不同糧倉中稻谷優(yōu)勢霉菌的鑒定及差異性分析

李 娜 周紅麗 吳衛(wèi)國 廖盧艷 劉 博 宗 平 任劍豪 周 濤

(1湖南農業(yè)大學，食品科學技術學院，湖南長沙 410128；2中南糧油食品科學研究院有限公司，湖南長沙 410008)

稻谷是我國主要的糧食作物之一，全國各地都有稻谷的種植區(qū)，年總產量高達2 億t[1]。稻谷儲藏過程中，受儲藏條件的限制易滋生霉菌，易引起儲藏稻谷發(fā)霉、腐爛和變色，直接或間接地影響儲藏稻谷的質量與安全[2]。稻谷儲藏期間危害最大的微生物是霉菌[3]，何榮等[4]研究發(fā)現(xiàn)，黑曲霉(Aspergillus niger)、黃曲霉(Aspergillus flavus) 以及產黃青霉(Penicillium chrysogenum)最易導致稻谷結塊，結塊稻谷的出糙率、整精米粒率較低，且不完善粒率明顯增加。在熱帶、亞熱帶氣候地區(qū)，多數(shù)稻谷在濕熱季節(jié)收獲，未及時干燥的稻谷在濕熱條件下儲藏會滋生大量霉菌，引起稻谷品質下降[5－7]。實際應用中，產毒霉菌通常會污染儲存的谷物和谷物產品，同時也會產生有毒的次生代謝物，這些次生代謝物甚至可直接影響動物生殖系統(tǒng)[8－10]。儲藏期間，稻各中帶有的霉菌種類較多，主要是曲霉屬和青霉屬[11]，現(xiàn)階段仍主要依據(jù)霉菌的菌落情況和顯微結構特征[12－13]來鑒定，如參考菌落、菌絲和孢子的形態(tài)[14]。但針對儲糧糧倉不同層位稻谷中優(yōu)勢霉菌數(shù)量的變化以及不同儲糧階段稻谷中優(yōu)勢霉菌的變化規(guī)律研究相對較少。

鑒于此，為了調整和完善稻谷的儲藏條件，降低稻谷在儲藏過程中的損失，本研究綜合湖南各地區(qū)的儲糧條件，對不同儲糧階段、不同糧倉及糧倉不同位置稻谷中優(yōu)勢霉菌的種類及數(shù)量進行研究，以期為稻谷安全儲藏與防控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品來源:湖南省常德市金牛糧倉7P3 倉、長沙縣金山糧倉0P2 倉、永州市銀光糧倉1P2 倉。

稻谷品種:早秈稻；入庫年份:2018年。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)，北京陸橋技術股份有限公司；氯化鈉(分析純)，西隴科學股份有限公司；TSINGKE DNA 凝膠回收試劑盒(Code No.GE0101)、rTaq 酶(Taq DNA 聚合酶)、PCR Mix、測序試劑ABI-bigdye，上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司；TIANGEN 基因組DNA 提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 主要儀器與設備

SW-CJ－1D 超凈工作臺，江蘇蘇潔凈化設備廠；MJ－150－11 霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；LDZX－50KBS 立式高壓蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；TP－220A 電子天平，湘儀天平儀器設備有限公司；ABI 3730XL 測序儀，美國基因儀器公司；SMA4000微量分光光度計，美國恒通(北京)儀器有限公司上海分公司；DYY－6C 電泳儀，北京六一生物科技有限公司；BLD8-PCR－2 全自動基因擴增儀，上海仝元生物科技有限公司；FR980 凝膠成像分析系統(tǒng)，上海復日科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 稻谷樣品采集 2019年9月6日分別進行第一次取樣，此后每兩個月取樣一次，共取樣3 次。采用五點三層取樣，分別以距糧堆表面2.4、3.6、4.8 m 為上層、中層、下層[15]。以距糧倉東南角、東北角、西南角、西北角1.5 m 處及糧倉中央點作為取樣點，每一個點位取上、中、下三層的稻谷，共取15 份樣品，每份樣品取1 kg，用無菌取樣袋密封取回，于實驗室低溫避光保存。取樣點位如圖1所示。

圖1 稻谷每層取樣點位圖Fig.1 Rice sampling point bitmap of each layer

1.3.2 霉菌菌種鑒定

1.3.2.1 霉菌菌種初步鑒定 利用劃線法分離純化得到的霉菌，根據(jù)其菌落的培養(yǎng)特性和顯微特征對菌種進行初步鑒定；霉菌培養(yǎng)特性的觀察:根據(jù)霉菌的生長速度、培養(yǎng)時間，以及其菌落顏色、氣味、形態(tài)等，對其進行初步判斷。

霉菌顯微特征鑒定:挑取菌落邊緣的氣生菌絲，制片。將其置入顯微鏡下，觀察其是有性或是無性繁殖、營養(yǎng)菌絲的情況以及形態(tài)和大小，著重觀察其菌絲形態(tài)及其分生孢子頭的形態(tài)，根據(jù)霉菌的顯微特征對其進行初步鑒定[12]。

1.3.2.2 霉菌菌種鑒定 使用TIANGEN 基因組DNA 提取試劑盒提取待測菌株的DNA，對提取的DNA 進行PCR 擴增，通用引物為(ITS1:TCCGTAGGTG AACCTGCGG； ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC)。PCR 反應體系為50 μL(PCR Mix 25 μL、DNA 模板4 μL、緩沖液1 μL、ddH2O 20 μL)。PCR 反應條件:98℃預變性2 min，98℃變性10 s，54℃退火10 s，72℃延伸10 s，循環(huán)35 次，最后72℃延伸5 min。

使用TSINGKE DNA 凝膠回收試劑盒(Code No.GE0101)切膠回收目的片段以相應引物測序。將測序結果在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 比對，從中選取同源性高的菌株，再使用MEGA 7.0 軟件構建系統(tǒng)進化樹。

1.3.3 霉菌量測定方法 霉菌量測定參照GB 4789.15－2016[16]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Excel 2010 對測定數(shù)據(jù)作圖，采用IBM SPSS Statistics 20 軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 稻谷中霉菌的鑒定

2.1.1 霉菌的篩選 對湖南省3 個地區(qū)糧倉中的稻谷分別進行定點定時取樣，經(jīng)過3 次取樣對比，選取了生長速度、培養(yǎng)時間、菌落狀態(tài)、顏色等不同的8 種優(yōu)勢霉菌，暫標記為A、B、C、D、F、I、K、L，通過菌株分離及5 次純化得到8 種霉菌的純培養(yǎng)物，于4℃保存。

2.1.2 霉菌的形態(tài)特征分析及菌種鑒定 經(jīng)過霉菌形態(tài)學對比和測序可知(表1)，A、B、C、D、F、I、K、L 菌株所對應的霉菌分別為:根霉(Rhizopodiformis isolate HX－1)、米曲霉(Aspergillus oryzae isolate NL5)、毛霉(Lichtheimia ramosa strain AUMC7961)、黑曲霉(Aspergillus niger isolate SZ8M－14)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus strain JXL－108Y－1)、黃曲霉(Aspergillus flavus isolate L－4932013)、白曲霉(Aspergillus candidus strain HDN15－152)、桔青霉(Penicillium citrinum strain NSF4)。

表1 取樣糧倉的儲藏條件Table 1 Storage conditions of sampling granaries

表2 取樣糧層稻谷的溫度Table 2 Rice temperature of sampled grain layers

表3 優(yōu)勢菌菌種鑒定Table 3 Identification of dominant bacteria

2.2 糧倉中優(yōu)勢霉菌差異對比

2.2.1 金牛倉中優(yōu)勢霉差異對比 由圖2可知，金牛倉庫的稻谷中米曲霉、黑曲霉、煙曲霉、黃曲霉的數(shù)量隨著儲藏時間的延長而減少，而根霉、毛霉、白曲霉、桔青霉的數(shù)量則隨著儲藏時間的延長逐漸增加，其中根霉、毛霉數(shù)量增加較多，占優(yōu)勢，且在不同儲藏時間同一霉菌的霉菌數(shù)量存在顯著差異(P<0.05)。

圖2 糧倉中不同優(yōu)勢霉菌總數(shù)差異比較Fig.2 Comparison of the difference in the total number of different dominant molds in the granary

由圖3可知，第一次取樣結果顯示，根霉數(shù)量在金牛糧倉中的分布從高到低依次為上層>下層>中層，米曲霉數(shù)量在糧倉中的分布為中層>上層>下層，毛霉、黑曲霉、煙曲霉、黃曲霉、白曲霉數(shù)量在糧倉中的分布均為上層>中層>下層，桔青霉為中層>下層>上層，隨著儲藏時間的延長，各霉菌在糧倉中整體分布趨勢不變，同一霉菌在同一糧倉不同糧層間存在顯著差異(P<0.05)。這可能由于不同種類霉菌的最適溫度不同，結合取樣時各糧倉倉溫、倉濕以及不同糧層溫度(表1)可知，儲糧糧倉、不同層位的稻谷溫度有一定的差別；另外，不同層位的稻谷水分含量、含氧量等條件也不相同，因此導致同一種霉菌在不同位置的生長繁殖狀態(tài)存在較大差異。

圖3 糧倉不同層位稻谷優(yōu)勢霉菌差異比較Fig.3 Comparison of differences in dominant molds in different layers of grain storage

2.2.2 金山倉中優(yōu)勢霉差異對比 由圖4可知，在金山倉庫中稻谷的米曲霉、黑曲霉、黃曲霉數(shù)量隨著儲藏時間的延長而減少，而根霉、毛霉、白曲霉、桔青霉數(shù)量則隨著儲藏時間的延長逐漸增加，其中根霉、毛霉數(shù)量增加較多，占優(yōu)勢，且在不同儲藏時間同一霉菌的霉菌數(shù)量存在顯著差異(P<0.05)。

圖4 糧倉中不同優(yōu)勢霉菌總數(shù)差異比較Fig.4 Comparison of the difference in the total number of different dominant molds in the granary

由圖5可知，根霉的數(shù)量在金山糧倉中的分布從高到低依次為上層>下層>中層，米曲霉的數(shù)量在糧倉中的分布為中層>上層>下層，毛霉、黑曲霉、黃曲霉、白曲霉的數(shù)量在糧倉中的分布為上層>中層>下層，桔青霉的數(shù)量為中層>下層>上層，隨著儲藏時間的延長，各霉菌的數(shù)量在糧倉中整體分布趨勢不變，同一霉菌的數(shù)量在同一糧倉不同糧層間存在顯著差異(P<0.05)。

圖5 糧倉不同層位稻谷優(yōu)勢霉菌差異比較Fig.5 Comparison of differences in dominant molds in different layers of grain storage

2.2.3 銀光倉中優(yōu)勢霉差異對比 由圖6可知，在銀光倉中，隨著儲藏時間的延長，米曲霉、黑曲霉、黃曲霉的數(shù)量逐漸降低；而根霉、毛霉數(shù)量則隨著儲藏時間的延長逐漸增加，其中根霉、毛霉數(shù)量增加較多，占優(yōu)勢，且在不同儲藏時間同一霉菌的霉菌數(shù)量存在顯著差異(P<0.05)。

圖6 糧倉中不同優(yōu)勢霉菌總數(shù)差異比較Fig.6 Comparison of the difference in the total number of different dominant molds in the granary

由圖7可知，根霉的數(shù)量在糧倉中的分布從高到低依次為上層>下層>中層，米曲霉的數(shù)量在糧倉中的分布為中層>上層>下層，毛霉、黑曲霉、黃曲霉的數(shù)量在糧倉中的分布為上層>中層>下層，隨著儲藏時間的延長，各霉菌的數(shù)量在糧倉中整體分布趨勢不變，同一霉菌在同一糧倉不同糧層間存在差異顯著(P<0.05)。

圖7 糧倉不同層位稻谷優(yōu)勢霉菌差異比較Fig.7 Comparison of differences in dominant molds in different layers of grain storage

3 討論

本研究通過對稻谷中分離鑒定出的8 種優(yōu)勢霉菌進行形態(tài)特征分析及分子生物學鑒定，初步判定為根霉(Rhizopodiformis isolate HX－1)、米曲霉(Aspergillus oryzae isolate NL5)、毛霉(Lichtheimia ramosa strain AUMC7961)、黑曲霉(Aspergillus niger isolate SZ8M－14)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus strain JXL－108Y－1)、黃曲霉(Aspergillus flavus isolate L－4932013)、白曲霉(Aspergillus candidus strain HDN15－152)、桔青霉(Penicillium citrinum strain NSF4)。王榮雪等[25]和楊思成等[26]研究發(fā)現(xiàn)稻谷中主要優(yōu)勢霉菌為曲霉屬的灰綠曲霉、黃曲霉和白曲霉，也說明了稻谷霉菌中曲霉菌為主要的一類優(yōu)勢霉菌。

對比3 個糧倉中霉菌的種類和數(shù)量變化發(fā)現(xiàn)，米曲霉、黑曲霉、煙曲霉、黃曲霉的數(shù)量均隨著儲藏時間的延長而減少，而剩余菌種則隨著儲藏時間的延長，數(shù)量逐漸增加。方寶慶等[27]通過研究不同糧倉稻谷霉菌量也發(fā)現(xiàn)，不同糧倉以及糧倉不同位置稻谷霉菌量均有差異。所以本研究的糧倉中不同糧層霉菌數(shù)量與優(yōu)勢霉菌差異會隨著客觀條件的變化而變化著，而不是永遠不變的[28－29]。

對比3 個糧倉地理方位，永州市銀光糧倉地理位置在最南方，儲糧溫度及相對濕度均偏高，稻谷對同一霉菌的帶菌量總體高于另2 個糧倉，這與前人研究結果相似。方寶慶等[27]通過對湖北、湖南兩地不同儲糧位置的稻谷霉菌研究發(fā)現(xiàn)，稻谷帶菌量與水分活度有一定相關性；吳紅萍等[5]研究發(fā)現(xiàn)海南省儲糧稻谷含水量整體呈東部>中部>西部，海南省儲糧稻谷含菌量整體呈東部>中部>西部，這與東部、西部及中部水稻平均含水量的規(guī)律基本相同。

4 結論

本研究通過對3 個糧倉優(yōu)勢霉菌菌種及帶菌量測定，經(jīng)過分析對比，得到金牛糧倉優(yōu)勢霉菌有8 種，金山倉有7 種，銀光倉有5 種。除根霉與桔青霉外，優(yōu)勢霉菌大多分布在糧倉上層和中層，差異顯著性分析結果顯示同一霉菌在同一糧倉不同糧層間存在顯著差異。稻谷中優(yōu)勢菌的數(shù)量隨著儲藏時間的延長，也存在一定的動態(tài)變化，米曲霉、黑曲霉、煙曲霉、黃曲霉的數(shù)量均是隨著儲藏時間的延長而減少，而剩余菌種則隨著儲藏時間的延長，數(shù)量逐漸增加，差異顯著性分析結果也表明同一霉菌在不同儲藏時間霉菌數(shù)量間存在差異性顯著(P<0.05)。分析不同糧倉、糧倉不同位置稻谷優(yōu)勢霉菌及霉菌量的差異，可以有效預測糧堆是否存在霉變風險，對精準防霉控霉有重要意義。但本研究未對所檢出的優(yōu)勢霉菌各自最適生長溫度、濕度等進行對比，因此糧倉所處地理環(huán)境對稻谷中優(yōu)勢菌生長的影響還有待進一步研究。