鈣敏感受體及下游PLC/TRPM5介導(dǎo)苯丙氨酸刺激豬十二指腸分泌膽囊收縮素

王綠陽,康翠翠,丁立人,馮江銀,洪秋霞,游美敬,保浩宇,杭蘇琴*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)國家動物消化道營養(yǎng)國際聯(lián)合研究中心/江蘇省消化道營養(yǎng)與動物健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/消化道微生物研究室,江蘇 南京 210095;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)類國家級實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,江蘇 南京 210095)

養(yǎng)豬生產(chǎn)中,采食量是影響豬生產(chǎn)性能的關(guān)鍵因素之一。研究表明,給豬自由采食的基礎(chǔ)上再強(qiáng)飼20%,其體重可提高40%[1],說明提高采食量促進(jìn)了動物生長。動物采食量主要與由十二指腸以及空腸近端Ⅰ細(xì)胞分泌的胃腸飽感激素膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)有關(guān)[2-3]。研究表明CCK主動免疫可以促進(jìn)豬的采食,提高生長性能[4],說明CCK參與豬的采食調(diào)控。氨基酸可有效刺激CCK分泌,其中芳香族氨基酸——苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)能顯著刺激嚙齒類動物小腸分泌CCK[5]。人體十二指腸灌注L-Phe可升高血液CCK濃度,降低胃腸蠕動速率,抑制機(jī)體食欲[6]。這表明日糧或蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的Phe可能同樣刺激豬CCK分泌。

胃腸道內(nèi)分泌細(xì)胞(enteroendocrine cells,EEC)表達(dá)的G蛋白偶聯(lián)型受體(G protein-coupled receptors,GPCR)參與介導(dǎo)胃腸激素的分泌,這些受體包括鈣敏感受體(calcium sensing receptor,CaSR)和鮮味受體(type 1 taste receptor 1/3,T1R1/T1R3)[7]。研究發(fā)現(xiàn),CaSR和T1R1/T1R3可介導(dǎo)嚙齒類動物CCK的分泌[8-9],但這2個受體是否同樣介導(dǎo)Phe刺激豬CCK分泌還不清楚。胞內(nèi)磷脂酶C(phospholipase C,PLC)是介導(dǎo)CCK分泌的關(guān)鍵分子,其催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(4,5-phosphatidylinositol bisphosphate,PIP2)分解產(chǎn)生的1,4,5-三磷酸肌醇(inositol triphosphate,IP3)可促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫釋放Ca2+[10]。另一方面,細(xì)胞膜陽離子通道蛋白瞬時受體電位離子通道蛋白5(transient receptor potential subfamily M member 5,TRPM5)的打開也依賴于胞內(nèi)Ca2+濃度變化,尤其是PLC活化誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+濃度升高[11],因此下游PLC/TRPM5可能是介導(dǎo)CCK分泌的關(guān)鍵分子。

目前關(guān)于氨基酸對胃腸激素分泌及食欲影響的研究主要集中于嚙齒類動物或內(nèi)分泌細(xì)胞系,而嚙齒類動物與豬胃腸道氨基酸感應(yīng)受體的表達(dá)存在差異[12-13]。此外,相比于內(nèi)分泌細(xì)胞系,腸道組織培養(yǎng)能夠保證細(xì)胞所處的環(huán)境基本保持完整,并能保留細(xì)胞極性[14]。因此,本研究以CCK分泌的主要部位——豬十二指腸組織為研究模型,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前期建立的組織體外灌流方法,探究Phe對豬十二指腸組織CCK分泌的影響及其潛在機(jī)制,以期為從營養(yǎng)角度調(diào)控豬的采食奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

CaSR抑制劑NPS 2143、calhex 231和PLC抑制劑U-73122均購自MedChem Express公司;L(D)-Phe、T1R1/T1R3激活劑肌苷酸(inosine monophosphate,IMP)、TRPM5抑制劑氧化三苯基磷(triphenylphophine oxide,TPPO)購自上海源葉生物科技有限公司;T1R1/T1R3抑制劑lactisole購自Cayman Chemical公司;豬膽囊收縮素(CCK)ELISA試劑盒購自南京奧青生物技術(shù)有限公司;CaSR抗體(MA1-934)和山羊抗鼠IgG(H+L)均購自Thermo Pierce公司,β-actin抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 豬十二指腸組織灌流試驗(yàn)

1.2.1 灌流組織的采集及灌流樣品制備用無菌蒸餾水配制0.01 mol·L-1PBS(135 mmol·L-1NaCl、8 mmol·L-1K2HPO4、2.7 mmol·L-1KCl、1.5 mmol·L-1KH2PO4,pH7.2),用于沖洗十二指腸組織中的食糜;配制基礎(chǔ)(Kreb’s)緩沖液(136.87 mmol·L-1NaCl、3.0 mmol·L-1CaCl2、4.02 mmol·L-1KCl、2.10 mmol·L-1MgCl2、25.18 mmol·L-1HEPES、33.33 mmol·L-1Glucose,pH7.4),用于組織灌流。

豬十二指腸組織采集于江蘇省南京市當(dāng)?shù)赝涝讏?試驗(yàn)豬體重100～130 kg,品種為杜洛克×長白×約克夏三元雜交豬。豬屠宰后,立即采集長約6 cm的豬近端十二指腸,放置于充滿氣體(含95% O2和5% CO2)的預(yù)冷Kreb’s緩沖液中,于1 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室,立即將組織放置于無菌操作臺,參照談寅飛等[15]和Xian等[16]的方法,剪取長3 cm左右的豬十二指腸,去除腸系膜脂肪后將腸道縱向剖開,用0.01 mmol·L-1PBS沖洗。將洗凈的組織切成約1 mm3的組織塊,混勻,按照每組400 mg稱量并隨機(jī)放入灌流小室。試驗(yàn)中所用的樣品均來自3頭豬的十二指腸組織混合物。

1.2.2 組織灌流程序灌流裝置詳見Wang等[17]的描述。灌流試驗(yàn)開始前,通過蠕動泵將含有氣體的灌流液引入灌流小室,用水浴鍋預(yù)熱,使灌流小室液體溫度達(dá)到37 ℃。將制備好的豬十二指腸組織放入灌流小室,調(diào)節(jié)蠕動泵速率為6 mL·h-1,用Kreb’s緩沖液預(yù)灌流20 min,使所有十二指腸組織處于同一狀態(tài)。組織灌流程序如圖1所示。試驗(yàn)一:根據(jù)Feng等[18]的方法并進(jìn)行調(diào)整,分別用0、10、20和50 mmol·L-1的L-Phe溶液進(jìn)行灌流(圖1-A),篩選刺激豬十二指腸組織分泌CCK的L-Phe濃度;試驗(yàn)二:分別用D-Phe和L-Phe刺激組織比較氨基酸構(gòu)型對CCK分泌的影響(圖1-B);試驗(yàn)三:分別在灌流液中加入CaSR抑制劑NPS 2143(25 μmol·L-1)和calhex 231(20 μmol·L-1),T1R1/T1R3激動劑IMP(2.5 mmol·L-1)和抑制劑lactisole(5 mmol·L-1),PLC抑制劑U-73122(10 μmol·L-1)和TRPM5抑制劑TPPO(100 μmol·L-1),探究CaSR、T1R1/T1R3和下游信號分子PLC、TRPM5在L-Phe刺激CCK分泌過程中的作用(圖1-C)。將試驗(yàn)過程中收集的灌流液4 ℃、10 000 r·min-1離心5 min,收集上清液,-20 ℃保存用于后續(xù)CCK濃度的測定。

圖1 豬十二指腸組織灌流程序圖Fig.1 The perfusion procedure of porcine duodenum A.不同濃度L-Phe對CCK分泌的影響;B. Phe構(gòu)型對CCK分泌的影響;C.激活或抑制CaSR、T1R1/T1R3、PLC和TRPM5對L-Phe刺激CCK分泌的影響。A. Effects of different concentrations of L-Phe on CCK secretion;B. Effects of different configurations of Phe on CCK secretion;C. Effects of activation or inhibition of CaSR,T1R1/T1R3,PLC,and TRPM5 on L-Phe stimulated CCK secretion.

圖2 豬十二指腸CaSR蛋白的表達(dá)Fig.2 Protein expression of CaSR in porcine duodenum

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 十二指腸CaSR蛋白免疫印跡檢測在南京市某屠宰場再采集3頭豬的十二指腸組織。提取組織蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE,之后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上,用含50 g·L-1脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h,再分別加CaSR(1∶2 000)和β-actin抗體(1∶1 500)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌4次后,用二抗山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG,H+L,1∶5 000)室溫孵育1 h。TBST洗滌3次,加入ECL發(fā)光底物后曝光,拍照。

1.3.2 灌流液CCK濃度測定嚴(yán)格按照豬CCK ELISA試劑盒說明書檢測灌流液中的CCK濃度。試劑盒檢測濃度為10～200 ng·L-1,批間變異系數(shù)小于15%,批內(nèi)變異系數(shù)小于9%。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 豬十二指腸CaSR蛋白的表達(dá)

如圖1所示:3頭豬的十二指腸均存在CaSR蛋白表達(dá),且清晰度、條帶數(shù)均較相似。

2.2 Phe對CCK分泌水平的影響

為了探討不同濃度氨基酸對CCK分泌水平的影響,本試驗(yàn)分別用0、10、20和50 mmol·L-1L-Phe進(jìn)行豬十二指腸灌流,并檢測灌流液中的CCK濃度。結(jié)果如圖3-B所示:與對照組(0 mmol·L-1Phe)相比,50 mmol·L-1L-Phe能夠顯著促進(jìn)豬十二指腸CCK的分泌(P<0.05),而10、20 mmol·L-1L-Phe并不能促進(jìn)CCK的分泌(P>0.05)。為進(jìn)一步探討CCK分泌是否與氨基酸的構(gòu)型(D-型和L-型)有關(guān),在上述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,均分別選取0、50 mmol·L-1D-Phe和L-Phe 進(jìn)行豬十二指腸灌流。結(jié)果圖(3-D)顯示:與0 mmol·L-1L-Phe相比,50 mmol·L-1L-Phe能夠顯著促進(jìn)豬十二指腸CCK的分泌(P<0.05),而50 mmol·L-1D-Phe未能促進(jìn)CCK的分泌(P>0.05),說明Phe促進(jìn)CCK分泌與其特定結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖3 Phe濃度(A、B)及構(gòu)型(C、D)對CCK分泌的影響Fig.3 Effects of Phe concentration(A,B)and configuration(C,D)on CCK level不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different letters mean significant difference(P<0.05). The same as follows.

2.3 CaSR抑制劑對CCK分泌水平的影響

如圖4所示:與對照組(0 mmol·L-1L-Phe)相比,50 mmol·L-1L-Phe顯著促進(jìn)豬十二指腸CCK的分泌,但加入CaSR抑制劑NPS 2143或calhex 231后,L-Phe引起的CCK分泌被顯著抑制(P<0.05)。這表明CaSR參與介導(dǎo)L-Phe刺激豬十二指腸分泌CCK。

圖4 CaSR抑制劑NPS 2143(A、B)和calhex 231(C、D)對CCK分泌的影響Fig.4 Effects of CaSR inhibitors NPS 2143(A,B)and calhex 231(C,D)on CCK level

2.4 T1R1/T1R3抑制劑和激動劑對CCK水平的影響

如圖5所示:與對照組(0 mmol·L-1L-Phe)相比,50 mmol·L-1L-Phe顯著促進(jìn)豬十二指腸CCK的分泌,但加入T1R1/T1R3激動劑IMP和抑制劑lactisole后,L-Phe引起的CCK分泌并無顯著變化(P>0.05)。這表明T1R1/T1R3并未參與介導(dǎo)L-Phe刺激豬十二指腸CCK的分泌。

圖5 T1R1/T1R3激動劑IMP(A、B)和抑制劑lactisole(C、D)對CCK分泌的影響Fig.5 Effects of T1R1/T1R3 agonist IMP(A,B)and inhibitor lactisole(C,D)on CCK level

2.5 PLC和TRPM5抑制劑對L-Phe誘導(dǎo)的CCK水平的影響

如圖6所示:與對照組(0 mmol·L-1L-Phe)相比,50 mmol·L-1L-Phe顯著促進(jìn)豬十二指腸CCK的分泌,但分別加入下游信號分子PLC抑制劑U-73122和TRPM5抑制劑TPPO后,L-Phe引起的CCK分泌均顯著降低(P<0.05)。這表明L-Phe刺激CCK分泌需要下游信號分子PLC和TRPM5的參與。

圖6 PLC抑制劑U-73122(A、B)和TRPM 5抑制劑TPPO(C、D)對CCK水平的影響Fig.6 Effects of PLC inhibitor U-73122(A,B)and TRPM5 inhibitor TPPO(C,D)on CCK levels

3 討論

3.1 豬十二指腸CaSR蛋白的表達(dá)

作為跨膜蛋白,CaSR由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域3個獨(dú)立的部分構(gòu)成[19]。為探究CaSR在Phe刺激豬十二指腸分泌CCK中的作用,本研究驗(yàn)證了豬十二指腸存在CaSR蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示,豬的CaSR為相對分子質(zhì)量130 000和150 000的條帶,人和嚙齒類動物蛋白結(jié)果同樣顯示CaSR包含130 000和150 000蛋白條帶[20-21]。研究顯示,檢測到的130 000條帶是位于胞內(nèi)的、未修飾的不成熟結(jié)構(gòu),150 000條帶是位于細(xì)胞膜、經(jīng)糖基化修飾后的成熟結(jié)構(gòu),其糖基化結(jié)構(gòu)包括甘露糖或復(fù)合碳水化合物,并被認(rèn)為對CaSR在細(xì)胞表面的定位、從細(xì)胞內(nèi)向膜運(yùn)輸以及蛋白的折疊至關(guān)重要[22]。斷奶仔豬胃腸道CaSR的表達(dá)由強(qiáng)到弱依次為回腸、空腸、胃、十二指腸、結(jié)腸,這可能與營養(yǎng)物質(zhì)主要在小腸被吸收有關(guān)。研究表明CaSR的主要激活劑Ca2+有超過60%被回腸吸收、20%左右被空腸和十二指腸吸收,剩下的被胃和大腸吸收。因此,CaSR在豬胃腸道的分布模式與不同腸段對營養(yǎng)物質(zhì)吸收的相對貢獻(xiàn)是一致的[23]。

3.2 Phe對CCK分泌的影響

作為必需氨基酸,L-Phe灌胃能顯著提高嚙齒類動物血液CCK水平并抑制機(jī)體食欲[5]。此外,人體十二指腸灌注L-Phe同樣能夠提高血液CCK水平,降低機(jī)體能量攝入[24]。說明L-Phe是CCK分泌的刺激物。本研究表明,50 mmol·L-1L-Phe能夠顯著刺激豬十二指腸CCK的分泌,而10和20 mmol·L-1無此效應(yīng)。但目前不同研究中L-Phe刺激CCK分泌的水平并不一致,對嚙齒類動物細(xì)胞系的研究顯示L-Phe刺激CCK分泌的濃度是10 mmol·L-1或20 mmol·L-1[11,25],這可能是由細(xì)胞系和十二指腸組織之間的差異引起的。另外,同屬于芳香族氨基酸的L-色氨酸(L-tryptophan,L-Trp)在20 mmol·L-1時便可顯著刺激豬十二指腸分泌CCK,這表明氨基酸的結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)影響激素的分泌[26]。同時,僅L-Phe可以刺激CCK分泌而非D-Phe,表明氨基酸構(gòu)型同樣是影響CCK分泌的因素。除了CCK,L-Phe還是其他胃腸激素分泌的刺激物。L-Phe體外灌流還可以刺激嚙齒類動物腸道和結(jié)腸L細(xì)胞分泌胰高血糖素樣肽1(glucagon-like peptide 1,GLP-1)和酪酪肽(peptite YY,PYY)[27]。此外,滲透壓可能是刺激激素分泌的因素之一[28-29],但本研究中L-Phe誘導(dǎo)CCK的分泌與滲透壓無關(guān),因?yàn)?0 mmol·L-1D-Phe并沒有出現(xiàn)該效應(yīng)。

3.3 CaSR 和T1R1/T1R3在L-Phe誘導(dǎo)的CCK分泌中的作用

為進(jìn)一步探究CaSR和T1R1/T1R3的作用,本研究首先在灌流液中分別加入CaSR特異性抑制劑NPS 2143和calhex 231,發(fā)現(xiàn)L-Phe對CCK的促分泌作用消失,這表明L-Phe促進(jìn)豬十二指腸CCK的分泌依賴于CaSR。同時,抑制劑NPS 2143和Calhex 231的濃度也被證明對細(xì)胞活力和CCK的分泌沒有影響[25,30]。加入T1R1/T1R3激動劑IMP或拮抗劑lactisole后,L-Phe刺激的CCK分泌并無顯著變化,這表明T1R1/T1R3并未參與介導(dǎo)L-Phe刺激豬十二指腸CCK的分泌,這與對嚙齒類動物以及小鼠細(xì)胞系的研究結(jié)果存在差異。嚙齒類動物和豬T1R1/T1R3蛋白的同源性只有73%[31],這可能是本研究與嚙齒類動物研究中T1R1/T1R3對L-Phe的感應(yīng)存在差異的原因。

作為氨基酸感應(yīng)體,CaSR和T1R1/T1R3均屬于G蛋白偶聯(lián)型受體C家族,其中CaSR主要感應(yīng)芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨基酸),而T1R1/T1R3可識別20多種L-氨基酸,尤其對L-谷氨酸(L-glutamate,L-Glu)敏感[32]。Daly等[9]對小鼠近端小腸的研究發(fā)現(xiàn),L-Phe能夠同時激活CaSR和T1R1/T1R3誘導(dǎo)CCK分泌,但L-Glu只能通過T1R1/T1R3誘導(dǎo)激素分泌。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也表明,T1R1/T1R3能介導(dǎo)L-Glu刺激豬十二指腸CCK的分泌[33]。結(jié)合本研究,L-Phe和L-Glu可能分別通過激活CaSR和T1R1/T1R3刺激豬十二指腸CCK的分泌。

3.4 PLC和TRPM5在L-Phe誘導(dǎo)的CCK分泌中的作用

關(guān)于胃腸道PLC/TRPM5信號通路的研究已經(jīng)很多,尤其是在介導(dǎo)胃腸激素分泌中的作用。研究表明,抑制PLC活性能夠減弱H2S刺激小鼠STC-1細(xì)胞GLP-1和PYY的分泌[34]。此外,嘔吐毒素刺激小鼠STC-1細(xì)胞CCK的分泌依賴于TRPM5的激活[35]。本文進(jìn)一步研究了PLC/TRPM5在L-Phe刺激豬十二指腸CCK中的分泌。結(jié)果表明,灌流液中分別加入PLC和TRPM5特異性抑制劑U-73122和TPPO后,L-Phe 對CCK的促分泌作用消失,這表明PLC/TRPM5同樣介導(dǎo)L-Phe刺激豬十二指腸CCK的分泌。此外,PLC活化而引起的TRPM5通道的打開能夠引發(fā)胞外Na+內(nèi)流,從而升高胞內(nèi)膜電位,誘導(dǎo)細(xì)胞去極化[36];細(xì)胞去極化能夠造成質(zhì)膜上電壓門控鈣離子通道(voltage-gated calcium channel,VGCC)的打開,進(jìn)一步提高胞內(nèi)Ca2+濃度[37]。最新的研究表明,直接誘導(dǎo)細(xì)胞去極化的發(fā)生就足以促使內(nèi)分泌細(xì)胞GLUTag分泌GLP-1,說明細(xì)胞去極化也是胃腸激素分泌的誘因之一[38]。因此推測PLC/TRPM5可能會進(jìn)一步通過誘導(dǎo)細(xì)胞去極化與胞內(nèi)升高的Ca2+濃度協(xié)同促進(jìn)CCK分泌。

本試驗(yàn)證明了豬十二指腸表達(dá)CaSR,揭示CaSR、T1R1/T1R3、PLC和TRPM5的激活劑或抑制劑在L-Phe 刺激豬十二指腸CCK分泌中的作用。但是本研究僅僅證明了PLC和TRPM5在其中的介導(dǎo)作用,而Ca2+作為二者之間信號傳遞者的作用未被證實(shí);同時體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜,需要利用激活劑或抑制劑進(jìn)一步驗(yàn)證CaSR、PLC和TRPM5在其中的作用。