阿帕替尼對胃癌細胞增殖、凋亡及VEGFR通路的影響研究▲

宋錦添 陳奕貴* 鄭亮 蔡雄超 王益

福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院&福建省腫瘤醫(yī)院，1 腹部腫瘤內(nèi)科，2 腹部腫瘤外科，福州市 350014

胃癌，僅次于肺癌，是全球第2大癌癥死亡原因[1]。胃癌患者被確診時通常已處于晚期，多已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，中位生存期約為10～12個月[2]。臨床上治療晚期胃癌患者最常用的化療藥物是人表皮生長因子受體2(HER2)靶向藥物，但該類藥物具有很強的細胞毒性，患者惡心嘔吐、骨髓抑制和脫發(fā)等副作用嚴重[3]。腫瘤血管生成在腫瘤發(fā)生過程中的作用越來越受到人們的關(guān)注[4]。血管內(nèi)皮生長因子(VEGFs)是血管形成過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，與受體酪氨酸激酶(RTK)結(jié)合后稱為VEGFR1-R3[5-6]。血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)可以作為靶向位點用于癌癥治療藥物的研發(fā)[7-10]。阿帕替尼是我國自主研發(fā)的一種小分子酪氨酸激酶抑制劑，可以特異性與細胞內(nèi)VEGFR2的ATP結(jié)合位點結(jié)合，阻斷下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制腫瘤新生血管的生成[11]。阿帕替尼有抗多種實體瘤的作用，包括肝細胞癌、非小細胞肺癌和晚期卵巢癌等[12-15]。在我國進行的胃癌Ⅱ期臨床研究結(jié)果顯示，阿帕替尼是一種治療胃癌的有效藥物[16]。為探討阿帕替尼治療胃癌的作用機制，本研究就阿帕替尼對胃癌細胞增殖、凋亡和VEGFR通路的影響進行了研究，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 胃癌細胞系HGC-27(貨號：TCHu 22)和NCI-N87(貨號：SCSP-534)購自中國科學(xué)院細胞庫(上海)，將其置于10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco，貨號：31800022)中，在37℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)。收集第3代對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化成單細胞懸液，根據(jù)實驗設(shè)計方案對細胞進行相應(yīng)處理。稱取50 mg阿帕替尼溶于二甲基亞砜(DMSO) 1 mL后放入-20 ℃冰箱保存，使用時用RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。

1.2 CCK-8細胞增殖試驗 使用Cell Counting Kit-8試劑盒(上海Beyotime)檢測細胞增殖情況。對NCI-N87和HGC-27細胞分別設(shè)置對照組及加藥組(10 μM組，20 μM組，30 μM組，40 μM組，50 μM組)，每組設(shè)5個復(fù)孔。加藥組細胞給予不同濃度的阿帕替尼(10 μM，20 μM，30 μM，40 μM，50 μM)處理，對照組細胞加相同體積的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后向每個孔中迅速加入10 μL CCK-8， 37 ℃孵育2 h后使用酶標儀(Bio-Rad，CA，USA)檢測每個孔450 nm處的吸光度。

1.3 克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的NCI-N87和HGC-27細胞，常規(guī)離心收集，設(shè)對照組及加藥組，將細胞接種到6孔板(每孔1×103)中， 37℃、5%CO2的環(huán)境下培養(yǎng)24 h。對照組細胞給予1‰ DMSO處理，加藥組細胞分別給予10 μM、20 μM阿帕替尼處理，37℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)2周。細胞集落用4%多聚甲醛固定30 min，之后用0.5%結(jié)晶紫染色30 min。用無菌水洗去染液，Odyssey掃描拍照，使用ImageJ軟件計算細胞克隆數(shù)。

1.4 流式細胞檢測 取對數(shù)生長期的NCI-N87和HGC-27細胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分為對照組和阿帕替尼處理組。對照組細胞給予1‰DMSO處理，阿帕替尼處理組細胞分別給予10 μM、20 μM阿帕替尼處理。48 h后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞并收集，用FITC-Annexin V/PI試劑(Roche，Basel，Switzerland)對細胞進行染色，用流式細胞儀(BD Biosciences，San Jose，USA)檢測凋亡細胞情況。

1.5 Western blot NCI-N87及HGC-27細胞給予10 μM和20 μM阿帕替尼處理，分組。對照組細胞給予1‰ DMSO處理，48 h后收集細胞于1.5 mL EP管中，使用SDS裂解液裂解細胞，使用BCA分析試劑盒(Bio-Rad，Hercules，美國)測量蛋白質(zhì)濃度。10%SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h，放入預(yù)先配好的Bcl-2(ab32124，1 ∶1000)、Bax(ab32503，1 ∶1 000)、Caspase 3(ab13847，1 ∶500)、Cleaved-Caspase 3(ab2302，1 ∶500)和內(nèi)參β-Actin(ab8227，1 ∶1 000)的一抗緩沖液中4℃孵育過夜。用TBST洗滌30 min后室溫孵育二抗IgG H&L(ab6721，1 ∶3 000)1 h，用TBST緩沖液洗滌30 min。使用增強的化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)檢測條帶灰度值。

采用膜蛋白抽提試劑盒(貨號：444810，Sigma-Aldrich，Darmstadt，Germany)檢測VEGFR2蛋白水平，根據(jù)試劑盒說明書進行操作。一抗選擇VEGFR2(ab134191，1 ∶1 000)，二抗選擇IgG H&L(ab6721，1 ∶3000)，內(nèi)參選擇NaK ATPase(ab58475，1 ∶500)?？贵w均購自Abcam(上海，中國)，一抗均為兔抗，二抗均為山羊抗兔。使用增強的化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)檢測條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以x±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 阿帕替尼抑制胃癌細胞的增殖 用不同濃度阿帕替尼(10 μM，20 μM，30 μM，40 μM，50 μM)分別處理NCI-N87及HGC-27細胞48 h，NCI-N87、HGC-27細胞存活率隨著阿帕替尼濃度增高而降低，見圖1A。根據(jù)48 h時的IC50值(圖1B)選用10 μM和20 μM的阿帕替尼進行后續(xù)實驗。分別用10 μM和20 μM的阿帕替尼處理NCI-N87及HGC-27細胞2周，隨著阿帕替尼濃度的增高，NCI-N87及HGC-27細胞克隆數(shù)逐漸下降(圖1C)。

圖1 阿帕替尼抑制胃癌細胞增殖情況

2.2 阿帕替尼誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡 流式細胞檢測結(jié)果顯示，隨著阿帕替尼濃度的增加，NCI-N87及HGC-27細胞凋亡率顯著增加，見圖2A。Western blotting結(jié)果顯示，隨著阿帕替尼濃度的增加，NCI-N87及HGC-27細胞的Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高， Cleaved-Caspase3表達水平升高，見圖2B。

圖2 阿帕替尼誘導(dǎo)胃癌細胞凋亡情況

2.3 阿帕替尼對胃癌細胞VEGFR通路的影響 Western blotting結(jié)果顯示，隨著阿帕替尼濃度升高，NCI-N87及HGC-27細胞的VEGFR2蛋白表達水平均下降，見圖3。

圖3 Western blot檢測VEGFR2蛋白表達水平

3 討 論

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥之一，晚期胃癌患者病情進展迅速、預(yù)后極差，一直是臨床治療的難題[17]。我國自主研發(fā)的阿帕替尼在胃癌患者的臨床治療中表現(xiàn)出具有顯著的療效[18]。為深入探討阿帕替尼治療胃癌的作用機制，本研究就阿帕替尼對胃癌細胞增殖、凋亡及VEGFR通路的影響進行了研究。

細胞增殖與腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示，NCI-N87、HGC-27細胞的存活率、細胞克隆數(shù)隨著阿帕替尼濃度的增高而降低，提示阿帕替尼具有抑制胃癌細胞增殖的作用。細胞凋亡在調(diào)節(jié)細胞存活和維持其穩(wěn)態(tài)中具有重要意義，目前有很多藥物是通過促進細胞凋亡來實現(xiàn)其抗癌作用，如長春新堿即是通過阻滯細胞的有絲分裂進而導(dǎo)致細胞凋亡而達到治療癌癥的目的[20-21]。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，具有明顯的抑制細胞凋亡的作用；而Bax是一種促凋亡蛋白，可以促進細胞凋亡。當細胞凋亡啟動時，Caspase 3會轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘?Cleaved-Caspase 3，參與細胞凋亡過程。本研究結(jié)果顯示，隨著阿帕替尼濃度的增加，NCI-N87及HGC-27細胞凋亡率顯著增加，Bcl-2表達水平降低，Bax、Cleaved-Caspase3表達水平升高，提示阿帕替尼可促進胃癌細胞凋亡。VEGFR是血管內(nèi)皮生長因子受體，對腫瘤細胞的血管生成有重要作用[22]。本研究結(jié)果顯示，隨著阿帕替尼濃度的升高，NCI-N87及HGC-27細胞的VEGFR2蛋白表達水平下降，提示阿帕替尼對胃癌細胞VEGFR通路具有抑制作用，可阻斷下游信號傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤新生血管的生長。

綜上所述，阿帕替尼可抑制胃癌細胞增殖，同時具有促進胃癌細胞凋亡和抑制VEGFR通路的作用。