豬肺泡巨噬細胞中長鏈非編碼RNA在副豬嗜血桿菌感染中的作用

周妮妮,安家慧,?？尚?于棟,萬玉萌,李玉峰

(南京農業(yè)大學動物醫(yī)學院,江蘇 南京 210095)

副豬嗜血桿菌是豬格拉瑟氏病(Gl?sser’s disease)的病原,可引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎[1-2],每年給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失[3]。副豬嗜血桿菌菌株分為15種標準血清型[4],血清型1、5、10、12、13和14被認為是強毒株,能夠導致豬的高死亡率,血清型2、4、8和15的毒力較弱,而3、6、7、9和11則被認為是無毒力菌株[5]。副豬嗜血桿菌的強毒株通過黏附和侵入上皮細胞而定殖并引發(fā)感染,這些過程也是感染的第一步[6],并且其侵入細胞與全身性感染有關[7]。由于不同血清型菌株間的交叉保護作用很弱,疫苗控制該疾病的效果不明顯。氟苯尼考已被廣泛用于該病的治療,但對氟苯尼考耐藥的副豬嗜血桿菌菌株已出現(xiàn)[8]。因此,深入探究副豬嗜血桿菌與宿主之間的相互作用關系,有助于進一步揭示副豬嗜血桿菌的致病機制。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)被定義為長度大于200 nt的缺乏蛋白質編碼潛力的轉錄物。雖然lncRNA在大多數真核細胞中都有表達,但在不同的細胞和組織中發(fā)現(xiàn)的特異性lncRNA群體較mRNA的表達水平低。lncRNA在轉錄、轉錄后和表觀遺傳學水平上調編碼基因的表達,且在真核細胞的分化和胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[9-10]。大量數據表明,lncRNA可調節(jié)細菌感染。在被幽門螺桿菌感染的人胃上皮細胞中,23種lncRNA上調,21種下調。幽門螺桿菌陽性患者的胃黏膜組織中XLOC-004122和XLOC-014388的水平顯著降低[11]。在lncRNA-Aw112010中“隱藏”的新ORF的翻譯對于細菌感染和結腸炎期間的黏膜免疫至關重要[12]。越來越多哺乳動物細胞中表達的lncRNA被證實與免疫功能失調和宿主防御有關[13-14]。這包括lncRNA NeST,它通過增強小鼠體內局部IFN-γ的產生來促進沙門氏菌的清除[15]。此外,隨著沙門氏菌在宿主細胞內復制,核RNA的降解失調,從而促使另外一組不穩(wěn)定lncRNA的積累,其中一些對于機體抵抗細菌的入侵至關重要[16]。有研究發(fā)現(xiàn),microRNA miR-1通過降解胞質lncRNA Sros1間接穩(wěn)定Stat1信使RNA來促進巨噬細胞中干擾素γ介導的李斯特菌的清除[17]。

脊椎動物的先天性免疫應答是機體抵抗微生物入侵的第一道防線,作為先天性免疫的重要組成部分,巨噬細胞在宿主防御感染的過程中起重要作用,它們通過釋放細胞因子和趨化因子來介導微生物的殺滅,以及引發(fā)、維持和解決宿主的炎癥反應[18-19]。豬肺泡巨噬細胞被認為是機體抵御副豬嗜血桿菌感染的重要防線[20]。副豬嗜血桿菌感染豬體后,在豬肺泡巨噬細胞中鑒定出多個差異表達的基因,這些基因主要與炎癥反應、免疫反應、微管聚合、轉錄調控和信號轉導有關[21]。

轉化生長因子β(TGF-β)途徑在控制動物細胞生長、分化和最終命運的信號網絡中占據中心位置[22]。作為TGF-β家族的成員,TGF-β1調節(jié)多種生物學過程,包括細胞程序性死亡、纖維化、細胞分化、血管生成和細胞免疫。此外,TGF-β1調節(jié)細胞外基質(ECM)表達和一些整合素亞單位。例如TGF-β1上調上皮細胞中α5整合素和纖連蛋白(Fn)的表達[23]。整合素是由α和β亞基組成的糖蛋白,是已知的ECM受體,α5β1整合素可作為纖連蛋白的細胞受體[24]。長鏈非編碼RNA-MEG3的靶基因包括TGF-β途徑基因,其結合位點的全基因圖譜顯示,MEG3通過與遠端調控元件的結合來調節(jié)TGF-β1基因的活性[25]。我們之前曾報道過副豬嗜血桿菌的感染增強了PK-15細胞中TGF-β1的表達[26],表明TGF-β1在副豬嗜血桿菌的發(fā)病機制中起重要作用。

本試驗中,我們擬用標準血清型5型副豬嗜血桿菌感染豬肺泡巨噬細胞3D4/21,用RNA-Seq鑒定差異表達的lncRNA,探究差異表達的lncRNA候選基因在副豬嗜血桿菌致病機制中的潛在作用,為揭示致病菌與其靶標間相互作用以及相關lncRNA的調控機制提供一個新的研究手段。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Anti-Fibronectin(ab194395)是小鼠單克隆抗體(同種型是IgG1,輕鏈型是K),購自英國Abcam公司。小鼠抗人CD49e抗體(a5 integrin,555651)購自美國BD Biosciences公司。HRP標記的羊抗鼠抗體IgG(H+L)以及鼠抗FLAG標簽抗體購自南京碧云天生物技術公司。小干擾RNA(siRNA)轉染試劑 Micropoly-transfecterTMCell Reagent 購自南通Micropoly公司。質粒轉染試劑LipoMaxTMReagent購自南京SUDGEN公司。熒光定量試劑PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix購自美國Thermo Fisher公司。RIPA細胞裂解液購自Cell Signaling Technologies公司。Alexa Fluor 488結合的山羊抗小鼠抗體IgG(H+L)購自美國Proteintech公司。

1.2 細菌菌株培養(yǎng)

本試驗使用的3種副豬嗜血桿菌的標準血清型菌株(血清型4、5、7,分別稱為Hps4、Hps5和Hps7),菌株編號依次為SW124、Nagasaki和174。細菌在37 ℃的胰蛋白酶大豆瓊脂和胰蛋白胨大豆肉湯(以下分別簡稱為TSA和TSB,購自英格蘭OXOID公司)中培養(yǎng),添加有10 g·L-1煙酰胺嘌呤二核苷酸(NAD,南京博全科技有限公司)和5%滅活牛血清(Thermo Fisher)。試驗前,將細菌接種于TSB中,在37 ℃、200 r·min-1條件下培養(yǎng)過夜,然后用新鮮培養(yǎng)基稀釋,再培養(yǎng)至D600值達0.6。

1.3 細胞吞噬副豬嗜血桿菌試驗

3D4/21細胞,源自豬肺泡巨噬細胞原代細胞的傳代細胞系(原代豬肺泡巨噬細胞轉入大T抗原永生化后獲得,ATCC CRL2843)。將細胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所用細胞培養(yǎng)基RPMI 1640(Gibco)中加入10%滅活胎牛血清(FBS,Gibco)、10 g·L-1青霉素(鏈霉素)和10 g·L-1非必需氨基酸(Sigma)。待細胞生長至90%匯合度時,進行傳代培養(yǎng)。

將新鮮培養(yǎng)的副豬嗜血桿菌菌液8 000g離心1 min,然后用無菌PBS洗滌3次,用RPMI 1640重懸,調整細菌密度為2.5×108mL-1,進行細菌感染試驗,步驟稍作修改[27]。過夜培養(yǎng)的3D4/21細胞,在試驗前用無菌PBS洗滌3次,更換為無抗生素的培養(yǎng)基。將細胞與不同血清型副豬嗜血桿菌一起孵育,再用紫外線滅活細菌。將細胞板800g離心10 min,于溫箱中孵育2 h;用PBS沖洗細胞5次,加入新鮮的細胞培養(yǎng)基(包含100 U·mL-1青霉素G和0.25 mg·mL-1慶大霉素);孵育1 h以殺死細胞外的副豬嗜血桿菌,再用無菌PBS洗滌細胞(除去抗生素);向細胞中加入100 μL的0.25 μg·L-1胰蛋白酶,37 ℃孵育10 min。收集細胞,12 000g離心10 min,棄上清液,用無菌PBS重懸細胞并涂布TSA平板。

1.4 RNA的高通量測序

共培養(yǎng)6個T-75細胞瓶的3D4/21細胞,其中3個瓶的細胞以200 MOI的比例感染細菌Hps5(命名為Hps5-1、-2和-3),以另外3個瓶中未感染的細胞作為對照(命名為對照1、2和3)。感染36 h后棄培養(yǎng)基,加無菌PBS沖洗細胞3次。從細胞瓶內刮下細胞,使用Trizol試劑提取細胞內的總RNA。通過 10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,并且使用NanoPhotometer分光光度計檢查其純度。使用Qubit RNA Assay Kit 和Qubit 2.0 Flurometer測定RNA濃度。提交RNA樣品至Novogene公司進行RNA-seq高通量測序。獲取的高質量數據用于后續(xù)分析,包括Q20、Q30和GC含量的計算。

每個樣品的映射讀數是使用Scripture(beta2)[28]和 Cufflinks(v2.1.1)獲取的[29]。利用HTSeq和 SusScrofa 參考基因組(ftp://ftp.bl.org/pub/relea-84/fasta/sus-scrofa/),查找映射基因編碼的蛋白質。

1.5 lncRNA和mRNA的鑒定

用Cuffdiff v2.1.1計算lncRNA和編碼基因的每百萬個圖譜片段(FPKM)和每千堿基外顯子的片段[29]。將每個基因組中轉錄本的FPKM相加來計算基因的FPKM。Cuffdiff使用基于負二項分布的模型為分析數字轉錄本或基因表達數據中的差異表達提供統(tǒng)計程序[29]。調整后P<0.05的轉錄本為差異表達。使用4種分析工具(CNCI v2、CPC v0.9-r2、Pfam-scan v1.3和PhyloCSF v20121028)鑒定新的lncRNA候選基因。只有經過4種工具共同確認的lncRNA才能被認為是候選者,用轉錄本的FPKM檢測表達水平,與對照組表達水平差異在2.0以上的lncRNA被認為表達差異顯著。

1.6 熒光定量PCR(qPCR)分析差異表達的lncRNA

參照NCBI數據庫中野豬(Susscrofa)基因組數據庫的序列,設計針對10個上調lncRNA和 TGF-β1 的引物(表1)。持家基因β-actin引物購自TaKaRa公司。如上所述,將3D4/21細胞接種6孔細胞板并用 5型副豬嗜血桿菌感染。分別在12、24和36 h收集細胞,提取總RNA,然后用SYBR-Green試劑進行qPCR,以β-actin作為內參計算lncRNA的相對表達水平。相對表達水平的計算采用2-ΔΔCT法。

表1 本試驗所用的引物對序列Table 1 Primer pairs sequence used in this study

1.7 細菌感染與lncRNA的表達

由Biotend Biotechnologies公司設計合成靶向LNC_000165(lncRNA 165)的3條小干擾RNA片段(siRNA)(表2)以及1個非特異性隨機片段(NC,數據未提供)。為優(yōu)化基因沉默的轉染條件,接種3D4/21細胞于24孔細胞板中,每孔細胞為1.4×105個。細胞生長至50%的匯合度時,用不同濃度的siRNA片段轉染細胞,然后在不同時間收集細胞,測得靶向lncRNA 165的siRNA片段轉染細胞的最佳劑量為每孔0.06 mol。培養(yǎng)60 h后,以MOI為200的比例,用Hps5感染細胞。細菌感染試驗具體過程如1.3所述。收集細胞,提取總RNA,反轉錄后進行qPCR試驗。

表2 靶向lncRNA 165的特異siRNA序列Table 2 SiRNA sequences specific targeting lncRNA 165

利用PCR擴增,在lncRNA 165基因序列的N端加上起始密碼子ATG,在C端加上FLAG標簽及終止密碼子,并將其克隆到pcDNA 3.1中,構建表達lncRNA 165基因的重組質粒。以每孔1.3×105個細胞的密度在24孔細胞板中接種細胞。細胞融合度至50%時,轉染重組質粒(每孔1.0 μg)。孵育24 h后收集細胞,提取總RNA,用于qPCR試驗,以計算lncRNA 165的表達水平。同時,為了驗證lncRNA 165是否正確表達,在冰上將平行樣品置于RIPA緩沖液中裂解,用FLAG抗體進行Western blot分析。在24孔細胞板上接種3D4/21細胞(每孔1.3×105個)。當細胞達到50%匯合度時,用lncRNA 165-FLAG和pcDNA3.1轉染細胞,24 h后,以MOI為200的比例感染Hps5。

1.8 Fn和α 5整合素的表達

在24孔細胞板上以每孔1.3×105個細胞的密度接種3D4/21細胞。轉染后,用胰蛋白酶消化細胞,刮取細胞到無菌離心管中,300g離心5 min。用含1% BSA的PBS洗滌細胞3次,然后分別與纖連蛋白(fibronectin,Fn)和整合素蛋白(α5)抗體(每106個細胞加1 μg)在37 ℃孵育30 min。將細胞洗滌2次后,加入100 μL含1% BSA的PBS重懸,再加入Alexa Fluor 488結合的山羊抗小鼠抗體IgG(H+L,1∶100稀釋),37 ℃避光孵育30 min。洗滌細胞后將其重懸于200 μL含1% BSA的PBS中,然后使用流式細胞儀分析Fn和α5的表達。

1.9 數據統(tǒng)計學分析

圖1 CNCI、CPC、Pfam-scan和PhyloCSF 4種分析工具 鑒定3D4/21細胞中新的lncRNAFig.1 CNCI,CPC,Pfam-scan and PhyloCSF were used to identify novel lncRNA in 3D4/21 cells

2 結果與分析

2.1 3D4/21細胞中l(wèi)ncRNA和mRNA的鑒定

利用IlluminaHiSeq 2000平臺分別對未感染和感染Hps5的細胞RNA進行高通量測序分析,產生的對照1、2、3和Hps5-1、Hps5-2、Hps5-3的清潔讀數分別為10 616 284、 92 270 238、100 291 152和 103 948 420、105 623 050、10 383 024。Q20(%)值為96.45%～97.52%,大多數(66.5%)的映射基因編碼蛋白質。對轉錄本進行分類并鑒定lncRNA,共有25 512個mRNA和2 654個lncRNA,其中1 163個為有注釋的lncRNA,1 491 個為新發(fā)現(xiàn)的lncRNA(圖1)。剔除56個miscRNA和加工轉錄本后,2 439 個為大的基因間非編碼RNA(lincRNA),159個為反義lncRNA(anti-sense lncRNA),沒有發(fā)現(xiàn)內含子 lncRNA。lncRNA的2種亞型在基因結構和表達水平上存在較大差異,lincRNA比反義 lncRNA長,中位長度分別為1.929和1.699 kb(圖2-a)。外顯子的數量也不同,lincRNA和反義lncRNA的外顯子數量中值分別是2.6和3.0(圖2-b)。根據FPKM值,lincRNA的表達水平高于反義 lncRNA,中位值為8.7和3.9(圖2-c)。

圖2 2種lncRNA亞型轉錄長度(a)、外顯子數量(b)和表達水平(c)的比較Fig.2 Comparasion of transcript length(a),number of exons(b)and expression level(c)for two lncRNA subtypes

分析結果(圖3)顯示:在感染后36 h,與未感染細胞相比,受感染細胞中有110個lncRNA表達上調,216個lncRNA表達下調;同時,分別有1 586和1 039個mRNA表達上調和下調(圖3-a、c)。分層聚類分析表明,這些轉變在感染組和對照組中是可重復的(圖3-b、d)。

圖3 差異表達的lncRNA和mRNA的分類Fig.3 Classification of differentially expressed lncRNA and mRNA a、c.如果lncRNA的表達水平(感染/未感染)的log2大于或小于2,并且-lg q超過1.3,則定義為差異表達;b.分層聚類顯示不同樣品中l(wèi)ncRNA表達水平的可重復性;d. mRNA的層次聚類分析,使用lg(FPKM+1)進行層次聚類分析,紅色表示高表達的基因,藍色表示低表達的基因。a,c. lncRNA was defined as differentially expressed if log2 of its expression level(infected/uninfected)was greater than or less than 2,and -lg q exceeded 1.3;b. Hierarchical clustering showing the reproducibility of lncRNA expression levels in different samples;. d. Hierarchical clustering analysis for mRNA,lg(FPKM+1)was used to perform hierarchical clustering analysis. Highly expressed genes were indicated in red,and blue indicated genes with lower expression.

2.2 qPCR分析差異表達的lncRNA

為了驗證RNA-seq檢測到的轉錄組差異,選取10個在感染細胞中表達水平顯著上調的 lncRNA,用于qPCR分析。盡管表達方式不同,但與對照相比,在感染后36 h內,10個lncRNA在感染細胞中的表達水平均提高(圖4)。特別是,lncRNA 165和3304表現(xiàn)出更強的時間依賴性表達,在36 h時達到最高值。而lncRNA 166、9129、6491、644、893和345表達水平較低,且在36 h時未出現(xiàn)表達水平明顯上升的現(xiàn)象。

圖4 lncRNA表達基因的qPCR驗證Fig.4 Validation of gene expression by qPCR

2.3 細菌侵入對lncRNA表達的影響

為探索細菌侵入與吸附對lncRNA表達的影響是否存在差異,我們用紫外滅活和未滅活的Hps5感染細胞,比較細胞中的4種lncRNA的表達。未滅活的Hps5感染細胞后,lncRNA的表達水平顯著升高(圖5),特別是lncRNA 165和3304,其表達水平分別是對照組細胞的8.2和5.6倍(P<0.01)。

圖5 副豬嗜血桿菌的吸附與侵入對lncRNA表達的影響Fig.5 The effect of adherence and invasion of H.parasuis on the expression of lncRNAUV-Hps5:紫外線滅活的Hps5 Ultro-violet inactivated Hps5. *P<0.05, **P<0.01. The same as follows.

2.4 細菌毒力對lncRNA表達的影響

將3D4/21細胞用弱毒力(Hps4)、強毒力(Hps5)和無毒力(Hps7)標準血清型的副豬嗜血桿菌進行感染,分別在12、24和36 h時收集細胞進行qPCR分析。qPCR結果(圖6)顯示:Hps4、 Hps5和Hps7感染組中,lncRNA 165和3304在24和36 h時的表達水平都高于lncRNA 1125和3472。在24 h時,被Hps5感染細胞中l(wèi)ncRNA 3304的表達水平高于其他lncRNA,但在12和36 h時,其表達水平沒有顯著差異,而 lncRNA 165在副豬嗜血桿菌感染的細胞中穩(wěn)定上調。

圖6 不同毒力菌株對lncRNA表達水平的影響Fig.6 Effects of different virulent strains on the expression level of lncRNA

2.5 lncRNA 165的表達對細菌侵入的影響

細菌毒力與lncRNA表達關系的研究表明,lncRNA 165的表達可能與副豬嗜血桿菌的感染密切相關。為了驗證這一假設,我們用靶向lncRNA 165的siRNA片段和非特異性隨機片段(NC)轉染3D4/21細胞,然后用qPCR檢測lncRNA 165的表達情況。結果表明,RNA干擾可將lncRNA 165的表達降低約20%(圖7-a)。轉染后,細胞感染Hps5,然后計數侵入細胞內的細菌數。siRNA片段處理細胞內的細菌數顯著少于對照組(P<0.05),減少約60%(圖7-b)。

培養(yǎng)3D4/21細胞,轉染質粒lncRNA 165-FLAG、pcAGGS-FLAG和pcDNA3.1,24 h后收集細胞,制備蛋白樣品進行Western blot。結果顯示:lncRNA 165無法翻譯成蛋白質,這表明lncRNA 165是以lncRNA形式表達的(圖7-c)。同時,與對照組細胞相比,轉染了lncRNA 165-FLAG的細胞,其lncRNA 165的表達水平提高了90.5倍(圖7-d)。同上,用重組質粒轉染3D4/21細胞,24 h時后用Hps5感染細胞,lncRNA 165-FLAG處理細胞內的細菌數量顯著增加(P<0.05),為對照組的2.6倍(圖7-e)。

圖7 副豬嗜血桿菌侵入對lncRNA表達的影響Fig.7 Influence of invasion of H.parasuis on the expression of lncRNA a. siRNA干擾后lncRNA 165的表達;b. 轉染siRNA后細菌對細胞的侵入;c. 表達lncRNA 165重組質粒表達的鑒定;d. 轉染lncRNA 165重組質粒后lncRNA 165的表達;e. 過表達lncRNA 165后細菌對細胞的侵入。NC. 無關RNA干擾片段。a. The expression of lncRNA 165 interfered using siRNA fragments;b. The number of invasion of bacterium after interfering by siRNA fragments;c. The identification of recombinant plasmid expression lncRNA 165;d. The expression of lncRNA 165 in cells after transfection with recombinant plasmid expressing lncRNA 165;e. The number of invasion bacterium after overexpression of lncRNA 165. NC. Scamble RNA frogment.

2.6 lncRNA 165表達與TGF-β1表達的分析

用靶向lncRNA 165的siRNA片段和非特異性隨機片段(NC)轉染3D4/21細胞,收集樣品,qPCR檢測TGF-β1mRNA的表達。結果(圖8-a)顯示,降低lncRNA 165表達水平時,TGF-β1mRNA表達水平降低6.3%。

用重組TGF-β1預處理3D4/21細胞24 h后,使用qPCR分析lncRNA 165的表達。結果(圖8-b)表明,用TGF-β1預處理細胞可以促進lncRNA 165的表達,表達水平升高4.1倍。

圖8 TGF-β1 mRNA表達與lncRNA之間的關系Fig.8 Association between lncRNA expression and TGF-β1 mRNA expression a. 下調lncRNA 165的表達對TGF-β1 mRNA表達的影響;b. TGF-β1處理對lncRNA 165表達的影響。a. The down-regulation of lncRNA 165 affects the expression of TGF-β1 mRNA;b. The expression of lncRNA 165 was affected by the incubation of TGF-β1.

2.7 RNA干擾對3D4/21細胞中Fn和α5表達的影響

用特異性靶向lncRNA 165的siRNA片段以及非特異性隨機片段(NC)轉染3D4/21細胞,60 h后收集細胞,與抗纖連蛋白(Fn)和整合素蛋白(α5)抗體一起孵育,然后進行流式細胞分析。結果(圖9)顯示:與對照相比,siRNA轉染細胞的α5(56.69% VS 76.94%)和Fn(2.51% VS 4.21%)表達量顯著降低(P<0.05)。

圖9 RNA干擾對3D4/21細胞中Fn和α5表達的影響Fig.9 Effect of RNA interference on the expression of Fn and α5 in 3D4/21 cells

3 討論

豬格拉瑟氏病造成世界范圍養(yǎng)豬行業(yè)的巨大損失,免疫接種對15種已知標準血清型副豬嗜血桿菌的保護效果很差,或是僅對血清型中的一部分菌株有保護作用[8]。目前對該菌致病機制的研究主要集中在毒力因子方面[30]。關于副豬嗜血桿菌與宿主間相互作用機制的研究很少。眾所周知,lncRNA能夠參與病原與宿主間的相互作用[31]。而巨噬細胞作為抵御病原體侵入機體的第一道防線也有著重要作用[20]。

試驗中,我們用副豬嗜血桿菌標準血清5型感染豬肺泡巨噬細胞3D4/21細胞系,然后用RNA-Seq篩選差異表達的lncRNA,發(fā)現(xiàn)Hps5的感染明顯影響了lncRNA在3D4/21細胞中的表達,這說明lncRNA在副豬嗜血桿菌感染過程中發(fā)揮著重要作用。

我們采用qPCR技術對RNA-seq篩選出的感染細胞中較為豐富的10個lncRNA表達情況進行分析,證明了副豬嗜血桿菌的侵襲對lncRNA的表達具有更大的影響。同時,我們還確定了lncRNA 165和3304的高效表達與細菌毒力之間缺少相關性。但是,我們發(fā)現(xiàn)當細菌感染細胞36 h時,lncRNA 165的表達水平顯著上調,這表明lncRNA 165有作為檢測副豬嗜血桿菌感染宿主的分子標記的可能。siRNA干擾試驗支持lncRNA 165參與調節(jié)副豬嗜血桿菌侵入的假設。

TGF-β的表達與多種疾病和繼發(fā)感染有關。甲型流感病毒感染細胞后會引起細胞TGF-β1的表達水平升高,同時Fn和α5的表達水平也隨之增加,從而導致嚴重的細菌繼發(fā)感染[32]。在被Group A Streptococcus(GAS)感染的上皮細胞中發(fā)現(xiàn)其誘導TGF-β1的產生,而且TGF-β1上調Fn和整合素α5可增強GAS對上皮細胞的侵入[23]。我們之前曾報道過副豬嗜血桿菌感染增強了PK-15細胞中TGF-β1的表達[26]。本研究結果發(fā)現(xiàn),干擾lncRNA 165的表達會顯著調控TGF-β1的表達水平,同時Fn和整合素蛋白α5的表達水平也隨之變化,證明lncRNA 165的表達與TGF-β1的表達密切相關。同時,發(fā)現(xiàn)lncRNA 165的表達水平與副豬嗜血桿菌對3D4/21細胞的侵入呈正相關。

本研究發(fā)現(xiàn)副豬嗜血桿菌感染可調節(jié)多種lncRNA的表達,尤其是lncRNA 165在細胞中通過TGF-β信號通路調控對副豬嗜血桿菌的吞噬。因此,我們得出結論,lncRNA是副豬嗜血桿菌和宿主相互作用過程中的重要組成部分。

對于本試驗篩選出的lncRNA 165,除了需要了解其在副豬嗜血桿菌和宿主相互作用過程中的功能外,還需要進行更廣泛的功能研究,包括其相關蛋白的研究,探索其作為檢測副豬嗜血桿菌感染宿主靶標的可能性,為開發(fā)新的診斷和治療方法提供新思路。