添加劑的開發(fā)有重要的意義。

    人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是血液中的多功能轉(zhuǎn)運蛋白,能可逆結(jié)合小分子物質(zhì)并將其運送到人體需要的各個部位。牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)在序列和構(gòu)象上與HSA具有高度同源性和相似性,且價格相對比較便宜,因此被廣泛應(yīng)用于小分子物質(zhì)與血清蛋白的研究中[13]。隨著計算機(jī)模擬技術(shù)的迅速發(fā)展以及更多蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的解析,分子對接已經(jīng)成為研究小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的重要手段。Cheng Hao等[14]應(yīng)用光譜法結(jié)合分子對接技術(shù)對比研究了順式、反式白藜蘆醇與BSA的相互作用。Das等[15]應(yīng)用該技術(shù)研究了EGCG與牛血紅蛋白(hemoglobin,HGB)的相互作用。

    利用分子對接技術(shù)研究蛋白質(zhì)與多酚間的相互作用,并同光譜實驗的結(jié)論進(jìn)行分析、比較從而互相驗證、補(bǔ)充,進(jìn)而能夠從實驗和理論研究其相互作用。目前,關(guān)于PCA和FA與大分子相互作用的機(jī)理研究較少,并且在食品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍也較小,為使其在食品加工、貯藏保鮮等多個領(lǐng)域中像EGCG、茶多酚和白藜蘆醇等多酚一樣被廣泛應(yīng)用,本實驗應(yīng)用紫外光譜、熒光光譜、同步熒光光譜以及分子模擬技術(shù)綜合分析PCA和FA與BSA相互作用的機(jī)制,有助于在分子水平上了解其與蛋白質(zhì)的相互作用,最終為PCA和FA在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    PCA、FA(純度≥99%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;BSA(純度≥98%) 美國Sigma公司;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉(均為分析純) 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    MS105DU電子分析天平、FiveEasy Plus FE28 pH計瑞士梅特勒-托利多公司;KX-1990超聲波清洗儀 北京科璽有限公司;DK8D電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;UV2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司;FluoroMax-4熒光光度計 法國HORIBA公司。

    1.3 方法

    1.3.1 紫外光譜法測定PCA和FA與BSA的相互作用

    于7 支試管中分別移取質(zhì)量濃度2.5×10-3g/mL的BSA溶液0.5 mL和濃度為1.0×10-4mol/L的PCA、FA溶液分別0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL,最后用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)(0.067 mol/L,pH 7.4)稀釋,使多酚的終濃度分別為0、5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、30×10-6mol/L,BSA終質(zhì)量濃度為2.5×10-4g/mL,充分混勻后,于298 K靜置10 min,使用紫外分光光度計進(jìn)行光譜掃描200~800 nm的范圍,以濃度為0 mol/L的PCA、FA溶液作為對照。

    1.3.2 熒光光譜法測定PCA和FA與BSA的相互作用

    取3 組試管,每組8 支,分別加入質(zhì)量濃度為2.5×10-3g/mL的BSA溶液0.5 mL和1.0×10-4mol/L的PCA、FA溶液分別為0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mL,以PBS(0.067 mol/L,pH 7.4)定容,使多酚終濃度分別為0、5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、30×10-6、35×10-6mol/L,BSA終質(zhì)量濃度為2.5×10-4g/mL,充分混勻后,將第1組混合溶液于298 K靜置10 min,第2組于310 K恒溫水浴10 min,第3組于320 K恒溫水浴10 min,使用熒光光度計進(jìn)行光譜掃描,在激發(fā)波長281 nm、狹縫寬度5 nm、掃描范圍280~450 nm的條件下檢測,并以PCA、FA濃度均為0 mol/L的溶液作為對照。

    1.3.3 熒光猝滅計算

    通過Stern-Volmer方程(1)計算猝滅常數(shù)的變化,以判斷PCA和FA對BSA的熒光猝滅類型;采用雙對數(shù)方程(2)計算PCA和FA分別與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n;使用熱力學(xué)方程(3)和(4)計算PCA和FA分別與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)[16]。

    式中:F0為對照組的熒光強(qiáng)度;F為PCA和FA濃度為Q時BSA的熒光強(qiáng)度;[Q]為PCA和FA的濃度/(mol/L);Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)/(L/mol),可由F0/F對[Q]的斜率求得;Kq為猝滅速率常數(shù)/(L/(mol·s));τ0為猝滅劑不存在時生物大分子的平均熒光壽命(約為10-8s);ΔG為自由能變/(kJ/mol);ΔH為焓變/(kJ/mol);ΔS為熵變/(J/(mol·K))。

    1.3.4 同步熒光光譜法測定PCA和FA與BSA的相互作用

    BSA和多酚溶液處理方法同1.3.1節(jié)所敘述的方式。以波長差(Δλ)分別為15 nm和60 nm、狹縫寬度:1 nm、掃描范圍:200~400 nm的條件進(jìn)行同步熒光檢測。

    1.3.5 分子對接

    從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb)搜索ID編號:“4F5S”的BSA晶體結(jié)構(gòu)并下載[17],利用PyMol軟件對BSA進(jìn)行去亞基、去水和刪除小分子配體等操作,并保存成PDB格式;從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取PCA(CID:8768)和FA(CID:445858)的二維結(jié)構(gòu)[18],運用ChemDraw軟件對其進(jìn)行能量優(yōu)化并保存成PDB格式,然后利用AutoDock軟件對BSA、PCA和FA進(jìn)行加氫、計算電荷等前處理步驟后,保存成PDBQT格式,最后使用AutoDock-vina軟件進(jìn)行分子對接,對接結(jié)果采用Discovery Studio 2017 R2 Client、PyMol軟件進(jìn)行處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCA和FA與BSA相互作用的紫外光譜分析

    298 K時不同濃度的PCA和FA分別與BSA相互作用的紫外光譜結(jié)果如圖2所示,當(dāng)PCA和FA為0 mol/L時,BSA在276 nm波長處有一強(qiáng)吸收峰,這主要是由BSA的酪氨酸(tyrosine,Tyr)、色氨酸(tryptophan,Trp)殘基的苯環(huán)π→π*躍遷產(chǎn)生[19]。PCA和FA濃度在0~30×10-6mol/L的范圍時,隨著PCA和FA濃度的增加,BSA在276 nm波長處的吸收峰強(qiáng)度不斷增大,且波長從276 nm紅移至280 nm,說明PCA和FA的加入使BSA分子內(nèi)部的Trp、Tyr殘基裸露于水相中,疏水殘基間的疏水作用力減弱,從而與BSA形成復(fù)合物,導(dǎo)致BSA的共軛程度增強(qiáng),產(chǎn)生了新的π→π*躍遷,最終引起B(yǎng)SA紫外吸收強(qiáng)度增大,吸收峰紅移[20]。動態(tài)猝滅不引起蛋白質(zhì)吸收峰波長改變,而靜態(tài)猝滅則會導(dǎo)致吸收峰波長改變[21]。因此,初步判斷PCA和FA對BSA的猝滅過程均為靜態(tài)猝滅。

    圖2 298 K時PCA(A)、FA(B)與BSA相互作用的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of PCA-BSA (A) and FA-BSA (B)interactions at 298 K

    2.2 PCA和FA與BSA相互作用的熒光光譜分析

    298、310、320 K時,不同濃度的PCA與BSA相互作用的內(nèi)源熒光光譜如圖3所示,當(dāng)激發(fā)波長為281.0 nm時,BSA分別在347.0、349.0、345.0 nm波長處有1 個強(qiáng)熒光發(fā)射峰。Aprodu等[22]發(fā)現(xiàn),Trp的最大熒光發(fā)射波長(λem)在308.0~352.0 nm范圍內(nèi),而Tyr的最大熒光發(fā)射波長為304.0 nm,因此可以推斷BSA的內(nèi)源熒光主要來源于Trp殘基。由圖3、4可知,PCA和FA濃度在0~35×10-6mol/L時,隨著PCA和FA濃度的增加,3 種溫度下的BSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度都呈下降趨勢,說明PCA和FA都可以與BSA結(jié)合,使其內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅。BSA的內(nèi)源熒光猝滅程度隨著FA、PCA各自濃度增加而加劇,且PCA對BSA的猝滅效果比FA更明顯,其可能是因為PCA和FA結(jié)合在BSA的Trp134殘基或Trp213殘基附近。沈亮亮[23]利用熒光光譜法研究苦丁茶中紫莖女貞苷A和紫莖女貞苷B與BSA的相互作用時發(fā)現(xiàn),紫莖女貞苷A對BSA內(nèi)源熒光的猝滅效果比紫莖女貞苷B更明顯,說明紫莖女貞苷A更接近BSA的Trp殘基。由此可以推測,PCA和FA分別與BSA作用時,PCA距離BSA的Trp134或Trp213殘基更近一些。如圖3所示,隨著PCA濃度的增大,BSA的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生明顯紅移,其在298 K時從347.0 nm紅移到366.5 nm;其在310 K時從349.0 nm紅移到366.5 nm;其在320 K時從345.0 nm紅移到367.0 nm。由圖4可知,隨著FA濃度的增大,BSA的最大熒光發(fā)射波長也發(fā)生明顯紅移,其在298 K時從347.0 nm紅移到351.0 nm;其在310 K時從349.0 nm紅移到350.0 nm;其在320 K時從345.0 nm紅移到349.0 nm,此結(jié)果說明PCA和FA的加入均會使BSA的Trp134或Trp213殘基周圍的極性增強(qiáng),疏水性減弱,表明Trp134殘基或Trp213殘基逐漸從BSA內(nèi)部的疏水環(huán)境中暴露出來、肽鏈逐漸伸展、發(fā)生去折疊現(xiàn)象[24],也說明PCA、FA對BSA的猝滅均可能是靜態(tài)猝滅。另外,比較BSA分別與PCA和FA結(jié)合后最大熒光發(fā)射波長的變化,可以發(fā)現(xiàn)BSA與PCA相互作用后的最大熒光發(fā)射波長紅移更明顯,這可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān),PCA的分子質(zhì)量低于FA的分子質(zhì)量,且PCA比FA多1 個酚羥基,所以極性更大的PCA可更大程度地增強(qiáng)Trp134殘基或Trp213殘基周圍的極性,使BSA的肽鏈更加伸展,從而更深入地插到BSA的疏水區(qū)域中[23]。

    圖3 不同溫度下PCA與BSA相互作用的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of PCA-BSA interactions at different temperatures

    圖4 不同溫度下FA與BSA相互作用的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of FA-BSA interactions at different temperatures

    2.3 熒光猝滅機(jī)理

    2.3.1 PCA和FA對BSA的熒光猝滅類型

    298、310、320 K時,PCA和FA與BSA相互作用的Stern-Volmer擬合結(jié)果如圖5所示,F(xiàn)0/F和[Q]之間存在良好的線性關(guān)系。PCA和FA與BSA相互作用的Ksv、Kq值如表1所示,隨著溫度從298 K升高到320 K,PCA與BSA相互作用的Ksv值從1.015×105L/mol減小到6.939×104L/mol,F(xiàn)A與BSA相互作用的Ksv值從4.863×104L/mol減小到3.430×104L/mol,而且在不同的溫度條件下,PCA和FA與BSA相互作用的Kq值均遠(yuǎn)大于最大動態(tài)猝滅速率2.0×1010L/(mol·s)[25],說明PCA和FA都分別與BSA形成了大分子復(fù)合物,且其均為靜態(tài)猝滅過程[17]。此外,在同一溫度下,PCA與BSA相互作用的Kq值均大于FA與BSA相互作用的Kq值,因此與FA相比,PCA對BSA的內(nèi)源熒光猝滅程度更大。

    圖5 不同溫度下PCA(A)和FA(B)與BSA相互作用的Stern-Volmer擬合圖Fig.5 Stern-Volmer plot of PCA-BSA (A) and FA-BSA (B)interactions at different temperatures

    表1 不同溫度下PCA和FA與BSA相互作用的猝滅常數(shù)Table 1Quenching constants for PCA-BSA and FA-BSA interactions at different temperatures

    2.3.2 PCA和FA與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

    298、310、320 K時,PCA和FA與BSA相互作用的雙對數(shù)結(jié)果如圖6所示,PCA和FA與BSA相互作用的Ka、n值如表2所示,隨著溫度從298 K升高到320 K,PCA與BSA相互作用的Ka值從1.011×106L/mol減小到1.818×105L/mol,F(xiàn)A與BSA相互作用的Ka值從8.322×105L/mol減小到4.881×104L/mol,均達(dá)到104數(shù)量級,說明PCA和FA與BSA相互作用的熒光猝滅類型均以靜態(tài)猝滅為主、動態(tài)猝滅可忽略不計,進(jìn)一步說明PCA和FA均能與BSA形成穩(wěn)定的復(fù)合物[26],其與2.1、2.2、2.3.1節(jié)所得結(jié)論一致。不同溫度條件下,PCA和FA與BSA相互作用的n值均接近1.000,說明PCA和FA與BSA的結(jié)合比例約為1∶1。此外,溫度相同時,PCA與BSA相互作用的Ka值均大于FA與BSA的Ka值,說明PCA與BSA之間的結(jié)合力大于FA與BSA的結(jié)合力,這可能是因為PCA的極性強(qiáng)于FA的極性。楊淑玲等[27]研究發(fā)現(xiàn),在36~37 ℃時黃體酮(progesterone,PROG)與BSA相互作用的Ka值為1.423×104L/mol,推測PROG進(jìn)入人體后能與HSA較好地互作,從而被HSA運輸?shù)桨衅鞴佟?10 K時PCA、FA與BSA相互作用的Ka值分別為9.005×105、2.553×105L/mol,遠(yuǎn)大于104L/mol,因此也可推測,PCA和FA均能與HSA在人體環(huán)境中進(jìn)行較好地相互作用,且PCA比FA更容易被HSA貯存、運輸。

    圖6 不同溫度下PCA(A)和FA(B)與BSA相互作用的雙對數(shù)圖Fig.6 Double logarithmic plots for PCA-BSA (A) and FA-BSA (B)interactions at different temperatures

    表2 不同溫度下PCA和FA與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)Table 2Binding constants and binding site numbers for PCA-BSA and FA-BSA interactions at different temperatures

    2.3.3 PCA和FA與BSA相互作用的作用力類型

    PCA和FA與BSA相互作用的ΔG、ΔH、ΔS值如表3所示,在298、310、320 K共3 種不同溫度條件下,PCA和FA與BSA相互作用過程中的ΔG均小于0,說明PCA和FA與BSA的結(jié)合過程是自發(fā)進(jìn)行的。PCA與BSA相互作用的ΔS、ΔH值分別為-107.186 J/(mol·K)、-67.088 kJ/mol,F(xiàn)A與BSA相互作用的ΔS、ΔH值分別為-284.251 J/(mol·K)、-23.332 kJ/mol,其均小于0,說明PCA和FA與BSA相互作用過程中的主要作用力均為氫鍵和范德華力[28]。這與吳雨杭[29]研究染料木素、金雀花堿與BSA分別相互作用過程和黃朝波等[18]研究紅斑紅曲胺與BSA相互作用過程的作用力一致。

    表3 PCA和FA與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3Thermodynamic parameters for PCA-BSA and FA-BSA interactions

    2.4 PCA、FA與BSA相互作用的同步熒光光譜分析

    同步熒光常用來分析小分子物質(zhì)對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響,Δλ1=15 nm和Δλ2=60 nm時,同步熒光光譜分別顯示蛋白質(zhì)中Tyr、Trp殘基的特征信息[30]。由圖7A、8A可知,隨著PCA和FA的加入,Tyr殘基的熒光發(fā)生略微藍(lán)移,說明PCA和FA會使Tyr殘基周圍的極性降低,疏水性增強(qiáng)[3];由圖7B、8B可知,隨著PCA的加入,Trp殘基的熒光基本未發(fā)生移動;而FA的加入,使Trp殘基的熒光發(fā)生略微紅移,說明FA使Trp殘基周圍的極性增加,疏水性減弱。由圖7、8可知,BSA中的Tyr、Trp殘基分別在303、346 nm處有最大特征吸收峰,Trp的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于Tyr,其對應(yīng)關(guān)系約為10∶1,這主要是因為蛋白質(zhì)中熒光強(qiáng)度比約為Trp∶Tyr∶Phe=100∶9∶0.5[18]。隨著PCA和FA濃度的增加,Tyr和Trp的熒光均呈現(xiàn)降低趨勢,且Trp的熒光猝滅效率大于Tyr的熒光猝滅效率,結(jié)合2.2節(jié)得出的結(jié)論:加入PCA和FA導(dǎo)致BSA的內(nèi)源熒光紅移現(xiàn)象的發(fā)生,可以推斷PCA和FA導(dǎo)致BSA發(fā)生熒光猝滅的主要原因是Trp殘基的熒光發(fā)生了猝滅。庹潯等[31]研究發(fā)現(xiàn),小分子物質(zhì)與主要結(jié)合在BSA的IIA或IIIA結(jié)構(gòu)域中,IIA結(jié)合域含有Trp213、Tyr262殘基,IIIA結(jié)構(gòu)域含有Tyr400、Tyr410、Tyr451、Tyr496殘基。2.3.2節(jié)發(fā)現(xiàn),PCA和FA與BSA均只有1 個結(jié)合位點,結(jié)合同步熒光的結(jié)果,PCA和FA使BSA熒光發(fā)生猝滅的原因主要是導(dǎo)致Trp殘基的熒光發(fā)生猝滅,推測PCA和FA與BSA的結(jié)合位點可能在IIA結(jié)構(gòu)域的Trp213殘基附近。

    圖7 PCA與BSA相互作用的同步熒光光譜及λem的變化Fig.7 Synchronous fluorescence spectra of PCA-BSA interactions and λem shift

    圖9、10分別為PCA、FA與BSA相互作用的分子模擬結(jié)果圖,結(jié)合能量分別為-5.1、-6.3 kcal/mol。由圖9A可知,PCA與BSA形成了4 個常規(guī)氫鍵(O···H—X),其包括:PCA酚羥基的氫與Asp450的羧基氧形成氫鍵,鍵長為3.04 ?;PCA的2 個酚羥基氧與Ser343側(cè)鏈的羥基的氫分別形成2 個氫鍵,鍵長分別為4.31、4.32 ?;PCA醛基的氧與Trp213吲哚基上的氨基的氫形成氫鍵,鍵長為5.12 ?,這4 個氫鍵加強(qiáng)了相互作用過程中非共價結(jié)合的強(qiáng)度,穩(wěn)定了PCA與BSA復(fù)合物的空間構(gòu)象[32]。同時,PCA的苯環(huán)與BSA的疏水性氨基酸Val342的丙基側(cè)鏈形成了疏水鍵,鍵長為5.03 ?,有利于維持PCA和BSA作用部位的空間構(gòu)象。另外,PCA的苯環(huán)分別與Arg194帶正電荷的胍基和Asp450帶負(fù)電荷的羧基基于π-陽離子和π-陰離子作用而結(jié)合,鍵長分別為6.30、4.07 ?。此外,PCA與BSA的Leu197、Arg198、Ala341、Glu449、Ser453、Leu454殘基形成了范德華力,也對復(fù)合物的空間構(gòu)象有很大的支持作用。

    圖8 FA與BSA相互作用的同步熒光光譜及λem的變化Fig.8 Synchronous fluorescence spectra of FA-BSA interactions and λem shift

    圖9 PCA與BSA相互作用的分子對接圖Fig.9 Molecular docking diagram of PCA with BSA

    2.5 分子對接結(jié)果分析

    由圖9A、10A可知,PCA和FA主要靠氫鍵和范德華力與BSA結(jié)合,與2.3.3節(jié)所得結(jié)論一致。由圖9B、10B可知,PCA和FA在BSA上的最佳結(jié)合位點在IIA結(jié)合域和IIIA結(jié)合域之間,且距離IIA結(jié)合域更近,這與2.4節(jié)的推測一致。PCA和FA分別與Trp213靠氫鍵作用而結(jié)合,如圖9D、10D所示,其結(jié)合在Trp213及其周圍的疏水性殘基形成的疏水口袋中,此現(xiàn)象解釋了PCA和FA導(dǎo)致BSA內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅的原因,進(jìn)一步驗證了光譜實驗的結(jié)論。另外,由圖9A、10A還可知,PCA比FA距離BSA的Trp213更近,其對應(yīng)關(guān)系為0.512 nm<0.518 nm,根據(jù)Forster[33]的非輻射能量轉(zhuǎn)移機(jī)理可知,雖然PCA和FA均可被BSA貯存、轉(zhuǎn)運,但PCA更容易被BSA貯存并運輸。

    圖10 FA與BSA相互作用的分子對接圖Fig.10 Molecular docking diagram of FA with BSA

    由圖10A可知,F(xiàn)A與BSA分子形成了4 個常規(guī)氫鍵(O···H—X)包括:FA的羧基氫與Val481的羧基氧形成氫鍵,鍵長為4.09 ?;FA的羧基氧分別與Arg483、Arg484的氨基氫形成氫鍵,鍵長分別為5.32、4.89 ?;FA的羰基氧與Arg484的氨基氫形成氫鍵,鍵長為5.12 ?。同時,F(xiàn)A酚羥基上電負(fù)性的氧與Trp213吲哚基上的雙鍵碳形成了碳?xì)滏I(O···CH2=CH2),鍵長為5.18 ?。4 個氫鍵對維持FA與BSA形成復(fù)合物的穩(wěn)定起關(guān)鍵作用。另外,F(xiàn)A的苯環(huán)分別與BSA的疏水性氨基酸Leu197、Leu346、Leu480、Val481的烴基側(cè)鏈形成了4 個疏水鍵,鍵長分別為6.69、6.39、5.05、4.80 ?,其減少了疏水性氨基酸與水的作用,有助于維護(hù)FA與BSA形成復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。此外,F(xiàn)A與BSA的Ser201、Val342、Ser343、Arg347、Ser453、Leu456、Asn482、Pro485殘基形成了范德華力。

    3 結(jié) 論

    實驗利用光譜法和分子對接技術(shù)研究了PCA和FA分別與BSA的相互作用。紫外光譜發(fā)現(xiàn),298 K時PCA和FA均會導(dǎo)致BSA的特征吸收峰強(qiáng)度和波長發(fā)生改變。熒光光譜的研究表明PCA和FA均會導(dǎo)致BSA的內(nèi)源熒光發(fā)生靜態(tài)猝滅,λem紅移,且PCA對BSA的作用更明顯;PCA和FA在BSA上均只有1 個結(jié)合位點,且PCA與BSA之間的結(jié)合能力強(qiáng)于FA與BSA的結(jié)合;由于ΔG、ΔS、ΔH值均小于0,所以PCA和FA主要靠氫鍵和范德華力與BSA形成穩(wěn)定復(fù)合物,且此過程自發(fā)進(jìn)行。同步熒光光譜的結(jié)果說明,PCA和FA的加入均會影響B(tài)SA的Tyr殘基或Trp殘基的微環(huán)境,并導(dǎo)致Tyr和Trp的熒光發(fā)生猝滅,且Trp的熒光猝滅效率大于Tyr的熒光猝滅效率。分子對接進(jìn)一步驗證了光譜實驗的結(jié)果,并發(fā)現(xiàn)PCA、FA在BSA上的最佳結(jié)合位點在IIA、IIIA結(jié)合域之間的疏水空腔中,且距離IIA結(jié)合域更近,同時因為PCA比FA距離BSA的Trp213更近,其對應(yīng)關(guān)系為0.512 nm<0.518 nm,由此推測PCA更容易被BSA貯存運輸。

    猜你喜歡
    鍵長內(nèi)源殘基
    陰離子調(diào)控錳基鈣鈦礦中Mn─O的鍵長和磁性
    基于各向異性網(wǎng)絡(luò)模型研究δ阿片受體的動力學(xué)與關(guān)鍵殘基*
    “殘基片段和排列組合法”在書寫限制條件的同分異構(gòu)體中的應(yīng)用
    內(nèi)源多胺含量在砂梨果實發(fā)育過程中的變化研究
    密度泛函理論研究鎘的二鹵化合物分子的結(jié)構(gòu)和振動頻率
    蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)序列與殘基種類間關(guān)聯(lián)的分析
    淺議鍵能與鍵長的關(guān)系
    內(nèi)源信號肽DSE4介導(dǎo)頭孢菌素C?;冈诋叧嘟湍钢械姆置诒磉_(dá)
    一次注射15N-亮氨酸示蹤法檢測雞內(nèi)源氨基酸損失量適宜參數(shù)的研究
    基于支持向量機(jī)的蛋白質(zhì)相互作用界面熱點殘基預(yù)測
    99国产精品一区二区蜜桃av| 亚洲成人久久爱视频| 美女高潮的动态| 亚洲av成人精品一区久久| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲真实伦在线观看| 国产精品人妻久久久影院| videossex国产| 色av中文字幕| 日韩精品中文字幕看吧| 国产三级在线视频| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 一进一出抽搐动态| 午夜视频国产福利| 国产精品一区二区性色av| 丰满的人妻完整版| 一本久久中文字幕| 久久久a久久爽久久v久久| h日本视频在线播放| 成人三级黄色视频| 精品免费久久久久久久清纯| 99久国产av精品| 国产精品亚洲美女久久久| 神马国产精品三级电影在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 国产精品嫩草影院av在线观看| 乱码一卡2卡4卡精品| 国语自产精品视频在线第100页| 日韩欧美精品v在线| 91久久精品国产一区二区三区| 国产片特级美女逼逼视频| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 不卡一级毛片| 亚洲国产欧美人成| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成人综合一区亚洲| 国产精品综合久久久久久久免费| 日本精品一区二区三区蜜桃| 精品人妻熟女av久视频| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产精品福利在线免费观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产精品综合久久久久久久免费| 成人漫画全彩无遮挡| 午夜激情福利司机影院| 91在线观看av| 国产一区二区三区av在线 | 国产精华一区二区三区| 久久久a久久爽久久v久久| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 丰满的人妻完整版| 99久国产av精品国产电影| 久久久a久久爽久久v久久| 精品熟女少妇av免费看| 在线免费观看的www视频| 最近手机中文字幕大全| 乱码一卡2卡4卡精品| 熟女电影av网| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品一区www在线观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 日日啪夜夜撸| 日日摸夜夜添夜夜爱| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 看免费成人av毛片| 99久久精品热视频| 成人无遮挡网站| 国产av一区在线观看免费| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲av免费在线观看| 毛片女人毛片| 一级毛片aaaaaa免费看小| 两个人的视频大全免费| 91久久精品国产一区二区三区| 免费在线观看成人毛片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产精品,欧美在线| 日本一二三区视频观看| 精品久久久噜噜| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产高清视频在线观看网站| 韩国av在线不卡| 国产亚洲精品av在线| 亚洲乱码一区二区免费版| 观看美女的网站| 免费看日本二区| 日本熟妇午夜| 日韩精品有码人妻一区| 午夜免费激情av| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产爱豆传媒在线观看| 欧美一区二区亚洲| 99久国产av精品| 白带黄色成豆腐渣| 99热网站在线观看| 久久久国产成人免费| 美女被艹到高潮喷水动态| 大型黄色视频在线免费观看| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久久久久久久久久丰满| 中文亚洲av片在线观看爽| 国产成人91sexporn| 国产成年人精品一区二区| 日韩精品青青久久久久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 欧美日韩精品成人综合77777| 我的女老师完整版在线观看| 中国国产av一级| 亚洲成人久久爱视频| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| h日本视频在线播放| 国产精品福利在线免费观看| 国产黄a三级三级三级人| 91久久精品国产一区二区成人| 日本欧美国产在线视频| 国产亚洲欧美98| 真实男女啪啪啪动态图| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 12—13女人毛片做爰片一| 精品国产三级普通话版| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲精品影视一区二区三区av| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 一本精品99久久精品77| 久久久欧美国产精品| 身体一侧抽搐| 在线观看一区二区三区| 九九热线精品视视频播放| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美高清性xxxxhd video| 国产精品亚洲美女久久久| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲无线在线观看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 少妇裸体淫交视频免费看高清| 欧美中文日本在线观看视频| 成人特级黄色片久久久久久久| 99在线人妻在线中文字幕| 国产日本99.免费观看| 黄色配什么色好看| 国产精品免费一区二区三区在线| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产私拍福利视频在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 日日摸夜夜添夜夜添小说| 人人妻人人澡欧美一区二区| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产在线男女| 久久精品国产清高在天天线| 国产日本99.免费观看| 国产毛片a区久久久久| 亚洲av.av天堂| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 欧美激情久久久久久爽电影| 有码 亚洲区| 久久99热6这里只有精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 午夜精品国产一区二区电影 | 午夜福利18| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 真实男女啪啪啪动态图| 国产爱豆传媒在线观看| 精品人妻视频免费看| 99久久成人亚洲精品观看| 免费观看精品视频网站| 少妇熟女aⅴ在线视频| 寂寞人妻少妇视频99o| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 日韩大尺度精品在线看网址| 一级黄色大片毛片| 男人舔女人下体高潮全视频| 日本a在线网址| 欧美3d第一页| 国产精品不卡视频一区二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 十八禁网站免费在线| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 白带黄色成豆腐渣| 99久久精品热视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 看十八女毛片水多多多| 国国产精品蜜臀av免费| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日韩欧美 国产精品| 亚洲七黄色美女视频| 99热这里只有是精品50| 亚洲精品成人久久久久久| 男插女下体视频免费在线播放| 日韩在线高清观看一区二区三区| 99热只有精品国产| 午夜福利成人在线免费观看| 嫩草影视91久久| 色播亚洲综合网| 一级毛片aaaaaa免费看小| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 俺也久久电影网| 中文字幕av在线有码专区| 热99在线观看视频| 99热这里只有是精品在线观看| 国产视频一区二区在线看| a级毛片a级免费在线| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美日本亚洲视频在线播放| 1024手机看黄色片| 天天一区二区日本电影三级| a级毛片a级免费在线| 国产乱人偷精品视频| 日日啪夜夜撸| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国产真实伦视频高清在线观看| 最后的刺客免费高清国语| 国产亚洲精品av在线| 日日撸夜夜添| 男人狂女人下面高潮的视频| 1000部很黄的大片| 欧美成人一区二区免费高清观看| 日本熟妇午夜| 国产精品日韩av在线免费观看| 成年av动漫网址| 我的老师免费观看完整版| а√天堂www在线а√下载| 中文字幕久久专区| 一a级毛片在线观看| 乱系列少妇在线播放| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | av女优亚洲男人天堂| 久久精品国产亚洲网站| 99久久中文字幕三级久久日本| 久久午夜福利片| 99热这里只有精品一区| 欧美最新免费一区二区三区| 国产一区二区在线av高清观看| 午夜激情欧美在线| 91在线观看av| 亚洲精品成人久久久久久| 99国产精品一区二区蜜桃av| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 日本五十路高清| 久久综合国产亚洲精品| 精品久久久久久久久久免费视频| 日本五十路高清| 日韩高清综合在线| 免费一级毛片在线播放高清视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 美女 人体艺术 gogo| 久久久欧美国产精品| 日本与韩国留学比较| 偷拍熟女少妇极品色| 国产精品一区www在线观看| 国产精品野战在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 成人漫画全彩无遮挡| 成人二区视频| 中文资源天堂在线| 精品人妻视频免费看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 久久久a久久爽久久v久久| 老熟妇仑乱视频hdxx| 中文字幕熟女人妻在线| 女人被狂操c到高潮| 亚洲av二区三区四区| av免费在线看不卡| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美潮喷喷水| av免费在线看不卡| 亚洲图色成人| 国产高清激情床上av| 麻豆av噜噜一区二区三区| 成人av一区二区三区在线看| 日韩欧美精品免费久久| h日本视频在线播放| 我要搜黄色片| 色5月婷婷丁香| 亚洲熟妇熟女久久| 精品久久久噜噜| 色综合亚洲欧美另类图片| 国产v大片淫在线免费观看| 国产三级中文精品| av女优亚洲男人天堂| 中文亚洲av片在线观看爽| 日日摸夜夜添夜夜爱| av在线亚洲专区| 国产成人福利小说| 日韩大尺度精品在线看网址| 天堂动漫精品| 亚洲在线自拍视频| 国产精品久久久久久精品电影| 91精品国产九色| 婷婷精品国产亚洲av在线| 午夜精品在线福利| 国产成人精品久久久久久| 国产精品久久视频播放| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美一区二区亚洲| 国产伦在线观看视频一区| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 深爱激情五月婷婷| 国产黄色小视频在线观看| 国产v大片淫在线免费观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| АⅤ资源中文在线天堂| 热99re8久久精品国产| 国产成人freesex在线 | 日本三级黄在线观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | av在线天堂中文字幕| 亚洲av不卡在线观看| 欧美一区二区精品小视频在线| 性色avwww在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲无线在线观看| 97超碰精品成人国产| 亚洲内射少妇av| 国产精品一区二区免费欧美| 国产一区亚洲一区在线观看| 级片在线观看| 国产私拍福利视频在线观看| 观看免费一级毛片| 丰满人妻一区二区三区视频av| 欧美高清性xxxxhd video| av国产免费在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 在线免费十八禁| 国内精品美女久久久久久| 日本一二三区视频观看| 精品熟女少妇av免费看| 久久久色成人| 国产爱豆传媒在线观看| 51国产日韩欧美| 国产高清视频在线播放一区| 亚洲最大成人手机在线| 三级国产精品欧美在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 欧美三级亚洲精品| 亚洲四区av| 国产视频一区二区在线看| 一区二区三区免费毛片| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 熟女电影av网| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 久久久久国内视频| 国产午夜福利久久久久久| 日本一二三区视频观看| 身体一侧抽搐| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产爱豆传媒在线观看| 韩国av在线不卡| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美又色又爽又黄视频| 国产视频内射| 精华霜和精华液先用哪个| 久久久国产成人精品二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 麻豆av噜噜一区二区三区| 免费看a级黄色片| 国产日本99.免费观看| 国产男靠女视频免费网站| 夜夜夜夜夜久久久久| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产亚洲欧美98| 午夜福利18| 一级av片app| 亚洲欧美日韩无卡精品| 校园春色视频在线观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产极品精品免费视频能看的| 日韩高清综合在线| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲欧美日韩高清专用| 22中文网久久字幕| 国产亚洲欧美98| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 3wmmmm亚洲av在线观看| 亚洲不卡免费看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 高清毛片免费看| 国产精品av视频在线免费观看| 国产久久久一区二区三区| 12—13女人毛片做爰片一| 免费高清视频大片| 国产在线精品亚洲第一网站| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 99热精品在线国产| or卡值多少钱| 不卡视频在线观看欧美| 毛片一级片免费看久久久久| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲国产色片| 日日啪夜夜撸| 亚洲av不卡在线观看| 草草在线视频免费看| 亚洲第一电影网av| 亚洲18禁久久av| 免费一级毛片在线播放高清视频| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产精品乱码一区二三区的特点| 性插视频无遮挡在线免费观看| 国产视频一区二区在线看| 亚洲av免费高清在线观看| ponron亚洲| 韩国av在线不卡| 久久国产乱子免费精品| 亚洲国产精品国产精品| 久久精品影院6| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 在线观看美女被高潮喷水网站| 天天一区二区日本电影三级| 成人无遮挡网站| 国产成人精品久久久久久| 精品人妻熟女av久视频| 深夜a级毛片| 精品久久久久久成人av| 免费电影在线观看免费观看| 联通29元200g的流量卡| 亚洲最大成人av| 特级一级黄色大片| 国模一区二区三区四区视频| 国产高潮美女av| 秋霞在线观看毛片| 五月伊人婷婷丁香| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲国产精品成人综合色| 欧美日韩综合久久久久久| 男人和女人高潮做爰伦理| 欧美+亚洲+日韩+国产| 女人被狂操c到高潮| 成人国产麻豆网| 久久久a久久爽久久v久久| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 成人三级黄色视频| 午夜福利在线观看吧| 色哟哟哟哟哟哟| 99热全是精品| 精品人妻视频免费看| 欧美国产日韩亚洲一区| 欧美精品国产亚洲| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 欧美高清性xxxxhd video| 精品乱码久久久久久99久播| 日韩欧美在线乱码| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产精品久久久久久久电影| 一级黄片播放器| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲第一电影网av| 国产一区二区激情短视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 免费搜索国产男女视频| 国产成人精品久久久久久| 少妇熟女欧美另类| 一a级毛片在线观看| 国产高清三级在线| 嫩草影院精品99| 黄色一级大片看看| 老司机影院成人| 最好的美女福利视频网| 直男gayav资源| 欧美精品国产亚洲| 国产免费男女视频| 俺也久久电影网| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美极品一区二区三区四区| 国产高清视频在线观看网站| 伦精品一区二区三区| 97热精品久久久久久| 悠悠久久av| 欧美中文日本在线观看视频| 丰满人妻一区二区三区视频av| 赤兔流量卡办理| 99国产精品一区二区蜜桃av| 我的老师免费观看完整版| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产精品免费一区二区三区在线| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 一级毛片电影观看 | 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲av美国av| 亚洲性久久影院| 一级毛片我不卡| 波多野结衣高清无吗| 成熟少妇高潮喷水视频| 天堂√8在线中文| 国产伦在线观看视频一区| 午夜福利在线观看吧| 日本黄色视频三级网站网址| 给我免费播放毛片高清在线观看| 伦精品一区二区三区| 日韩欧美 国产精品| 国产精品一区www在线观看| 久久精品人妻少妇| 久久精品夜色国产| 亚洲精品在线观看二区| 干丝袜人妻中文字幕| 少妇人妻一区二区三区视频| 精品日产1卡2卡| 最新中文字幕久久久久| 色尼玛亚洲综合影院| 美女黄网站色视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 一级毛片电影观看 | 99热这里只有是精品50| 在线观看66精品国产| 我要看日韩黄色一级片| av在线播放精品| 亚洲图色成人| 国内揄拍国产精品人妻在线| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 亚洲美女黄片视频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 欧美日韩精品成人综合77777| 特大巨黑吊av在线直播| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲图色成人| 黑人高潮一二区| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久久久久国产a免费观看| 日韩成人伦理影院| 欧美在线一区亚洲| 亚洲专区国产一区二区| 99久国产av精品国产电影| 此物有八面人人有两片| 久久草成人影院| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产 一区 欧美 日韩| 国产男人的电影天堂91| 亚洲丝袜综合中文字幕| a级毛片免费高清观看在线播放| 日韩在线高清观看一区二区三区| 九九热线精品视视频播放| 亚洲,欧美,日韩| 男女视频在线观看网站免费| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲欧美清纯卡通| 又粗又爽又猛毛片免费看| 91精品国产九色| 香蕉av资源在线| 精品一区二区三区av网在线观看| 长腿黑丝高跟| 亚洲成av人片在线播放无| 露出奶头的视频| 搞女人的毛片| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产精品电影一区二区三区| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲三级黄色毛片| 丰满乱子伦码专区| 伦精品一区二区三区| 亚洲av一区综合| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 观看美女的网站| 亚洲国产精品合色在线| 免费av毛片视频| 亚洲在线观看片| 床上黄色一级片| 日本一本二区三区精品| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 日韩亚洲欧美综合| 最近2019中文字幕mv第一页| 精品熟女少妇av免费看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 在线免费观看不下载黄p国产| 欧美日韩综合久久久久久| 免费观看的影片在线观看| 身体一侧抽搐| 国产日本99.免费观看| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 一级av片app| 免费看a级黄色片| aaaaa片日本免费| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲美女搞黄在线观看 | 午夜激情欧美在线| 午夜影院日韩av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品久久久久久精品电影| 在线播放国产精品三级| 久久人人爽人人爽人人片va| av在线亚洲专区| 一区福利在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 国产一区亚洲一区在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 俄罗斯特黄特色一大片| 婷婷亚洲欧美| 精品一区二区三区视频在线| 午夜福利在线在线| 精品无人区乱码1区二区| 欧美bdsm另类| 国产在视频线在精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 成人永久免费在线观看视频| 最近中文字幕高清免费大全6| av在线亚洲专区| 我要搜黄色片| 99视频精品全部免费 在线| 给我免费播放毛片高清在线观看|