河南省小麥莖基腐病調(diào)查及優(yōu)勢病原分析

胡海燕 董清峰 李冬梅 周 鋒 劉起麗 劉明久 李成偉

(1河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2河南省糧食作物基因組編輯工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453003；3河南科技學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

近年來，我國氣候變化多樣、溫度極其不穩(wěn)定，加重了小麥病害的發(fā)生[1－2]。莖基腐病(crown rot，CR)，是由多種鐮孢菌復(fù)合侵染而引起的世界性土傳病害[3]，美國、澳大利亞等10 多個國家已報道其發(fā)生及危害[4]。同時，該病在南非、埃及、敘利亞、摩洛哥和阿根廷等國家麥類作物種植區(qū)也呈現(xiàn)越來越嚴(yán)重的趨勢，受到各國科研工作者的廣泛關(guān)注[5－8]。已有研究表明，CR 可導(dǎo)致小麥減產(chǎn)達(dá)35%左右，部分地塊損失率甚至高達(dá)100%[9－10]。此外，被CR 侵染的植株及籽粒中會因產(chǎn)生毒素而嚴(yán)重威脅人畜健康[11]。

2012年小麥CR 在河南省首次被報道[12－13]以來，河南和山東大部分地區(qū)、河北中南部、安徽北部、江蘇北部、山西南部、陜西中東部等黃淮麥區(qū)主產(chǎn)地均發(fā)現(xiàn)小麥CR 的發(fā)生[12，14－15]。目前，該病已成為我國小麥生產(chǎn)的主要病害，給我國小麥生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的威脅[1，16]，其中河北省小麥CR 普遍發(fā)病率高達(dá)80.6%～100.0%[15]，河南省的一些地區(qū)因CR 造成小麥減產(chǎn)達(dá)30%以上[1，17－18]。引起我國小麥CR 的主要病原菌有禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)、假禾谷鐮刀菌(Fusarium pseudograminearum)、小麥根腐離蠕孢菌(Bipolaris sorokiniana)、木賊鐮刀菌(Fusarium equiseti)、三線鐮刀菌(Fusarium tricinctum)和層出鐮刀菌(Fusarium proliferatum)[12，19]。目前，對小麥CR 的防控一般采用農(nóng)業(yè)措施和化學(xué)防治[13]，且尚未選育出高抗CR 的小麥品種。因此，明確我國小麥主產(chǎn)地河南省小麥生產(chǎn)上CR 發(fā)病的最新發(fā)展動態(tài)，進(jìn)一步明確當(dāng)前流行的優(yōu)勢病原菌類型，有目的地針對優(yōu)勢病菌引起的小麥CR 開展防控顯得尤為重要。本研究于2019年5月對河南省11 個小麥主要產(chǎn)區(qū)的96 個生產(chǎn)點(diǎn)進(jìn)行了CR 調(diào)查，分離鑒定主要病原菌并測定其致病力，以期為小麥CR 的有效防治提供準(zhǔn)確的信息，同時為加快小麥CR 致病和抗病機(jī)理研究以及抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 調(diào)查地點(diǎn) 調(diào)查地點(diǎn)為河南省的小麥主要生產(chǎn)區(qū)，包括濮陽、安陽、新鄉(xiāng)、鶴壁、焦作、開封、周口、商丘、駐馬店、平頂山、南陽市等11 個地區(qū)的36 個鄉(xiāng)96個生產(chǎn)點(diǎn)。

1.1.2 病原菌和小麥品種 供試病原菌從不同調(diào)查地點(diǎn)發(fā)病田塊的典型發(fā)病小麥植株上分離。病原菌致病力鑒定所用小麥品種為百農(nóng)207(2018年河南省秋播面積較大品種，全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù))。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病情調(diào)查方法 根據(jù)小麥CR 癥狀[1，13]進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查。田間調(diào)查方法參照地方標(biāo)準(zhǔn)DB37/T 3404－2018[20]，即每塊地采用5 點(diǎn)取樣法(對角線Z字)，每點(diǎn)取20 個小麥單莖，記錄發(fā)病等級，發(fā)病等級分為10 級:0 級:整株莖稈無癥狀；1 級:地上部基部第1 葉鞘褐變，但莖節(jié)沒有病變；3 級:地上部分第1 莖節(jié)褐變；5 級:地上部分至第2 莖節(jié)褐變；7 級:褐色病斑超過第2 莖節(jié)，但無白穗；9 級:褐色病斑超過第2 莖節(jié)，產(chǎn)生白穗或因發(fā)病而無穗。發(fā)病田塊調(diào)查:每個調(diào)查點(diǎn)，調(diào)查10～20 個小麥田塊，調(diào)查每田塊中發(fā)病小麥白穗情況。根據(jù)5 級分類記錄發(fā)病田塊的白穗率:0級:整體無白穗；1 級:白穗率在0～10%之間；2 級:白穗率在10%～20%之間；3 級:白穗率在20%～50%之間；4 級:白穗率大于50%。根據(jù)公式計(jì)算病情指數(shù)、病株率和田塊發(fā)病率:

1.2.2 病原菌分離及形態(tài)觀察 從不同地區(qū)調(diào)查點(diǎn)的小麥田塊中采集具有CR 典型癥狀的小麥植株樣本[13]，剪取小麥莖基部病斑部位，剪成長約0.2 cm 的小片段，用75%酒精和2.5%次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒，再用無菌水清洗，無菌紙吸干水分后放置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 L)上，于25℃培養(yǎng)室中活化3 d，然后挑取單個菌株接種到新鮮的培養(yǎng)基上進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，待72 h 菌絲長滿后打成菌餅(d ＝5 mm)，放入液體PDA 培養(yǎng)基，25℃條件下180 r·min－1振蕩培養(yǎng)4 d 左右，直至孢子產(chǎn)生，期間持續(xù)觀察各菌株的菌落形態(tài)、菌落顏色及分生孢子形態(tài)，參考Leslie 等[21]的鐮刀菌分類系統(tǒng)對不同形態(tài)菌株進(jìn)行分類鑒定。

1.2.3 病原菌基因組DNA 提取及rDNA-ITS 分子鑒定 將上步分離純化的菌株活化后，接種到新鮮的PDA 培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周，收集菌絲，用液氮迅速冷凍并研磨成粉末，采用CTAB 法提取菌絲基因組DNA。使用rDNA-ITS 序列特異性引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGCG-3′)，ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[22]，以病原菌基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸15 s(共循環(huán)35 次)，72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將得到的目的擴(kuò)增產(chǎn)物送武漢金開瑞生物工程有限公司測序，對測得的序列在美國國家生物信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)上進(jìn)行核酸序列比對。從GenBank 中下載F.pseudograminearum(假禾谷鐮刀菌)和F.tricinctum(三線鐮刀菌)的rDNA-ITS 特異區(qū)域序列，用MEGA7 軟件的鄰接法(neighborjoining，bootstrap method 值設(shè)為1 000) 構(gòu)建進(jìn)化樹[23]。

1.2.4 病原菌致病力分析 病原菌致病力鑒定采用Demirci 等[24]的方法，測定病原菌對小麥的致病力。將消毒后的小麥百農(nóng)207 種子與活化7 d 的病原菌菌餅(d＝5 mm)一起播種于8 cm 的盆缽中，營養(yǎng)土與蛭石以2 ∶1比例混合；每缽種5 粒小麥，設(shè)3 次重復(fù)，同時設(shè)置未接種的對照。將接種菌餅的小麥放入25℃、14 h/10 h 光周期的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，50 d 后調(diào)查小麥幼苗發(fā)病情況。調(diào)查時將小麥從土中取出，記錄莖基部癥狀，病級評價標(biāo)準(zhǔn)按照Grey 等[25]的方法分為四級:0級:無癥狀；1 級:1%～25%褐變；2 級:25%～50%褐變；3級:>50%褐變。按照公式(1)計(jì)算病情指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 河南省小麥CR 發(fā)生情況

2019年5月小麥灌漿期對河南省11 個小麥主要產(chǎn)區(qū)的96 個生產(chǎn)點(diǎn)田間CR 病情指數(shù)、病株率、白穗率和田塊發(fā)病率進(jìn)行了調(diào)查，田間調(diào)查的小麥CR 發(fā)病癥狀見圖1。結(jié)果顯示，CR 的病情指數(shù)在0～42.36之間(圖2)，平均為17.78，其中最高的是焦作，其次是濮陽和新鄉(xiāng)，而駐馬店地區(qū)的病情指數(shù)幾乎為0(0.028)；病株率平均達(dá)48.35%(圖3)，其中7 個地區(qū)的病株率在50%以上，最高達(dá)86.75%；發(fā)病致死率即白穗率在0～8.13%之間，平均為3.44%(圖3)；田塊發(fā)病率平均為78.85%，除了駐馬店地區(qū)幾乎不發(fā)病外，其他地區(qū)的田塊發(fā)病率都超過了50%，最高達(dá)100%，最低為56.25%(圖4)。

圖1 田間調(diào)查的小麥植株CR 癥狀Fig.1 CR symptoms of wheat plants investigated in field

圖2 不同地區(qū)小麥CR 病情指數(shù)Fig.2 The disease index of wheat CR in different investigation areas

圖3 不同地區(qū)小麥CR 的病株率和白穗率Fig.3 The rate of diseased plant and the white head incidence of CR in different investigation areas

圖4 不同地區(qū)小麥CR 田塊發(fā)病率分布圖Fig.4 The disease field rate distribution of wheat CR in different investigation areas

被調(diào)查到的小麥品種對CR 抗性存在明顯差異，其中發(fā)病較輕的品種占30%，發(fā)病較重的品種占20%，其他50%屬于中間類型。調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，發(fā)病程度與品種特性存在一定關(guān)系，其中偏春性品種發(fā)病輕，強(qiáng)筋優(yōu)質(zhì)品種發(fā)病相對較重，但差異不顯著(數(shù)據(jù)未列出)；同一品種在不同地區(qū)(地塊)發(fā)病程度存在較大差異，大多數(shù)品種的發(fā)病程度受氣候和土壤條件以及管理措施影響，其中干旱和鹽堿地塊發(fā)病較重，土壤肥沃、雨水充足或水澆地發(fā)病較輕甚至不發(fā)病，管理粗放、缺乏肥水管理的地塊發(fā)病較重。如百旱207 在南陽的干旱地塊發(fā)病嚴(yán)重，病情指數(shù)達(dá)到了27.67，而在周口雨水充足地塊發(fā)病較輕，病情指數(shù)僅為0.67，相差41 倍；百農(nóng)4199 平均病情指數(shù)為10.98，在南陽的干旱地塊病情指數(shù)為15.44，而在駐馬店雨水充足地塊不發(fā)?。回S德存5 號在周口和商丘兩個雨水充足地區(qū)未見發(fā)病，在新鄉(xiāng)的半干旱和焦作的鹽堿地塊發(fā)病較重(病情指數(shù)分別為50.67 和23.00)；鄭麥369在南陽地區(qū)兩個正常管理地點(diǎn)發(fā)病相對較輕(病情指數(shù)分別為12.22 和14.56)，而在焦作的鹽堿地塊和新鄉(xiāng)的干旱地塊病情指數(shù)分別達(dá)到44.67 和31.44。調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)即使進(jìn)行了常規(guī)病蟲害防治的田塊，仍有不同程度的CR 發(fā)生。以上結(jié)果表明，生態(tài)氣候條件和田間管理措施是影響小麥CR 發(fā)病程度的重要因素，目前還缺乏對小麥CR 的有效防治藥劑。

2.2 小麥CR 病原菌形態(tài)特征分類

從不同地區(qū)典型CR 發(fā)病小麥植株上共分離得到49 株小麥CR 菌株，根據(jù)菌落特征分為7 類，分別標(biāo)記為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ(圖5)，分別分離到18、20、4、2、3、1 和1 株。不同類別之間的菌斑形態(tài)和菌斑顏色上存在差異，其中，第Ⅰ類型菌絲為純白色絨狀，在PDA 平板靠近中心位置周邊生長旺盛，其他區(qū)域菌絲生長稀疏，背面顏色為鮮紅色；第Ⅱ類和第Ⅳ類與第Ⅰ類之間除顏色稍有不同外，其他特征相似；第Ⅲ類菌絲多數(shù)為黃色絨狀，菌絲生長密集，有明顯的聚集，分布不均勻，背面顏色有明顯的層次感，內(nèi)圈為淺紅色，外圈則為黃色，第Ⅴ類和第Ⅶ類與第Ⅲ類之間除顏色不同外基本相似；而第Ⅵ類菌絲生長不旺盛，菌絲純白間紫紅色，當(dāng)生長到一定直徑時不再橫向生長，背面只有中心呈環(huán)形深紅色且分布不均勻，與其他類型菌株有明顯不同。7 種類型病原菌的分生孢子均為鐮刀狀(圖6)，但孢子橫隔數(shù)目不同，其中第Ⅰ類和第Ⅶ類有5 個橫隔，第Ⅳ類和第Ⅴ類有3 個橫隔，第Ⅱ類和第Ⅲ類無橫隔。

圖5 不同類型CR 病原菌的菌落形態(tài)Fig.5 Morphological characteristics of different types CR pathogens

圖6 不同類型CR 病原菌的孢子形態(tài)Fig.6 Conidia morphology of different types of CR pathogens

2.3 小麥CR 病原菌的分子鑒定

對上述7 種類型病原菌分別進(jìn)行rDNA-ITS 特異序列擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物(圖7) 經(jīng)測序，序列提交至GenBank(序列號:MW341493-MW341499)，并上傳NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對，核酸序列比對結(jié)果顯示，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅶ6 種類型病原菌序列與假禾谷鐮刀菌(F.pseudograminearum)的序列有較高的同源性，相似度為99.45%～99.63%；而第Ⅵ類型病原菌序列與三線鐮刀菌(F.tricinct)序列有較高的同源性，相似度達(dá)99.82%。對7 種類型病原菌的rDNA-ITS 特異序列進(jìn)行進(jìn)化樹分析，結(jié)果如圖8所示，其中第Ⅱ、第Ⅰ和第Ⅶ類與假禾谷鐮刀菌的進(jìn)化關(guān)系最近，之后依次是第Ⅳ、第Ⅴ、第Ⅲ類，第Ⅵ類與三線鐮刀菌關(guān)系最近。7 種不同病原菌在河南省內(nèi)的分布存在差異，其中，第Ⅰ類在濮陽、平頂山、周口、焦作、安陽、鶴壁、新鄉(xiāng)和商丘8 個地區(qū)均有分布，第Ⅱ類在安陽、駐馬店、新鄉(xiāng)、周口、商丘和南陽等6 個地區(qū)有分布，第Ⅲ、第Ⅳ和第Ⅴ類只分布到2 或3 個地區(qū)，而第Ⅵ和Ⅶ類均只在1 個地區(qū)出現(xiàn)。因此認(rèn)為，河南省小麥莖基腐病的優(yōu)勢病原菌為假禾谷鐮刀菌，目前的流行病原菌為第Ⅰ類和第Ⅱ類。

圖7 不同類型CR 病原菌rDNA-IST 特異區(qū)域PCR擴(kuò)增片段電泳圖Fig.7 Electrophoregrams of PCR amplified rDNA-IST specific fragments from different types of CR pathogens

圖8 不同類別CR 病原菌的rDNA-ITS 區(qū)域特異序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree based on the combined rDNA-ITS region sequences of 7 Fusarium species associated with CR

2.4 不同類型小麥CR 病原菌的致病力

利用苗期室內(nèi)接種鑒定方法對7 種不同類型病原菌的致病性進(jìn)行了分析。從接種病原菌7 d 后的小麥幼苗發(fā)病癥狀上看，小麥莖基部已出現(xiàn)大量的白色菌絲，大部分類型菌絲已經(jīng)分泌紅色的次生代謝產(chǎn)物，小麥胚芽鞘出現(xiàn)明顯的褐化，且小麥幼苗的生長受到明顯的抑制，感病嚴(yán)重的小麥在出土2 cm 就表現(xiàn)出明顯的衰亡跡象；第Ⅵ類三線鐮刀菌在接種后菌絲正常生長，只侵染小麥的葉鞘組織，對小麥植株的生長影響較小。接種50 d 后的小麥植株發(fā)病結(jié)果顯示，不同類型病原菌對小麥幼苗的致病力存在顯著差異(圖9)，7種類型病原菌的致病力平均病情指數(shù)為70.63，其中第Ⅲ類的病情指數(shù)最高達(dá)到92.22，第Ⅵ類三線鐮刀菌的病情指數(shù)最小為33.33。而且同為假禾谷鐮刀菌的不同類型病原菌(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅶ)之間的致病力存在明顯差異，致病力強(qiáng)弱依次為Ⅲ>Ⅴ>Ⅶ>Ⅳ>Ⅱ>Ⅰ。從病原菌來源地看，分布最廣的病原菌即第Ⅰ和第Ⅱ類的病情指數(shù)分別為42.22 和77.78，表明河南省大部分地區(qū)的CR 病原菌傳播能力較強(qiáng)，致使河南省小麥主產(chǎn)區(qū)大面積均有CR 發(fā)生。

圖9 不同類型CR 病原菌致病力Fig.9 The virulence of different CR pathogens

3 討論

近年來，CR 在我國小麥生產(chǎn)中頻繁發(fā)生，徐飛等[13]對2013—2016年的小麥CR 發(fā)病情況進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)病田率從2013年的45.8%增至2016年的65.1%，且干旱的地塊發(fā)病嚴(yán)重。本研究對河南省的11 個小麥主要產(chǎn)區(qū)CR 發(fā)病情況及優(yōu)勢病原進(jìn)行了調(diào)查和分析。結(jié)果顯示，除了駐馬店地區(qū)幾乎不發(fā)病外，其余地區(qū)都存在不同程度的發(fā)病情況，占調(diào)查總數(shù)的90.91%，平均病情指數(shù)達(dá)17.78，嚴(yán)重地塊白穗率達(dá)8.13%，且田塊發(fā)病率平均高達(dá)78.85%，表明CR 在河南省小麥生產(chǎn)中已普遍發(fā)生，且傳播呈現(xiàn)加重趨勢，嚴(yán)重影響小麥高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。

目前，我國生產(chǎn)上還沒有對CR 具有免疫和高抗的小麥品種，因此，造成我國小麥CR 普遍發(fā)生[26－28]。本研究結(jié)果也顯示，河南省小麥生產(chǎn)上缺乏對CR 免疫或高抗的品種，因此急需加快抗性品種的篩選和種質(zhì)創(chuàng)制。本調(diào)查初步發(fā)現(xiàn)，不同的小麥品種特性(冬春性和品質(zhì)特性)之間發(fā)病程度存在差異，但由于田間調(diào)查范圍廣、氣候和土壤條件不一致等原因，小麥品種特性與抗病之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究；同時也發(fā)現(xiàn)同一品種在不同地區(qū)的發(fā)病程度也存在較大差異，即干旱、鹽堿地和缺少肥水管理等造成CR 嚴(yán)重發(fā)生，而水澆地、雨水充足和水肥管理好的地塊發(fā)病較輕或不發(fā)病，與前人研究結(jié)果一致[1]。因此，通過栽培措施和管理方式可以有效控制小麥CR 的發(fā)生程度。

造成黃淮麥區(qū)小麥CR 的病原菌為多種鐮刀菌，但不同地區(qū)的病原菌種類存在差異，其中禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌為主要優(yōu)勢病原菌[12，19]。本研究根據(jù)收集到的病原菌形態(tài)和分子鑒定結(jié)果顯示，2019年河南省大部分小麥生產(chǎn)區(qū)的CR 優(yōu)勢病原菌以假禾谷鐮刀菌為主，存在6 種不同類型，它們的分離頻率以及在河南省的分布存在差異，其中，第Ⅰ和Ⅱ類病原菌分離頻率高且地區(qū)分布廣。因此推測，造成河南省當(dāng)前小麥CR 普遍發(fā)生的優(yōu)勢病原菌為假禾谷鐮刀菌，流行病原為第Ⅰ和Ⅱ類病原菌。2016年之前河南南部地區(qū)的菌株致病力相對較弱，病情指數(shù)為6.67[12，29]，本研究分離到的不同類型優(yōu)勢病原菌均具有很強(qiáng)的致病力，病情指數(shù)最低為42.22，比2016年賀小倫[29]鑒定的病情指數(shù)高出6 倍，表明CR 病原菌的致病力越來越強(qiáng)，造成的危害將會越來越嚴(yán)重。田間調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，雖然生產(chǎn)中通過藥劑拌種和大田防治，但CR 仍然普遍發(fā)生，表明目前生產(chǎn)上還沒有針對CR 的特效化學(xué)和生防藥劑，因此，需要加快針對優(yōu)勢流行病原菌致病機(jī)理開展研究、篩選高效的防治藥劑及探討有效的防治途徑。

4 結(jié)論

河南省11 個小麥主產(chǎn)區(qū)均有不同程度CR 發(fā)生，調(diào)查到的小麥品種也均不同程度感病，不同氣候和土壤條件地塊間發(fā)病程度差異較大；河南省小麥CR 主要病原菌為假禾谷鐮刀菌，根據(jù)菌落形態(tài)特征分為6種類型，其中第Ⅰ和Ⅱ類為優(yōu)勢病原菌株。該結(jié)果為開展小麥CR 的防控、致病機(jī)理、抗病機(jī)理的深入研究提供了依據(jù)，對提高小麥抗病育種效率、確保糧食生產(chǎn)安全具有重要意義。