應用傅里葉紅外光譜對干燥綜合癥伴齲齒患者口腔特征微生物的初步鑒別

周爽 蔡葉 袁志瑤 王旻

人體口腔內(nèi)存在數(shù)以億計的微生物，這些寄居在口腔各個部位的微生物，其組成和結(jié)構變化與口腔健康和疾病息息相關?？谇粌?nèi)微生物群落的變化，會引發(fā)許多口腔疾病，如齲齒、牙周病、牙髓炎、念珠菌感染、種植體感染及正畸體周圍炎等［1］。因此，檢測并判斷口腔內(nèi)微生物組成和群落的變化尤為重要。傅里葉紅外變換光譜（FT-IR）技術具有靈敏度高、操作方便快捷、采樣量少等優(yōu)點，可以很好地應用于口腔特征微生物的研究，該方法還有一個重要的特征是不必對樣品進行化學處理，只須對微生物進行簡單的干燥壓片，檢測過程簡單且無損。本文應用傅里葉紅外變換光譜法（FT-IR）結(jié)合統(tǒng)計學對口腔內(nèi)特征微生物進行研究。目前，傅里葉紅外光譜應用于臨床醫(yī)學細菌和真菌的鑒別國內(nèi)已有報道［2］。

干燥綜合征（Sj?gren syndrome，SS）是自身免疫性疾病，又稱外分泌腺上皮細胞炎，自身免疫細胞對淚腺、唾液腺等外分泌腺體的進行性破壞導致患者主要表現(xiàn)眼干、口干、皮膚干燥等癥狀，并引起機體其它器官受累，甚至影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)［3］。目前干燥綜合征的發(fā)病機制和病理機制仍不明確，患者在患病初期常常被誤診，從而耽誤治療，目前干燥綜合癥無法根治，患者極其痛苦。由于干燥綜合癥患者口腔唾液分泌量降低，唾液的潤滑和抗菌作用減少使得口腔內(nèi)微生物群落發(fā)生明顯改變，臨床上SS患者較正常人群更易患牙齦炎、牙周炎、猖獗齲等微生物感染性疾?。?］。

鑒于干燥綜合癥患者對猖獗性齲的易感性以及林場的難治性，很多醫(yī)藥領域?qū)W者都投入了相當多的關注，本文選取 5株特征菌株作為對照菌［5－10］，采用傅里葉紅外變換光譜對原發(fā)性干燥綜合癥伴有齲齒患者口腔微生物進行聚類鑒別，為今后椅旁快速檢測干燥綜合癥猖獗性齲患者口腔內(nèi)微生物提供一種簡便快捷的操作方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

數(shù)顯恒溫培養(yǎng)箱BluePard（上海一恒科技有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱RW-30（上海精宏實驗設備有限公司）；TENSOR-27-HTS-XT傅立葉紅外微生物測量系統(tǒng)、微生物FT-IR圖譜測量專用的B-module附件、DTGS檢測器、ZnSe載樣窗片、電動接種環(huán)、OPUS6.5分析軟件（Bruke公司，德國）；超純水儀（Milipore公司，美國）。

1.2 培養(yǎng)基

PYG液體培養(yǎng)基基礎；氯化血紅素；微生物K1；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（tryptic soy broth medium，TSB）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy agar culture medi-um，TSA）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（sabouraud dextrose broth，SDB）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（sabouraud dex-troseagar culture medium，SDA）；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基；乳酸桿菌選擇性瓊脂；輕唾桿菌肽瓊脂（mitis sali-varius bacitracinagar culture medium，MSBA）培養(yǎng)基；MRS瓊脂培養(yǎng)基；巧克力平板培養(yǎng)基；念珠菌顯色培養(yǎng)基；莫匹羅星鋰鹽。

1.3 標準菌株

白色念珠菌 （Candida albicans）［CMCC（F）98001］；發(fā)酵 乳 桿 菌 （Lactobacillus fermentum）；［ATCC 11739］；變異鏈球菌 （Streptococcu mutans Clarke）［ATCC 25175］；干燥奈瑟菌（Neisseia sicca）［ATCC 9913］；短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）［ATCC 15700］。以上菌種由中國醫(yī)學細菌管理保藏中心和中國微生物菌種保藏中心提供，實驗中均使用第3代。

1.4 待測菌株

納入2017年6～12月于南京市鼓樓醫(yī)院風濕免疫科就診的伴有齲齒SS患者20例，患者均簽署知情同意書。SS的臨床診斷依據(jù)是美國風濕病學會（ACR）于 2012年提出的［11］：RF（＋）伴 ANA＞1：320，血清SSA和/或SSB抗體（＋），角結(jié)膜染色評分＞/＝3分，唇腺病理活檢示淋巴細胞灶≥1個/4 mm2，患者均符合上述標準中的2項。20例SS患者系經(jīng)問卷調(diào)查及臨床檢查后確診，均為女性，年齡45～55歲，首次確診SS，患者自覺眼干，口干后發(fā)現(xiàn)口內(nèi)多顆牙變色、缺損，伴冷刺激敏感，無治療史，病程6個月以上，無其他系統(tǒng)性疾病，如糖尿病、肝炎、結(jié)核等?；颊呖谇粯颖静杉埃瑖陲嬘盟?，并于取樣前30 min內(nèi)禁止飲食、吸煙、咀嚼口香糖等［12］。采用無菌棉簽刮拭患者齦上近齦緣處菌斑［13－14］，將棉簽立即置于無菌10 mL生理鹽水中，4℃冰箱保存，12 h內(nèi)轉(zhuǎn)種。

1.5 實驗方法

1.5.1 標準菌株的純培養(yǎng) 5株標準菌株凍干菌粉經(jīng)過復溶、轉(zhuǎn)種復舒后均采用第3代菌種。根據(jù)菌株不同的生長條件選擇適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，白念接種于平板培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24 h；變異鏈球菌和干燥奈瑟菌于TSA平皿上35℃培養(yǎng)24 h；發(fā)酵乳桿菌于MRS瓊脂平皿中35℃厭氧培養(yǎng)48～72 h；短雙歧桿菌接種于莫匹羅星鋰鹽改良的MRS瓊脂平皿上，35℃厭氧培養(yǎng)48～72 h。

1.5.2 待測菌株的純培養(yǎng) 分別取20例pSS患者唾液樣本各1 mL接種于TSB、SDB、PYG液體培養(yǎng)基和乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基中，將TSB和SDB置于35℃，培養(yǎng)24 h，PYG液體培養(yǎng)基和乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基置于35℃厭氧培養(yǎng)72 h。TSB培養(yǎng)物分別劃線于MSBA瓊脂平板和巧克力瓊脂平板上，35℃培養(yǎng)24 h；SDB培養(yǎng)物劃線于SDA瓊脂平板和念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，35℃培養(yǎng)24 h；PYG培養(yǎng)物劃線接種于莫匹羅星鋰鹽改良MRS瓊脂平板上，35℃厭氧培養(yǎng)24 h；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)物接種于乳酸桿菌選擇性瓊脂平板上，35℃厭氧培養(yǎng)24 h。

挑取各分離平板上生長的疑似菌落，20例SS患者唾液樣本共分離培養(yǎng)出9株白色念珠菌疑似菌，12株發(fā)酵乳桿菌疑似菌，9株變異鏈球菌疑似菌，1株干燥奈瑟菌疑似菌，9株短雙歧桿菌疑似菌。挑取典型菌落接種于相應的斜面培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)。

1.5.3 樣品制備 20例pSS患者口腔的提取樣本經(jīng)過增菌、分離培養(yǎng)后，于相應的平板培養(yǎng)基上35℃需氧或厭氧培養(yǎng)24 h，標準菌株劃線接種于相應的平板培養(yǎng)基中35℃需氧或厭氧培養(yǎng)24 h。采用校準過的電動鉑金接種環(huán)，從斜面培養(yǎng)基上挑取1～2環(huán)菌苔，置于100μL超純水中制成均勻的菌懸液，取15μL置于ZnSe載樣窗口上，于35℃恒溫干燥培養(yǎng)箱中干燥，直至成透明的菌膜。

1.5.4 傅立葉紅外變換光譜的采集 載有樣品的ZnSe充分干燥后置于樣品倉中，測定傅里葉紅外吸收光譜，光譜范圍選擇：3 000～9 00 cm－1，光譜分辨率為4 cm－1，自動平滑處理。光譜掃描時扣除噪聲、CO2和H2O的干擾。

1.5.5 傅里葉紅外圖譜的處理和分析 按照FT-IR光譜采集SOP的要求，對待測菌株和標準菌株在相應的相同條件下培養(yǎng)后，進行光譜采集，每株菌采集3張圖譜，最終取平均得到平均圖譜。不同種類的微生物的FT-IR圖是不同的，真菌的特征區(qū)域光譜范圍根據(jù)各個生物大分子紅外特征譜對于真菌分類的貢獻大小，選定 1 800～1 485、1 485～1 185、1 185～900 cm－1（蛋白質(zhì)、脂類，磷酸鹽化合物、和多糖），細菌的分類主要體現(xiàn)在細胞壁多聚糖，細胞質(zhì)中蛋白質(zhì)、類脂和細胞膜脂肪酸的吸收上，選擇1 200～900、1 500～1 400、3 000～2 800 cm－13個譜段進行為光譜分析靈敏區(qū)，用于分類和聚類分析［15－16］。

采用聚類分析法對圖譜進行分析，OPUS 6.5分析軟件對圖譜進行歸一化和一階導數(shù)處理，并進行極限校準，透光率轉(zhuǎn)化，采用離差平方和法（Ward＇s）計算距離，距離越近，兩株菌具有相似性越高［17］。

將上述各菌的3 000～900 cm－1波數(shù)的圖譜進行聚類分析，得到試驗菌和標準菌的聚類分析樹形圖。

2 結(jié) 果

將標準菌株白色念珠菌、發(fā)酵乳桿菌、變異鏈球菌、干燥奈瑟菌和短雙歧桿菌5株標準菌株按照SOP的要求培養(yǎng)后，每株菌采集3張圖譜，剔出掉溢出光譜，從圖1可見（紅色、綠色、紫色、深藍、淺藍分別代表白念、干燥奈瑟菌、短雙歧桿菌、發(fā)酵乳桿菌和變異鏈球菌標準菌的FT-IR紅外吸收圖譜），它們的傅里葉紅外圖譜各不一樣。將5株菌的FT-IR圖譜經(jīng)過矢量歸一化，一階求導后，特定譜段進行聚類分析，得到樹形圖（圖2），5株菌的差異距離都比較大。

圖1 5株標準菌的傅里葉紅外光譜圖Fig 1 FTIR spectrum of 5 standard bacteria

圖2 5株菌的傅里葉紅外光譜聚類分析距離Fig 2 Cluster analysis distance of 5 strains by FTIR

將患者口腔分離出來的白色念珠菌疑似菌、變異鏈球菌疑似菌、發(fā)酵乳桿菌疑似菌、干燥奈瑟菌疑似菌和短雙歧桿菌疑似菌分別與標準菌株進行比對，紅外圖譜經(jīng)過矢量歸一化，一階求導后進行聚類分析，結(jié)果見圖3～7。

圖3 9株白念疑似菌與白念標準菌聚類分析結(jié)果Fig 3 Cluster analysis results of 9 suspected and standard Candida albicans

圖4 9株變鏈疑似菌與變鏈標準菌聚類分析結(jié)果Fig 4 Cluster analysis results of 9 suspected and standard Streptococcus mutans

圖5 12株發(fā)酵乳桿菌疑似菌與標準菌株聚類分析結(jié)果Fig 5 Cluster analysis results of 12 suspected and standard strains of Lactobacillus fermentans

圖6 干燥奈瑟菌疑似菌與標準菌株聚類分析結(jié)果Fig 6 Cluster analysis results of suspected and standard strains of Neisseria sicca

圖7 短雙歧桿菌疑似菌與標準菌株 聚類分析結(jié)果 Fig 7 Cluster analysis results of suspected and standard Bifidobacterium brevis

3 討 論

SS患者最重要的臨床表現(xiàn)是唾液腺受損，唾液減少，因此唾液的潤滑、清潔和抗菌作用減弱或消失，正常口腔環(huán)境的改變使得口腔內(nèi)菌群失調(diào)，某些條件致病菌轉(zhuǎn)化為致病菌，引起口腔感染性疾病。本實驗選擇的是五株臨床較為常見的菌株，本研究認為在口腔環(huán)境改變下，這些條件致病菌可能轉(zhuǎn)化為致病菌，造成SS患者口腔菌群失調(diào)，并與猖獗齲、黏膜炎癥等疾病存在相關性。

從SS患者口腔中分離到的疑似菌中，發(fā)酵乳桿菌、變異鏈球菌和白色念珠菌的比例最高，在與標準菌株進行聚類分析之后，變異鏈球菌和白色念珠菌分別有4株和2株與標準菌聚為一類，在選擇性平板上疑似菌生長的大小、顏色形態(tài)和生理特征都與標準菌株相似，因此可以推斷，這些疑似菌可能與標準菌株屬于同一屬，在種水平上存在差異。發(fā)酵乳桿菌、變異鏈球菌和白色念珠菌的檢出率高，我們推測，與干燥綜合癥患者易發(fā)齲病有一定的關系。

這5株標準菌株與20例SS伴齲齒患者口腔提取物進行紅外光譜比對，能夠快速的鑒別出患者口腔內(nèi)是否含有目標菌株，對臨床微生物的快速鑒別有一定的指導意義。

傅里葉紅外變換光譜技術作為一個全細胞紅外圖譜信息，能夠快速的鑒定菌株的類別，對于臨床疾病臨床快速檢測具有一定的意義，它利用不同種微生物之間蛋白質(zhì)、磷脂、多糖等結(jié)構紅外吸收的不同，光譜存在差異，以此對微生物進行鑒別。光譜的差異性主要表現(xiàn)在吸收峰的位置、強度和峰形上。它的優(yōu)點是操作簡便，成本低，時間短。其局限性在于，利用微生物中所含物質(zhì)的不同來判別光譜的差異性，會受到微生物生長階段、生長環(huán)境等不同因素的影響，影響結(jié)果判斷；另外微生物的鑒別受到對照菌選擇的限制，在今后的研究中，將進一步收集病例，擴大樣本量，不斷地增加傅里葉紅外光譜菌庫范圍，有望實現(xiàn)臨床致病微生物的快速鑒別。