BMP-2對(duì)BMSCs放射損傷的保護(hù)作用及機(jī)制的初步研究

唐子豪 宗春琳 張維文 趙路 田磊 李德超

大約75%頭頸癌患者需行放射治療［1］，在頭頸部放療并發(fā)癥中，放射性頜骨骨壞死（ORNJ）是最難治的遠(yuǎn)期并發(fā)癥之一。ORNJ可導(dǎo)致皮膚和黏膜潰爛、死骨暴露等，給患者帶來巨大痛苦。目前ORNJ發(fā)病機(jī)制不清、仍缺乏有效的預(yù)防及治療方法。針對(duì)ORNJ發(fā)病機(jī)制，尋找有效的預(yù)防及治療方法，具有重要意義。

自2004年Delanian等［2］提出放射誘導(dǎo)組織萎縮觀點(diǎn)后，近些年來，越來越多學(xué)者認(rèn)同ORNJ是一種放射誘導(dǎo)的纖維化疾病［3］。大量文獻(xiàn)及本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，放療后頜骨局部骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）受損，導(dǎo)致其成骨分化能力下降，并出現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞（MFB）表型、向成纖維化方向分化，這有可能是導(dǎo)致ORNJ的重要發(fā)病機(jī)制之一［4－6］。

BMP-2的成骨能力得到廣泛公認(rèn)［7］，放射線可抑制BMP-2的表達(dá)［8］，外源性使用BMP-2可增強(qiáng)放射性頜骨骨壞死的成骨能力［9］。在胰腺等其他器官纖維化疾病的研究中，發(fā)現(xiàn)BMP-2有減輕纖維化的作用并且這一作用可能與抑制TGFβ1/Smads通路的表達(dá)有關(guān)［10］，但是在 ORNJ中，BMP-2是否可以抑制放射損傷后BMSCs向成纖維方向分化，尚未見報(bào)道。本研究通過檢測(cè)放射損傷的BMSCs使用BMP-2干預(yù)后，成纖維相關(guān)蛋白分子的變化情況，探究BMP-2對(duì)放射線損傷的 BMSCs的保護(hù)作用，并初步探討 TGFβ1/Smad通路在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 大鼠BMSCs來源與培養(yǎng)

BMSCs原代細(xì)胞取自于2～3周齡的SD大鼠，麻醉后，無菌條件取出脛骨，使用含有10%胎牛血清α-MEM培養(yǎng)液沖洗骨髓，于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至3～6代用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 大鼠BMSCs鑒定

成骨與成脂分化誘導(dǎo)：培養(yǎng)細(xì)胞加入成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)21 d后，進(jìn)行茜素紅染色。培養(yǎng)細(xì)胞加入成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)18 d后，進(jìn)行油紅O染色。

細(xì)胞表面抗體檢測(cè)：選取長(zhǎng)勢(shì)良好、形態(tài)均一的P4代 BMSCs，加入 CD29-PerCP、CD45-FITC、CD90-PE-CyTM7單克隆抗體，制成單細(xì)胞懸液后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 細(xì)胞模型建立

采用課題組前期的建模方法進(jìn)行［11］。使用放射線對(duì)BMSCs進(jìn)行照射，放射源為咸陽(yáng)第二一五醫(yī)院放療科CX576型放射治療機(jī)（VARIAN，美國(guó)），射線性質(zhì)為高能X射線，設(shè)置射線能量為6 MeV，劑量率為4 Gy/min，單次劑量為 4 Gy。

1.4 細(xì)胞的分組、誘導(dǎo)

為選出BMP-2最佳劑量，對(duì)放射后BMSCs分別使用25、50、100、250 ng/mL的 BMP-2，作用 7 d，并使用 Western blot檢測(cè)其 α-SMA的表達(dá)［12］。

將BMSCs分為對(duì)照組、放射組、BMP-2組、BMP-2＋頭蛋白（Noggin）組。對(duì)照組不接受放射線照射；放射組使用4 Gy放射線照射；BMP-2組在使用4 Gy放射線照射后使用100 ng/mL BMP-2作用7 d；BMP-2＋Noggin組在BMP-2組基礎(chǔ)上增加200 ng/mL的BMP-2拮抗劑Noggin（PrimeGene，上海）。使用Western Blot檢測(cè)各組α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Col-Ⅲ、TGF-β1、Smad2/3、pSmad2/3的表達(dá)；使用免疫熒光檢測(cè)Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達(dá)；使用RT-PCR檢測(cè)α-SMA的表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用GraphPad Prism進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，student-t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMSCs的鑒定

培養(yǎng)的BMSCs（圖1A），成脂誘導(dǎo)后脂肪細(xì)胞形成，累計(jì)脂滴呈串珠狀，油紅O染色呈鮮紅色（圖1B）；成骨誘導(dǎo)后可見茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)呈紅色（圖1C）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示BMSCs中CD29、CD90表達(dá)陽(yáng)性率分別為100%、99.9%，而 CD45陽(yáng)性率0.8%（圖1D）。

A：BMSCs形態(tài)（×40）；B：油紅O染色（×200）；C：茜素紅染色（×40）；D：流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖1 體外培養(yǎng)的BMSCs的鑒定A：BMSCs morphology（×40）；B：Oil red O staining（×200）；C：Alizarin red staining（×40）；D：Flow cytometry analysisFig 1 Identification of in vitro cultured BMSCs

2.2 BMP-2作用劑量測(cè)定

Western blot檢測(cè)不同濃度BMP-2作用后放射損傷BMSCs中α-SMA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)100 ng/mL的BMP-2作用后，α-SMA表達(dá)量最低，且與對(duì)照組相比，P＜0.05（圖 2）。

圖2 BMP-2對(duì)BMSCs中α-SMA表達(dá)的影響Fig 2 The effect of BMP-2 on α-SMA expression in BMSCs

2.3 成纖維相關(guān)蛋白分子的表達(dá)變化

Western blot結(jié)果表明，放射組BMSCs中α-SMA、Col-Ⅲ表達(dá)量高于對(duì)照組，BMP-2組表達(dá)量與放射組相比顯著降低（P＜0.05）；BMP-2＋Noggin組表達(dá)量與放射組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3）。

圖3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中α-SMA和Col-Ⅲ的表達(dá)Fig 3 Western blot analysis of α-SMA and col-Ⅲ expression in BMSCs of the groups

免疫熒光方法檢測(cè)各組Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達(dá)，結(jié)果顯示放射組Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.01），BMP-2組 Col-Ⅰ和 Col-Ⅲ的表達(dá)顯著低于放射組（P＜0.01）、與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），BMP-2＋NOGGIN組Col-Ⅰ和 Col-Ⅲ的水平顯著高于BMP-2組（P＜0.01）、而與放射組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖 4）。

圖4 免疫熒光法測(cè)量Col-Ⅰ和Col-ⅢFig 4 Immunofluorescence for measuring Col-Ⅰ and Col-Ⅲ expression in BMSCs of the groups

RT-PCR結(jié)果表明，放射后 α-SMA擴(kuò)增倍數(shù)升高，BMP-2組α-SMA擴(kuò)增倍數(shù)較放射組顯著降低（P＜0.05），BMP-2＋NOGGIN組 α-SMA擴(kuò)增倍數(shù)高于BMP-2組（圖 5）。

圖5 RT-PCR法測(cè)量各組BMSCs中α-SMA的表達(dá)Fig 5 α-SMA expression in BMSCs of the groups examined by RT-PCR

2.4 TGF-β1/Smad通路的表達(dá)變化

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，如圖6所示，BMP-2組中TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表達(dá)量均較放射組降低（P＜0.05），BMP-2＋Noggin組中 TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3表達(dá)量與放射組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（圖6）。

圖6 Western blot法檢測(cè)各組BMSCs中TGF-β1/Smad相關(guān)蛋白表達(dá)量Fig 6 Western blot analysis of TGF-β1/Smad pathway related protein expression in BMSCs of the groups

3 討 論

ORNJ是頭頸癌患者放療后常見的一種遠(yuǎn)期并發(fā)癥，治療棘手、發(fā)病機(jī)制不清，目前大量的研究認(rèn)為，ORNJ是一種放射誘導(dǎo)的纖維化疾病，與放射損傷后局部組織內(nèi)干細(xì)胞受損、成骨能力下降以及纖維化基質(zhì)堆積有關(guān)。有研究表明，應(yīng)用BMP-2對(duì)ORNJ具有一定的治療作用并且與促進(jìn)ORNJ病變組織內(nèi)成骨分化有關(guān)，而BMP-2在一些其他纖維化疾病如胰腺纖維化等中，可抑制纖維化的形成，從而對(duì)纖維化疾病具有一定的治療作用［10］。但是，BMP-2對(duì)ORNJ的治療是否與抑制纖維化有關(guān)，目前尚未見研究報(bào)道。因此，本研究通過建立BMSCs放射損傷模型，檢測(cè)BMP-2作用后纖維化相關(guān)分子以及TGF-β1/Smads通路的表達(dá)變化情況，以明確BMP-2對(duì)放射損傷BMSCs成纖維分化的抑制作用，并初步探討其可能的機(jī)制。

BMP-2在肺等其他組織纖維化疾病中能夠抑制α-SMA的表達(dá)，減輕纖維化［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，使用BMP-2作用于放射后 BMSCs，可顯著降低 α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的表達(dá)，表明BMP-2可抑制放射損傷BMSCs向成纖維化分化、減少放射后細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，這可能是BMP-2治療ORNJ的重要機(jī)制之一。

近年越來越多的研究表明，TGF-β1在纖維化進(jìn)程中起到重要作用，已成為公認(rèn)的器官纖維化治療靶標(biāo)［14］。有研究表明，在腎的炎癥、纖維化反應(yīng)中，BMP-2可通過抑制Smad2/3磷酸化而拮抗TGF-β1的作用，最終抑制腎臟纖維化［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，BMP-2可明顯抑制放射損傷BMSCs中TGF-β1及p-Smad2/3的表達(dá)，表明BMP-2抑制放射損傷BMSCs的成纖維化能力，可能與TGF-β1/Smad途徑相關(guān)。

通過本研究，發(fā)現(xiàn)BMP-2可抑制放射損傷BMSCs中的纖維化相關(guān)分子、TGF-β1及其下游分子的表達(dá)。由此推測(cè)，BMP-2除了可增強(qiáng)放射損傷后BMSCs的成骨分化能力，還可能通過抑制TGF-β1/Smad信號(hào)通路從而減輕其向成纖維方向分化。本研究進(jìn)一步闡明了BMP-2在ORNJ治療中的機(jī)制，可為提高BMP-2對(duì)ORNJ的治療效果提供理論依據(jù)。僅管BMP-2在體外培養(yǎng)的放射損傷BMSCs中具有抗纖維化作用，但BMP-2在ORNJ組織中抗纖維化的具體機(jī)制并不清楚，還需要通過更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究BMP-2在ORNJ中的抗纖維化作用。