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    分子對接和光譜法研究原兒茶醛和阿魏酸與牛血清白蛋白的互作機(jī)理

    2021-07-28 08:34:18呂艷芳梁倩倩郭雨晴李學(xué)鵬劉欣欣勵建榮
    食品科學(xué) 2021年14期
    關(guān)鍵詞:鍵長內(nèi)源殘基

    呂艷芳,梁倩倩,郭雨晴,李學(xué)鵬,劉欣欣,沈 琳,勵建榮,

    (1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧 錦州 121013;2.上海交通大學(xué)分析測試中心,上海 200240;3.大連東霖食品股份有限公司,遼寧 大連 116007)

    多酚是指存在于植物體內(nèi)、化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含多個酚羥基的一類化合物的總稱。多酚類物質(zhì)是重要的功能性成分,具有抗氧化、抗菌和抗癌等多種功能,而這些功能可能是由于多酚與體內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等靶分子直接或間接相互作用所致[1]。目前,關(guān)于多酚的研究報道有很多,Chen Xiaowei等[2]研究了蘆丁對大豆蛋白界面性能和乳液穩(wěn)定性的影響。黃淵等[3]分別研究了白藜蘆醇、表沒食子兒茶素(epigallocatechin,EGC)和沒食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)對鰱魚肌球蛋白(silver carp myosin,SCM)空間結(jié)構(gòu)的影響。

    原兒茶醛(protocatechuic aldehyde,PCA)的結(jié)構(gòu)如圖1A所示,化學(xué)名稱為3,4-二羥基苯甲醛,多見于烏蕨、四季青和丹參的根葉部,具有多種生理活性。近年來,對于PCA的研究主要集中在醫(yī)藥領(lǐng)域。祝友文等[4]和高麗[5]分別研究發(fā)現(xiàn)PCA對環(huán)磷酰胺引起雄性小鼠的生殖損傷和順鉑介導(dǎo)的小鼠急性腎臟損傷具有保護(hù)作用。張寒等[6]發(fā)現(xiàn)PCA具有舒張血管的功能。另外,PCA也是合成其他香料和藥物的中間體[7]。PCA由于具有鄰二酚母核結(jié)構(gòu)而展現(xiàn)出顯著的抗氧化活性,Bountagkidou等[8]通過研究添加5 種天然多酚防腐劑的木桶裝紅酒的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)只有PCA在所有測定環(huán)境中均對紅酒表現(xiàn)出高抗氧化活性,因此有望將其用作食品抗氧化劑,但目前PCA在食品領(lǐng)域的研究及應(yīng)用都比較少,這可能與其作用機(jī)制不明有一定關(guān)系。

    圖1 PCA(A)、FA(B)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structures of PCA (A) and FA (B)

    阿魏酸(ferulic acid,F(xiàn)A)的結(jié)構(gòu)如圖1B所示,化學(xué)名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸,主要存在于麥麩等谷物和川芎等中草藥中。FA的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性良好,且毒性較低,又因其具有良好的藥理作用和生物活性,越來越多的國家開始將其用于食品、醫(yī)藥等各個領(lǐng)域。李黎云[9]發(fā)現(xiàn)在待宰育肥豬的日糧中添加FA,會增加豬肉產(chǎn)品的嫩度,且延長保質(zhì)期。魏延玲等[10]發(fā)現(xiàn),F(xiàn)A能夠抑制風(fēng)干鱸魚中N-二甲基亞硝胺的生成以及微生物的生長繁殖,并能有效清除鱸魚中殘留的亞硝酸鹽,從而降低人類患高血壓、癌癥等疾病的機(jī)率。饒文婷等[11]發(fā)現(xiàn)FA能夠調(diào)節(jié)腸道菌群。近年來,F(xiàn)A的多功能性使其成為食品添加劑領(lǐng)域的研究熱點[12],因此對其作為食品添加劑的安全性進(jìn)行評估至關(guān)重要,通過研究FA與生物大分子的相互作用,從而深入理解FA結(jié)構(gòu)變化對其毒理性質(zhì)和功能特性的影響,對新型天然食品添加劑的開發(fā)有重要的意義。

    人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是血液中的多功能轉(zhuǎn)運蛋白,能可逆結(jié)合小分子物質(zhì)并將其運送到人體需要的各個部位。牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)在序列和構(gòu)象上與HSA具有高度同源性和相似性,且價格相對比較便宜,因此被廣泛應(yīng)用于小分子物質(zhì)與血清蛋白的研究中[13]。隨著計算機(jī)模擬技術(shù)的迅速發(fā)展以及更多蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的解析,分子對接已經(jīng)成為研究小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的重要手段。Cheng Hao等[14]應(yīng)用光譜法結(jié)合分子對接技術(shù)對比研究了順式、反式白藜蘆醇與BSA的相互作用。Das等[15]應(yīng)用該技術(shù)研究了EGCG與牛血紅蛋白(hemoglobin,HGB)的相互作用。

    利用分子對接技術(shù)研究蛋白質(zhì)與多酚間的相互作用,并同光譜實驗的結(jié)論進(jìn)行分析、比較從而互相驗證、補(bǔ)充,進(jìn)而能夠從實驗和理論研究其相互作用。目前,關(guān)于PCA和FA與大分子相互作用的機(jī)理研究較少,并且在食品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍也較小,為使其在食品加工、貯藏保鮮等多個領(lǐng)域中像EGCG、茶多酚和白藜蘆醇等多酚一樣被廣泛應(yīng)用,本實驗應(yīng)用紫外光譜、熒光光譜、同步熒光光譜以及分子模擬技術(shù)綜合分析PCA和FA與BSA相互作用的機(jī)制,有助于在分子水平上了解其與蛋白質(zhì)的相互作用,最終為PCA和FA在食品領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    PCA、FA(純度≥99%) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;BSA(純度≥98%) 美國Sigma公司;磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉(均為分析純) 上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    MS105DU電子分析天平、FiveEasy Plus FE28 pH計瑞士梅特勒-托利多公司;KX-1990超聲波清洗儀 北京科璽有限公司;DK8D電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司;UV2550紫外-可見分光光度計 日本島津公司;FluoroMax-4熒光光度計 法國HORIBA公司。

    1.3 方法

    1.3.1 紫外光譜法測定PCA和FA與BSA的相互作用

    于7 支試管中分別移取質(zhì)量濃度2.5×10-3g/mL的BSA溶液0.5 mL和濃度為1.0×10-4mol/L的PCA、FA溶液分別0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL,最后用磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline,PBS)(0.067 mol/L,pH 7.4)稀釋,使多酚的終濃度分別為0、5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、30×10-6mol/L,BSA終質(zhì)量濃度為2.5×10-4g/mL,充分混勻后,于298 K靜置10 min,使用紫外分光光度計進(jìn)行光譜掃描200~800 nm的范圍,以濃度為0 mol/L的PCA、FA溶液作為對照。

    1.3.2 熒光光譜法測定PCA和FA與BSA的相互作用

    取3 組試管,每組8 支,分別加入質(zhì)量濃度為2.5×10-3g/mL的BSA溶液0.5 mL和1.0×10-4mol/L的PCA、FA溶液分別為0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mL,以PBS(0.067 mol/L,pH 7.4)定容,使多酚終濃度分別為0、5×10-6、10×10-6、15×10-6、20×10-6、25×10-6、30×10-6、35×10-6mol/L,BSA終質(zhì)量濃度為2.5×10-4g/mL,充分混勻后,將第1組混合溶液于298 K靜置10 min,第2組于310 K恒溫水浴10 min,第3組于320 K恒溫水浴10 min,使用熒光光度計進(jìn)行光譜掃描,在激發(fā)波長281 nm、狹縫寬度5 nm、掃描范圍280~450 nm的條件下檢測,并以PCA、FA濃度均為0 mol/L的溶液作為對照。

    1.3.3 熒光猝滅計算

    通過Stern-Volmer方程(1)計算猝滅常數(shù)的變化,以判斷PCA和FA對BSA的熒光猝滅類型;采用雙對數(shù)方程(2)計算PCA和FA分別與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點數(shù)n;使用熱力學(xué)方程(3)和(4)計算PCA和FA分別與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)[16]。

    式中:F0為對照組的熒光強(qiáng)度;F為PCA和FA濃度為Q時BSA的熒光強(qiáng)度;[Q]為PCA和FA的濃度/(mol/L);Ksv為動態(tài)猝滅常數(shù)/(L/mol),可由F0/F對[Q]的斜率求得;Kq為猝滅速率常數(shù)/(L/(mol·s));τ0為猝滅劑不存在時生物大分子的平均熒光壽命(約為10-8s);ΔG為自由能變/(kJ/mol);ΔH為焓變/(kJ/mol);ΔS為熵變/(J/(mol·K))。

    1.3.4 同步熒光光譜法測定PCA和FA與BSA的相互作用

    BSA和多酚溶液處理方法同1.3.1節(jié)所敘述的方式。以波長差(Δλ)分別為15 nm和60 nm、狹縫寬度:1 nm、掃描范圍:200~400 nm的條件進(jìn)行同步熒光檢測。

    1.3.5 分子對接

    從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb)搜索ID編號:“4F5S”的BSA晶體結(jié)構(gòu)并下載[17],利用PyMol軟件對BSA進(jìn)行去亞基、去水和刪除小分子配體等操作,并保存成PDB格式;從PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取PCA(CID:8768)和FA(CID:445858)的二維結(jié)構(gòu)[18],運用ChemDraw軟件對其進(jìn)行能量優(yōu)化并保存成PDB格式,然后利用AutoDock軟件對BSA、PCA和FA進(jìn)行加氫、計算電荷等前處理步驟后,保存成PDBQT格式,最后使用AutoDock-vina軟件進(jìn)行分子對接,對接結(jié)果采用Discovery Studio 2017 R2 Client、PyMol軟件進(jìn)行處理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PCA和FA與BSA相互作用的紫外光譜分析

    298 K時不同濃度的PCA和FA分別與BSA相互作用的紫外光譜結(jié)果如圖2所示,當(dāng)PCA和FA為0 mol/L時,BSA在276 nm波長處有一強(qiáng)吸收峰,這主要是由BSA的酪氨酸(tyrosine,Tyr)、色氨酸(tryptophan,Trp)殘基的苯環(huán)π→π*躍遷產(chǎn)生[19]。PCA和FA濃度在0~30×10-6mol/L的范圍時,隨著PCA和FA濃度的增加,BSA在276 nm波長處的吸收峰強(qiáng)度不斷增大,且波長從276 nm紅移至280 nm,說明PCA和FA的加入使BSA分子內(nèi)部的Trp、Tyr殘基裸露于水相中,疏水殘基間的疏水作用力減弱,從而與BSA形成復(fù)合物,導(dǎo)致BSA的共軛程度增強(qiáng),產(chǎn)生了新的π→π*躍遷,最終引起B(yǎng)SA紫外吸收強(qiáng)度增大,吸收峰紅移[20]。動態(tài)猝滅不引起蛋白質(zhì)吸收峰波長改變,而靜態(tài)猝滅則會導(dǎo)致吸收峰波長改變[21]。因此,初步判斷PCA和FA對BSA的猝滅過程均為靜態(tài)猝滅。

    圖2 298 K時PCA(A)、FA(B)與BSA相互作用的紫外吸收光譜Fig.2 UV absorption spectra of PCA-BSA (A) and FA-BSA (B)interactions at 298 K

    2.2 PCA和FA與BSA相互作用的熒光光譜分析

    298、310、320 K時,不同濃度的PCA與BSA相互作用的內(nèi)源熒光光譜如圖3所示,當(dāng)激發(fā)波長為281.0 nm時,BSA分別在347.0、349.0、345.0 nm波長處有1 個強(qiáng)熒光發(fā)射峰。Aprodu等[22]發(fā)現(xiàn),Trp的最大熒光發(fā)射波長(λem)在308.0~352.0 nm范圍內(nèi),而Tyr的最大熒光發(fā)射波長為304.0 nm,因此可以推斷BSA的內(nèi)源熒光主要來源于Trp殘基。由圖3、4可知,PCA和FA濃度在0~35×10-6mol/L時,隨著PCA和FA濃度的增加,3 種溫度下的BSA內(nèi)源熒光強(qiáng)度都呈下降趨勢,說明PCA和FA都可以與BSA結(jié)合,使其內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅。BSA的內(nèi)源熒光猝滅程度隨著FA、PCA各自濃度增加而加劇,且PCA對BSA的猝滅效果比FA更明顯,其可能是因為PCA和FA結(jié)合在BSA的Trp134殘基或Trp213殘基附近。沈亮亮[23]利用熒光光譜法研究苦丁茶中紫莖女貞苷A和紫莖女貞苷B與BSA的相互作用時發(fā)現(xiàn),紫莖女貞苷A對BSA內(nèi)源熒光的猝滅效果比紫莖女貞苷B更明顯,說明紫莖女貞苷A更接近BSA的Trp殘基。由此可以推測,PCA和FA分別與BSA作用時,PCA距離BSA的Trp134或Trp213殘基更近一些。如圖3所示,隨著PCA濃度的增大,BSA的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生明顯紅移,其在298 K時從347.0 nm紅移到366.5 nm;其在310 K時從349.0 nm紅移到366.5 nm;其在320 K時從345.0 nm紅移到367.0 nm。由圖4可知,隨著FA濃度的增大,BSA的最大熒光發(fā)射波長也發(fā)生明顯紅移,其在298 K時從347.0 nm紅移到351.0 nm;其在310 K時從349.0 nm紅移到350.0 nm;其在320 K時從345.0 nm紅移到349.0 nm,此結(jié)果說明PCA和FA的加入均會使BSA的Trp134或Trp213殘基周圍的極性增強(qiáng),疏水性減弱,表明Trp134殘基或Trp213殘基逐漸從BSA內(nèi)部的疏水環(huán)境中暴露出來、肽鏈逐漸伸展、發(fā)生去折疊現(xiàn)象[24],也說明PCA、FA對BSA的猝滅均可能是靜態(tài)猝滅。另外,比較BSA分別與PCA和FA結(jié)合后最大熒光發(fā)射波長的變化,可以發(fā)現(xiàn)BSA與PCA相互作用后的最大熒光發(fā)射波長紅移更明顯,這可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān),PCA的分子質(zhì)量低于FA的分子質(zhì)量,且PCA比FA多1 個酚羥基,所以極性更大的PCA可更大程度地增強(qiáng)Trp134殘基或Trp213殘基周圍的極性,使BSA的肽鏈更加伸展,從而更深入地插到BSA的疏水區(qū)域中[23]。

    圖3 不同溫度下PCA與BSA相互作用的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of PCA-BSA interactions at different temperatures

    圖4 不同溫度下FA與BSA相互作用的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of FA-BSA interactions at different temperatures

    2.3 熒光猝滅機(jī)理

    2.3.1 PCA和FA對BSA的熒光猝滅類型

    298、310、320 K時,PCA和FA與BSA相互作用的Stern-Volmer擬合結(jié)果如圖5所示,F(xiàn)0/F和[Q]之間存在良好的線性關(guān)系。PCA和FA與BSA相互作用的Ksv、Kq值如表1所示,隨著溫度從298 K升高到320 K,PCA與BSA相互作用的Ksv值從1.015×105L/mol減小到6.939×104L/mol,F(xiàn)A與BSA相互作用的Ksv值從4.863×104L/mol減小到3.430×104L/mol,而且在不同的溫度條件下,PCA和FA與BSA相互作用的Kq值均遠(yuǎn)大于最大動態(tài)猝滅速率2.0×1010L/(mol·s)[25],說明PCA和FA都分別與BSA形成了大分子復(fù)合物,且其均為靜態(tài)猝滅過程[17]。此外,在同一溫度下,PCA與BSA相互作用的Kq值均大于FA與BSA相互作用的Kq值,因此與FA相比,PCA對BSA的內(nèi)源熒光猝滅程度更大。

    圖5 不同溫度下PCA(A)和FA(B)與BSA相互作用的Stern-Volmer擬合圖Fig.5 Stern-Volmer plot of PCA-BSA (A) and FA-BSA (B)interactions at different temperatures

    表1 不同溫度下PCA和FA與BSA相互作用的猝滅常數(shù)Table 1Quenching constants for PCA-BSA and FA-BSA interactions at different temperatures

    2.3.2 PCA和FA與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)

    298、310、320 K時,PCA和FA與BSA相互作用的雙對數(shù)結(jié)果如圖6所示,PCA和FA與BSA相互作用的Ka、n值如表2所示,隨著溫度從298 K升高到320 K,PCA與BSA相互作用的Ka值從1.011×106L/mol減小到1.818×105L/mol,F(xiàn)A與BSA相互作用的Ka值從8.322×105L/mol減小到4.881×104L/mol,均達(dá)到104數(shù)量級,說明PCA和FA與BSA相互作用的熒光猝滅類型均以靜態(tài)猝滅為主、動態(tài)猝滅可忽略不計,進(jìn)一步說明PCA和FA均能與BSA形成穩(wěn)定的復(fù)合物[26],其與2.1、2.2、2.3.1節(jié)所得結(jié)論一致。不同溫度條件下,PCA和FA與BSA相互作用的n值均接近1.000,說明PCA和FA與BSA的結(jié)合比例約為1∶1。此外,溫度相同時,PCA與BSA相互作用的Ka值均大于FA與BSA的Ka值,說明PCA與BSA之間的結(jié)合力大于FA與BSA的結(jié)合力,這可能是因為PCA的極性強(qiáng)于FA的極性。楊淑玲等[27]研究發(fā)現(xiàn),在36~37 ℃時黃體酮(progesterone,PROG)與BSA相互作用的Ka值為1.423×104L/mol,推測PROG進(jìn)入人體后能與HSA較好地互作,從而被HSA運輸?shù)桨衅鞴佟?10 K時PCA、FA與BSA相互作用的Ka值分別為9.005×105、2.553×105L/mol,遠(yuǎn)大于104L/mol,因此也可推測,PCA和FA均能與HSA在人體環(huán)境中進(jìn)行較好地相互作用,且PCA比FA更容易被HSA貯存、運輸。

    圖6 不同溫度下PCA(A)和FA(B)與BSA相互作用的雙對數(shù)圖Fig.6 Double logarithmic plots for PCA-BSA (A) and FA-BSA (B)interactions at different temperatures

    表2 不同溫度下PCA和FA與BSA相互作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)Table 2Binding constants and binding site numbers for PCA-BSA and FA-BSA interactions at different temperatures

    2.3.3 PCA和FA與BSA相互作用的作用力類型

    PCA和FA與BSA相互作用的ΔG、ΔH、ΔS值如表3所示,在298、310、320 K共3 種不同溫度條件下,PCA和FA與BSA相互作用過程中的ΔG均小于0,說明PCA和FA與BSA的結(jié)合過程是自發(fā)進(jìn)行的。PCA與BSA相互作用的ΔS、ΔH值分別為-107.186 J/(mol·K)、-67.088 kJ/mol,F(xiàn)A與BSA相互作用的ΔS、ΔH值分別為-284.251 J/(mol·K)、-23.332 kJ/mol,其均小于0,說明PCA和FA與BSA相互作用過程中的主要作用力均為氫鍵和范德華力[28]。這與吳雨杭[29]研究染料木素、金雀花堿與BSA分別相互作用過程和黃朝波等[18]研究紅斑紅曲胺與BSA相互作用過程的作用力一致。

    表3 PCA和FA與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3Thermodynamic parameters for PCA-BSA and FA-BSA interactions

    2.4 PCA、FA與BSA相互作用的同步熒光光譜分析

    同步熒光常用來分析小分子物質(zhì)對蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響,Δλ1=15 nm和Δλ2=60 nm時,同步熒光光譜分別顯示蛋白質(zhì)中Tyr、Trp殘基的特征信息[30]。由圖7A、8A可知,隨著PCA和FA的加入,Tyr殘基的熒光發(fā)生略微藍(lán)移,說明PCA和FA會使Tyr殘基周圍的極性降低,疏水性增強(qiáng)[3];由圖7B、8B可知,隨著PCA的加入,Trp殘基的熒光基本未發(fā)生移動;而FA的加入,使Trp殘基的熒光發(fā)生略微紅移,說明FA使Trp殘基周圍的極性增加,疏水性減弱。由圖7、8可知,BSA中的Tyr、Trp殘基分別在303、346 nm處有最大特征吸收峰,Trp的熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)大于Tyr,其對應(yīng)關(guān)系約為10∶1,這主要是因為蛋白質(zhì)中熒光強(qiáng)度比約為Trp∶Tyr∶Phe=100∶9∶0.5[18]。隨著PCA和FA濃度的增加,Tyr和Trp的熒光均呈現(xiàn)降低趨勢,且Trp的熒光猝滅效率大于Tyr的熒光猝滅效率,結(jié)合2.2節(jié)得出的結(jié)論:加入PCA和FA導(dǎo)致BSA的內(nèi)源熒光紅移現(xiàn)象的發(fā)生,可以推斷PCA和FA導(dǎo)致BSA發(fā)生熒光猝滅的主要原因是Trp殘基的熒光發(fā)生了猝滅。庹潯等[31]研究發(fā)現(xiàn),小分子物質(zhì)與主要結(jié)合在BSA的IIA或IIIA結(jié)構(gòu)域中,IIA結(jié)合域含有Trp213、Tyr262殘基,IIIA結(jié)構(gòu)域含有Tyr400、Tyr410、Tyr451、Tyr496殘基。2.3.2節(jié)發(fā)現(xiàn),PCA和FA與BSA均只有1 個結(jié)合位點,結(jié)合同步熒光的結(jié)果,PCA和FA使BSA熒光發(fā)生猝滅的原因主要是導(dǎo)致Trp殘基的熒光發(fā)生猝滅,推測PCA和FA與BSA的結(jié)合位點可能在IIA結(jié)構(gòu)域的Trp213殘基附近。

    圖7 PCA與BSA相互作用的同步熒光光譜及λem的變化Fig.7 Synchronous fluorescence spectra of PCA-BSA interactions and λem shift

    圖9、10分別為PCA、FA與BSA相互作用的分子模擬結(jié)果圖,結(jié)合能量分別為-5.1、-6.3 kcal/mol。由圖9A可知,PCA與BSA形成了4 個常規(guī)氫鍵(O···H—X),其包括:PCA酚羥基的氫與Asp450的羧基氧形成氫鍵,鍵長為3.04 ?;PCA的2 個酚羥基氧與Ser343側(cè)鏈的羥基的氫分別形成2 個氫鍵,鍵長分別為4.31、4.32 ?;PCA醛基的氧與Trp213吲哚基上的氨基的氫形成氫鍵,鍵長為5.12 ?,這4 個氫鍵加強(qiáng)了相互作用過程中非共價結(jié)合的強(qiáng)度,穩(wěn)定了PCA與BSA復(fù)合物的空間構(gòu)象[32]。同時,PCA的苯環(huán)與BSA的疏水性氨基酸Val342的丙基側(cè)鏈形成了疏水鍵,鍵長為5.03 ?,有利于維持PCA和BSA作用部位的空間構(gòu)象。另外,PCA的苯環(huán)分別與Arg194帶正電荷的胍基和Asp450帶負(fù)電荷的羧基基于π-陽離子和π-陰離子作用而結(jié)合,鍵長分別為6.30、4.07 ?。此外,PCA與BSA的Leu197、Arg198、Ala341、Glu449、Ser453、Leu454殘基形成了范德華力,也對復(fù)合物的空間構(gòu)象有很大的支持作用。

    圖8 FA與BSA相互作用的同步熒光光譜及λem的變化Fig.8 Synchronous fluorescence spectra of FA-BSA interactions and λem shift

    圖9 PCA與BSA相互作用的分子對接圖Fig.9 Molecular docking diagram of PCA with BSA

    2.5 分子對接結(jié)果分析

    由圖9A、10A可知,PCA和FA主要靠氫鍵和范德華力與BSA結(jié)合,與2.3.3節(jié)所得結(jié)論一致。由圖9B、10B可知,PCA和FA在BSA上的最佳結(jié)合位點在IIA結(jié)合域和IIIA結(jié)合域之間,且距離IIA結(jié)合域更近,這與2.4節(jié)的推測一致。PCA和FA分別與Trp213靠氫鍵作用而結(jié)合,如圖9D、10D所示,其結(jié)合在Trp213及其周圍的疏水性殘基形成的疏水口袋中,此現(xiàn)象解釋了PCA和FA導(dǎo)致BSA內(nèi)源熒光發(fā)生猝滅的原因,進(jìn)一步驗證了光譜實驗的結(jié)論。另外,由圖9A、10A還可知,PCA比FA距離BSA的Trp213更近,其對應(yīng)關(guān)系為0.512 nm<0.518 nm,根據(jù)Forster[33]的非輻射能量轉(zhuǎn)移機(jī)理可知,雖然PCA和FA均可被BSA貯存、轉(zhuǎn)運,但PCA更容易被BSA貯存并運輸。

    圖10 FA與BSA相互作用的分子對接圖Fig.10 Molecular docking diagram of FA with BSA

    由圖10A可知,F(xiàn)A與BSA分子形成了4 個常規(guī)氫鍵(O···H—X)包括:FA的羧基氫與Val481的羧基氧形成氫鍵,鍵長為4.09 ?;FA的羧基氧分別與Arg483、Arg484的氨基氫形成氫鍵,鍵長分別為5.32、4.89 ?;FA的羰基氧與Arg484的氨基氫形成氫鍵,鍵長為5.12 ?。同時,F(xiàn)A酚羥基上電負(fù)性的氧與Trp213吲哚基上的雙鍵碳形成了碳?xì)滏I(O···CH2=CH2),鍵長為5.18 ?。4 個氫鍵對維持FA與BSA形成復(fù)合物的穩(wěn)定起關(guān)鍵作用。另外,F(xiàn)A的苯環(huán)分別與BSA的疏水性氨基酸Leu197、Leu346、Leu480、Val481的烴基側(cè)鏈形成了4 個疏水鍵,鍵長分別為6.69、6.39、5.05、4.80 ?,其減少了疏水性氨基酸與水的作用,有助于維護(hù)FA與BSA形成復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)。此外,F(xiàn)A與BSA的Ser201、Val342、Ser343、Arg347、Ser453、Leu456、Asn482、Pro485殘基形成了范德華力。

    3 結(jié) 論

    實驗利用光譜法和分子對接技術(shù)研究了PCA和FA分別與BSA的相互作用。紫外光譜發(fā)現(xiàn),298 K時PCA和FA均會導(dǎo)致BSA的特征吸收峰強(qiáng)度和波長發(fā)生改變。熒光光譜的研究表明PCA和FA均會導(dǎo)致BSA的內(nèi)源熒光發(fā)生靜態(tài)猝滅,λem紅移,且PCA對BSA的作用更明顯;PCA和FA在BSA上均只有1 個結(jié)合位點,且PCA與BSA之間的結(jié)合能力強(qiáng)于FA與BSA的結(jié)合;由于ΔG、ΔS、ΔH值均小于0,所以PCA和FA主要靠氫鍵和范德華力與BSA形成穩(wěn)定復(fù)合物,且此過程自發(fā)進(jìn)行。同步熒光光譜的結(jié)果說明,PCA和FA的加入均會影響B(tài)SA的Tyr殘基或Trp殘基的微環(huán)境,并導(dǎo)致Tyr和Trp的熒光發(fā)生猝滅,且Trp的熒光猝滅效率大于Tyr的熒光猝滅效率。分子對接進(jìn)一步驗證了光譜實驗的結(jié)果,并發(fā)現(xiàn)PCA、FA在BSA上的最佳結(jié)合位點在IIA、IIIA結(jié)合域之間的疏水空腔中,且距離IIA結(jié)合域更近,同時因為PCA比FA距離BSA的Trp213更近,其對應(yīng)關(guān)系為0.512 nm<0.518 nm,由此推測PCA更容易被BSA貯存運輸。

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