鍶、鈷共摻雜納米管種植體對骨質疏松大鼠骨結合的影響

楊瑤瑤 袁文紅 張倩倩 宋宇 曲雅馨 于艷玲

種植義齒因其良好的功能及美學效果被認為是缺牙患者的首選修復方式。盡管種植手術取得了長足的發(fā)展，但在一些特殊人群如骨質疏松患者中表現(xiàn)欠佳，骨質疏松患者骨小梁和骨密度較低，極易導致種植失敗［1］，如何提高骨質疏松患者種植修復效果是口腔醫(yī)學領域面臨的難題。

種植體表面形貌處理改善骨結合效果是一種很有潛力的方法。大量文獻表明將鈦植體表面處理成TiO2納米管形貌能夠提高蛋白和細胞的粘附從而更好地促進骨結合［2］。有學者提出納米管管狀結構可作為一種優(yōu)良的載體，遞送離子、藥物等［3－4］促進骨結合。鍶 （Sr）元素已被證明具有促進新骨形成和抑制破骨吸收的雙重作用，廣泛應用于骨質疏松癥的臨床治療［5］。鈷 （Co）元素能夠穩(wěn)定缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）并激活靶基因VEGF模擬體外低氧環(huán)境來增強血管生成［6］，本實驗將種植體表面處理成納米管結構，水熱法分別加載鍶、鈷元素，構建5種不同形貌，即光滑組（smooth titanium，ST）、納米組（nano titanium，NT）、納米鍶組（nano titanium-strontium，NT-Sr）、納米鈷組（nano titaium-cobalt，NT-Co）、納米鍶鈷組（nano titanium-strontium-cobalt，NT-Sr-Co），探究將具有促進成骨作用和促進血管新生作用的兩種元素結合能否更好地促進骨質疏松大鼠的骨結合。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

3月齡雌性SD大鼠（濟南朋悅實驗動物繁育有限公司）；99.99%純鈦鈦片、純鈦種植體（東莞市升躍精密五金制品有限公司）；氯化鍶、氯化鈷（阿拉丁，美國）；馬弗爐（天津市中環(huán)實驗電爐有限公司）；場發(fā)射掃描電鏡（ZEISS Sigma 300，德國）；X射線光電子能譜儀（ThermoFisher，美國）；micro-CT（μCT-100，德國）；EXAKT 300 CP/400CS/AW 硬組織切磨系統(tǒng)（EXAKT，德國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同形貌材料的制備及觀察 直徑14 mm×1 mm的圓形鈦片逐級拋光、超聲清洗后置于1.25 wt%的氫氟酸溶液中20 V電壓下陽極氧化1 h制備TiO2納米管形貌，經(jīng)馬弗爐400℃、2 h退火處理，配置0.02 mol/L的 Sr溶液和0.001 mol/L的 Co溶液于200℃、4 h條件下進行水熱反應，構建5組形貌：ST組，NT組，NT-Sr組，NT-Co組，NT-Sr-Co組，分別采用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察和 X射線光電子能譜儀（XPS）分析。

1.2.2 動物模型的建立 實驗選取35只3月齡SD大鼠（180±15）g，遵照青島市口腔醫(yī)院中心實驗室管理規(guī)定置于無菌動物房中飼養(yǎng)，大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為實驗組（30只）和對照組（5只），實驗組采用雙側卵巢摘除術（OVX）建立骨質疏松模型，對照組即假手術組僅打開腹腔摘除部分脂肪。3個月后進行微計算機斷層掃描技術（micro-CT）檢測骨質疏松模型是否構建成功。

1.2.3 動物實驗 模型大鼠隨機分為5組，每組6只。將直徑2 mm×4 mm的純鈦種植體按相同工藝制備成5組不同形貌，無菌操作下分別植入5組大鼠雙側股骨干骺端，每側股骨植入1顆種植體，每只大鼠植入同種種植體。術后3 d連續(xù)肌注抗生素。4周后對大鼠實行安樂死，切取含有種植體的股骨，浸于4%多聚甲醛中備用。

1.2.4 micro-CT掃描 μCT-100顯微 CT以種植體為軸心，向周圍骨展開約2 mm進行掃描和三維重建。掃描參數(shù)為：電壓70 kV，電流200μA，分辨率14.8 μm，曝光時間：300 ms，對骨體積分數(shù)（BV/TV）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁數(shù)目（Tb.N）、骨小梁間隙（Tb.Sp）進行定量分析。

1.2.5 甲苯胺藍染色 EXAKT 300 CP/400CS/AW硬組織切磨系統(tǒng)制備約50μm厚不脫鈣種植體－骨組織磨片，甲苯胺藍染色后中性樹脂封片。光學顯微鏡下采集圖像并測量計算骨接觸率（bone implant contact，BIC）。

2 結 果

2.1 材料學表征觀察

SEM：ST組表面接近平坦，可見少量微坑狀拋光劃痕；NT組則呈現(xiàn)蜂窩狀、管壁均勻，規(guī)則一致的納米管結構，管徑約為80～85 nm左右（圖1）。

圖1 ST組和NT組掃描電鏡圖Fig 1 SEM images of ST group and NT group

XPS：各組Ti和O光譜均對應經(jīng)典峰值（圖2）。NT-Sr組除顯示Ti和O外，還包含Sr的峰值，結合能為133.34 eV；NT-Co組出現(xiàn)了Co的特征峰，結合能為780.13 eV；NT-Sr-Co組則同時擁有Sr和Co兩個特征峰，表明水熱反應成功負載Sr和Co元素。

圖2 NT-Sr組、NT-Co組、NT-Sr-Co組表面元素能譜圖Fig 2 Surface element energy spectra of NT-Sr group，NT-Co group and NT-Sr-Co group

2.2 micro-CT掃描骨質疏松動物模型

圖3為OVX組和假手術組大鼠股骨的micro-CT剖面圖，OVX組骨密度明顯降低，說明骨質疏松動物模型構建成功，可進行下一步實驗。

圖3 OVX術后2組股骨剖面圖Fig 3 Section view of femurs in 2 groups after OVX

2.3 micro-CT掃描種植體－骨組織

4周后種植體周圍三維重建圖見圖4，NT-Sr組、NT-Co組、NT-Sr-Co組3組間定量分析結果見圖 5，NT-Sr組和NT-Sr-Co組以及NT-Co組和NT-Sr-Co組間均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而 NT-Sr組和 NTCo組之間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

圖4 4周后種植體周圍新生骨情況（micro-CT）Fig 4 New bone formation around the implant4 weeks after implantation（micro-CT）

圖5 5組骨組織參數(shù)Fig 5 Bone tissue parameters of the 5 groups

2.4 組織學觀察

光鏡下可以清晰地觀察到4周時種植體明顯被新生骨包圍，在磨片上顯示為深藍色，黑色部分為種植體（圖 6）。選擇感興趣區(qū)域（region of interest，ROI）計算種植體骨結合率（BIC%），NT組顯著高于ST組（P＜0.01），NT-Sr組顯著高于 NT組（P＜0.01），NT-Co組高于NT組（P＜0.05），NT-Sr-Co組顯著高于 NT-Sr組和NT-Co組（P＜0.01），而NT-Sr組與NT-Co組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

2.5 統(tǒng)計分析

使用 Graphpad 8.0繪圖軟件，對不同分組間進行單因素方差分析，同一組間進行多重比較，P＜0.05時認為有差異；P＜0.01時認為有顯著性差異。

3 討 論

骨質疏松癥是一種影響數(shù)百萬人的代謝性疾病，患有骨質疏松患者的種植成功率明顯降低，鈦植體的表面形貌能夠顯著影響成骨細胞的粘附，增殖和分化［7］。若能通過種植體表面處理提高骨結合能力則是一種很有前途的方法。TiO2納米管結構因能明顯改善骨結合效果和具有載體功能成為近幾年的研究熱點［8］。先前的研究證明，鍶（Sr）具有促進骨骼形成和減少骨吸收的雙重作用［9］，鈷（Co）具有促進血管新生的作用［10］，但鈷離子過量摻入會導致細胞毒性［11］。因此本研究嘗試通過陽極氧化法和水熱反應法制備一種新型多功能的Sr、Co共摻雜納米管種植體，評估兩者結合對骨質疏松大鼠骨結合的影響。

通過動物實驗本研究發(fā)現(xiàn)4周后5組中NT-Sr-Co組骨結合率最高，說明新制備的載鍶、鈷納米管種植體有效改善了骨質疏松大鼠的骨整合效果。各項定量分析數(shù)據(jù)也支持這種變化。骨體積分數(shù)（BV/TV）是反映骨骼重塑的最重要的參數(shù)，NT-Sr-Co組的骨體積分數(shù)相對于光滑組組增加了約1.9倍，說明NT-Sr-Co組的骨量增加了約1.9倍；BV/TV的顯著性差異還被發(fā)現(xiàn)在NT-Sr-Co組和NT-Co組之間（P＜0.01），說明Sr能夠明顯改善種植體骨結合。4周后甲苯胺藍染色實驗發(fā)現(xiàn)種植體周圍均為新生骨小梁包繞，骨質連續(xù)且與基骨之間分界明顯。圖7結果顯示與ST組比較，NT組骨結合率顯著升高（P＜0.01），說明將種植體表面處理成TiO2納米管結構能夠改善骨整合，與Lavenus等［12］研究結果一致。與NT組相比，NT-Sr組骨結合率顯著提高（P＜0.01），說明Sr元素的加入能夠明顯增強骨質疏松大鼠的骨結合，文臣娟等［13］將鍶摻入透鈣磷石中，發(fā)現(xiàn)對MC3T3-E1細胞成骨功能有促進作用。Liang等［14］將鍶元素加載到鈦植體表面，也證明了鍶元素能夠明顯促進骨整合，NT-Co組與NT組也具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），說明Co元素的摻雜相比未摻雜組NT組也改善了骨結合率，但作用力不如Sr元素明顯，可能原因是Co元素僅在促進血管生成方面發(fā)揮作用，但對成骨細胞的作用不那么明顯，具體機制我們還在探究中。但有文獻報道Co除了誘導血管生成外，也表現(xiàn)出了成骨刺激作用［15－17］，而NT-Sr-Co組相比 NT組具有顯著性差異（P＜0.01），說明Sr和Co元素的單獨摻雜都能促進骨結合，Sr摻雜能夠導致更好的骨形成，Co的改善作用遠小于Sr，但當Sr、Co共摻雜時即可發(fā)揮良好的生物功能，可能是Co元素產(chǎn)生了協(xié)同作用，致使NT-Sr-Co組的骨結合率在5組中是最高的。

圖7 5組BIC統(tǒng)計圖Fig 7 BIC statistics of the 5 groups

綜上所述，與傳統(tǒng)的光滑Ti相比，TiO2納米管結構能夠促進骨結合，Sr元素能夠明顯改善種植體周圍骨結合，Co元素也能在一定程度上改善骨結合，但效果不如Sr明顯。本實驗構建的NT-Sr-Co種植體通過動物實驗證明誘導了更多的新骨生成和更緊密的骨結合，為需要種植手術的骨質疏松患者提供了一種新策略，具有巨大的牙科和骨科應用潛力。