尿素14C膠囊中55Fe分析方法研究

馬莉娜，宋麗娟，楊永剛，王亞?wèn)|，馬 彥，戴雄新

(中國(guó)輻射防護(hù)研究院，山西 太原 030006)

幽門螺旋桿菌(Hp)是目前所知能在人體胃酸中生存的唯一微生物種類。Hp感染能引發(fā)多種胃病，在2017年世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單中Hp被列為一類致癌物。目前，14C尿素呼吸試驗(yàn)是Hp感染檢測(cè)的有效方式。尿素14C膠囊的初始14C原料通過(guò)中子輻照高純氮化鋁(AlN)靶獲得[1-2]，為保證藥品的放射性純度，需分析AlN靶原料經(jīng)輻照后可能產(chǎn)生的放射性雜質(zhì)核素及其放射性活度?！睹绹?guó)藥典》[3]《中國(guó)藥典》2015 年[4]均未給出詳細(xì)可行的尿素14C膠囊中放射性雜質(zhì)核素的檢驗(yàn)方法。因此，需建立實(shí)際可行的尿素14C膠囊中放射性雜質(zhì)核素的檢驗(yàn)方法，確保藥品質(zhì)量。

高純AlN靶中Fe、Co元素的最高含量分別可達(dá)到1 500 ppm及600 ppm[5]。Fe、Co等雜質(zhì)元素被中子活化生成55Fe、60Co等放射性核素，其母體54Fe和59Co熱中子吸收截面較大，55Fe(t1/2=2.74 a)和60Co(t1/2=52 711 a)半衰期長(zhǎng)，因此，55Fe和60Co是最有可能引起14C標(biāo)記尿素原料藥的放射性核純度超標(biāo)的主要雜質(zhì)核素。60Co為高能β-γ核素，較易通過(guò)γ能譜、液閃或Cerenkov計(jì)數(shù)測(cè)量來(lái)檢驗(yàn)[6-7]，而55Fe是電子俘獲衰變核素，其發(fā)射的低能俄歇電子及X射線的探測(cè)效率低，易被屏蔽而難以檢測(cè)。對(duì)55Fe最靈敏的檢測(cè)手段是液閃計(jì)數(shù)，但其液閃能譜處于極低能區(qū)[8-11]，14C為純?chǔ)路派湫院怂?，最大能量?56 keV[12]，能譜處于較高能區(qū)，完全覆蓋活度很低的55Fe 能譜，因此檢測(cè)14C標(biāo)記尿素樣品中低活度的55Fe需首先將高活度14C從樣品中完全分離，才能進(jìn)行55Fe的液閃測(cè)量。本工作擬建立尿素14C膠囊中放射性雜質(zhì)核素55Fe分析方法，并對(duì)方法進(jìn)行驗(yàn)證，以滿足尿素14C膠囊生產(chǎn)中的質(zhì)控需求。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 主要試劑和儀器

55Fe標(biāo)準(zhǔn)溶液比活度為59 kBq/g，美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所(NIST)；14C標(biāo)準(zhǔn)淬滅源、Hisafe閃爍液，美國(guó)Perkin Elmer；濃HCl、六水合三氯化鐵，市售分析純。

Hidex-300SL液體閃爍計(jì)數(shù)器(LSC)，芬蘭Hidex；X射線熒光光譜分析儀、Milli-Q Reference超純水機(jī)系統(tǒng)，美國(guó)默克；XS-205分析天平，分度值為0.1 mg，美國(guó)梅特勒。

1.2 膠囊樣品中55Fe的化學(xué)分離及測(cè)量流程

膠囊樣品中55Fe的化學(xué)分離及測(cè)量流程示于圖1。具體過(guò)程如下。

1) 將AGMP-1強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂在高純水中浸泡1 h，將浸泡好的樹脂裝入2 mL樹脂柱中，加入5 mL 9 mol/L HCl平衡樹脂。

圖1 尿素14C膠囊中55Fe的放化分析流程Fig.1 Flow diagram of radioanalytical procedure for determination of 55Fe in urea 14C capsule

2) 取1粒膠囊樣品和2 mL高純水加入50 mL離心管中，60 ℃水浴加熱至膠囊溶解后加入5 mg穩(wěn)定鐵示蹤劑和10 mL 12 mol/L HCl，混合均勻。

3) 將第2步所得膠囊溶解液通過(guò)樹脂柱，再用10 mL 9 mol/L HCl以1 mL/min的流速淋洗樹脂柱，之后用3 mL 0.1 mol/L HCl將鐵洗脫至50 mL離心管中。在離心管中加入10 mL 12 mol/L HCl，混合均勻，再次通過(guò)樹脂柱，樣品全部流出后，用10 mL 9 mol/L HCl以1 mL/min的流速淋洗樹脂柱，最后用3 mL 0.1 mol/L HCl將鐵洗脫至20 mL聚乙烯(PE)閃爍瓶中。在閃爍瓶中加入0.6 mL 15 mol/L H3PO4、1 mL水和14 mL Hisafe閃爍液，避光放置12 h，采用LSC測(cè)量并計(jì)算55Fe的活度。

1.3 鐵標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

稱取0.970 5 g分析純級(jí)六水合三氯化鐵于20 mL PE液閃瓶中，再加入0.1 mol/L HCl配置成10 mg/g的穩(wěn)定鐵溶液。準(zhǔn)確稱取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g濃度為10 mg/g的Fe3+溶液于系列20 mL PE閃爍瓶中，用0.1 mol/L HCl定量至3.000 0 g，混合均勻后，用X射線熒光光譜儀(XRF)測(cè)量其濃度，繪制鐵的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖2 XRF測(cè)量的Fe3+標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of Fe3+ by XRF

1.4 14C活度測(cè)量

1) 尿素14C膠囊中14C活度測(cè)量

取1粒膠囊樣品，轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入2 mL高純水，60 ℃水浴加熱至膠囊溶解，取出0.2 g，轉(zhuǎn)移至20 mL聚乙烯閃爍瓶中，加入1 mL高純水和14 mL Hisafe閃爍液，混合均勻，采用LSC測(cè)量并計(jì)算膠囊中的14C活度。

2) 純化后樣品中14C活度測(cè)量

在純化后的洗脫液中加入14 mL Hisafe閃爍液，混合均勻，避光放置12 h后，采用LSC測(cè)量并計(jì)算樣品中14C的活度。

1.5 14C及55Fe液閃測(cè)量效率校正

1)14C液閃測(cè)量效率校準(zhǔn)

取系列14C標(biāo)準(zhǔn)淬滅源，用LSC測(cè)量計(jì)數(shù)，測(cè)量時(shí)間為5 min。由式(1)計(jì)算每個(gè)淬滅源的14C測(cè)量效率ε14C。

(1)

其中：Am為14C淬滅源的活度測(cè)量值，Bq；Ae為14C淬滅源的活度理論值，Bq；Di為14C樣品兩管符合計(jì)數(shù)；D0為空白兩管符合計(jì)數(shù)；t為測(cè)量時(shí)間，s；

樣品的三管、兩管符合計(jì)數(shù)比(TDCR)計(jì)算公式如下：

(2)

其中：Ti為樣品三管符合計(jì)數(shù)；T0為空白三管符合計(jì)數(shù)。

14C的測(cè)量效率與TDCR的關(guān)系曲線如圖3所示，分析窗口為5～650道。

圖3 14C的TDCR-LSC效率校正曲線Fig.3 TDCR-LSC efficiency correction curve of 14C

2)55Fe液閃測(cè)量效率校準(zhǔn)曲線

LSC測(cè)量55Fe時(shí)選擇的分析窗口為20～250道，淬滅校正曲線表達(dá)式如式(3)[8]所示。

ε55Fe=1.53TDCR0.91

(3)

1.6 流程驗(yàn)證

在尿素14C膠囊樣品中，加入已知活度的標(biāo)準(zhǔn)55Fe，按照1.2節(jié)所述流程分離后，測(cè)量膠囊樣品中55Fe的活度，驗(yàn)證流程的準(zhǔn)確性。

2 方法的建立與驗(yàn)證

2.1 方法建立

55Fe的分離純化可采用陰離子交換樹脂、TRU樹脂、溶劑萃取等手段[8,13]。陰離子交換樹脂對(duì)鐵有良好的選擇性以及較高的吸附容量，鐵離子與9 mol/L HCl生成陰離子絡(luò)合物吸附在陰離子樹脂柱上[8-9]，而碳不會(huì)吸附在陰離子樹脂柱上，可用適當(dāng)?shù)牧芟磩⑵鋸臉渲舷疵?，從而達(dá)到分離純化的目的。測(cè)量尿素14C膠囊樣品中的55Fe時(shí)需將14C完全去除，膠囊中14C活度在μCi級(jí)，遠(yuǎn)高于55Fe的活度，此外，55Fe淋洗液中含有高活度14C，不能直接排放，需在淋洗過(guò)程中考慮將淋洗液最小化，以方便放射性廢物的后續(xù)處理。已報(bào)道的文獻(xiàn)中，55Fe純化時(shí)，每個(gè)樣品淋洗液的體積超過(guò)60 mL[8-9]，會(huì)生成大量放射性廢液，因此需對(duì)方法進(jìn)行改進(jìn)。

將樣品按1.2節(jié)溶解并調(diào)節(jié)酸度后，通過(guò)2 mL AGMP-1樹脂柱，再用10 mL 9 mol/L HCl淋洗14C、0.1 mol/LHCl洗脫55Fe后測(cè)量，樣品中14C殘余量可達(dá)到30 Bq，會(huì)顯著干擾55Fe的測(cè)量。將洗脫后的樣品用12 mol/L HCl調(diào)至9 mol/L，再次通過(guò)2 mL AGMP-1樹脂柱，用10 mL 9 mol/L HCl淋洗，淋洗液的測(cè)量結(jié)果示于圖4。由圖4可知，14C低于檢測(cè)限(0.1 Bq)，其測(cè)量譜與空白樣品無(wú)差異。以上結(jié)果表明，采用AGMP-1樹脂柱2次純化可有效除去樣品中的高活度干擾核素14C，并將淋洗液的體積減小至20 mL，有利于放射性廢物的儲(chǔ)存與處理。

圖4 AGMP-1樹脂柱2次純化后的膠囊樣品與空白樣品的14C液閃測(cè)量譜Fig.4 Liquid scintillation spectra of 14C in capsule sample after purified twice by AGMP-1 resin column and blank sample

2.2 尿素14C膠囊中放射性雜質(zhì)55Fe核純度限值估算

根據(jù)藥品制劑中<1 mg 的單個(gè)雜質(zhì)按1%或5 μg(取最小值)的質(zhì)控限度要求[14]，可限定其中任意一種放射性雜質(zhì)核素所造成的輻射劑量(即待積有效劑量，CED)不高于尿素膠囊中14C 本身所致劑量的1%，即：

(4)

式中：CEDI為放射性雜質(zhì)核素的待積有效劑量；CED14C為14C的待積有效劑量；DCFI為放射性雜質(zhì)核素的劑量系數(shù)；DCF14C為14C的劑量系數(shù)；AI為膠囊樣品中放射性雜質(zhì)核素的活度；A14C為膠囊樣品中14C的活度。據(jù)此，可推導(dǎo)出式(5)用以估算尿素14C膠囊的放射性核純度(RP14C)：

(5)

根據(jù)式(5)可限定尿素14C膠囊中放射性雜質(zhì)核素的純度。根據(jù)AlN靶中雜質(zhì)元素的含量、中子反應(yīng)截面、輻照時(shí)間及冷卻時(shí)間估算，尿素14C膠囊中最主要的放射性雜質(zhì)核素為55Fe和60Co。尿素14C膠囊中主要雜質(zhì)的放射性核純度計(jì)算結(jié)果列于表1。由表1可看出，放射性核純度限值要求最高的雜質(zhì)核素是60Co，假設(shè)所有的雜質(zhì)都是食入劑量系數(shù)最大的60Co時(shí)，計(jì)算得到尿素14C膠囊制劑的放射性核純度要求為99.83%。本工作取99.9%作為尿素14C膠囊制劑的放射性核純度要求，相應(yīng)地單個(gè)放射性雜質(zhì)核素55Fe的限值要求為0.1%。

表1 尿素14C膠囊中14C及主要雜質(zhì)核素的放射性核純度估算結(jié)果Table 1 Estimation result of radionuclide purity of main impurity nuclide in urea 14C capsule

2.3 55Fe分析方法驗(yàn)證

尿素14C膠囊樣品中55Fe活度的測(cè)定屬于雜質(zhì)核素的限量檢查。根據(jù)藥典2015年版[4]中“藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則”，雜質(zhì)限度測(cè)定方法的驗(yàn)證指標(biāo)包括專屬性、檢測(cè)限和耐用性。

1) 專屬性

尿素膠囊中14C活度約為3.7×104Bq，遠(yuǎn)高于膠囊樣品中可能存在的55Fe的放射性活度，是測(cè)量55Fe最主要的干擾核素，14C的去污效果是影響方法專屬性最主要的因素。本實(shí)驗(yàn)測(cè)量4批次膠囊樣品中14C的初始活度，并根據(jù)式(6)計(jì)算流程對(duì)14C的去污因子(DF)。

(6)

式中：Q14C,0為初始樣品中14C的活度，Bq；Q14C為純化后樣品中14C的活度，Bq；QFe,0為初始樣品中加入的穩(wěn)定鐵的質(zhì)量，mg；QFe為純化后樣品中穩(wěn)定鐵的質(zhì)量，mg；RFe為鐵的回收率(RFe=QFe/QFe,0)。

14C及55Fe的檢測(cè)限(MDA)由式(7)[16]計(jì)算：

(7)

式中：k為包含因子，取值1.645(置信度為95%)；B為液閃測(cè)量時(shí)空白樣品的二管符合計(jì)數(shù)；f為用于液閃測(cè)量的樣品質(zhì)量與放化分離得到的樣品質(zhì)量的比值；ε為液閃計(jì)數(shù)器的測(cè)量效率。

4批次膠囊樣品中14C的初始活度、純化后活度及流程對(duì)14C的去污因子列于表2。由表2可見，純化后14C活度均低于MDA，去污因子均>3×105，可見本方法可高效分離樣品中的高活度干擾核素14C。因此，可認(rèn)為本方法對(duì)尿素14C膠囊中55Fe的測(cè)量具有很強(qiáng)的專屬性。

表2 不同批次尿素14C膠囊樣品純化后14C去污因子Table 2 14C decontamination factor of different batches of urea 14C capsule after purification

2) 耐用性

樣品溶解、過(guò)柱、淋洗步驟中由于人為操作所造成的損失，均可由回收率進(jìn)行校正，以確保方法的耐用性。流程開始時(shí)在尿素14C膠囊樣品中加入穩(wěn)定鐵作為示蹤劑，流程結(jié)束后，用XRF測(cè)量接入PE閃爍瓶中樣品的穩(wěn)定鐵含量，每個(gè)樣品測(cè)量3 min，計(jì)算樣品濃度及回收率，結(jié)果列于表2。由表2可見，鐵的回收率在57%～67%之間，回收率較低的樣品可能是由于樣品在多次上樣、轉(zhuǎn)移的過(guò)程中沾在容器壁上造成的損失。

3) 檢測(cè)限

根據(jù)2.2節(jié)，膠囊樣品中55Fe的放射性核純度限值低于0.1%，14C的活度約為3.7×104Bq，故膠囊中若能準(zhǔn)確測(cè)得37 Bq的55Fe，即可說(shuō)明本工作建立的分離測(cè)量流程完全適用于膠囊樣品中55Fe的測(cè)量。

在4個(gè)批次的尿素14C膠囊樣品中分別加入約30 Bq和3 Bq的55Fe放射性標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2節(jié)所示流程分離后，測(cè)量樣品中55Fe的活度，結(jié)果列于表3，可見測(cè)量值與標(biāo)稱值的相對(duì)偏差小于±10%。

表3 加標(biāo)樣品的測(cè)量結(jié)果Table 3 Measurement result of spiked sample

膠囊樣品加標(biāo)前后的液閃測(cè)量譜示于圖5。從圖5可看出，采用55Fe分析流程分離純化后的加標(biāo)樣品，55Fe 的信號(hào)明顯可見，依據(jù)該譜圖即可判斷膠囊樣品中是否含有高于核純度限值的55Fe。

圖5 加入標(biāo)準(zhǔn)55Fe樣品與空白樣品的液閃測(cè)量譜Fig.5 Liquid scintillation spectra of spiked standard 55Fe sample and blank sample

3 實(shí)際膠囊樣品中55Fe的測(cè)量

按本文所建立流程測(cè)定上海某醫(yī)藥公司生產(chǎn)的4批次尿素14C膠囊的平行樣品，結(jié)果列于表4。從表4可知，4批次樣品均未檢測(cè)到高于55Fe 檢測(cè)限(0.4 Bq)的信號(hào)，滿足55Fe放射性核純度小于0.1%的質(zhì)控要求。這主要是由于輻照后AlN靶需經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)轉(zhuǎn)化合成流程最終制備成14C標(biāo)記的尿素，這些化學(xué)轉(zhuǎn)化及合成工藝對(duì)14C中的放射性核素雜質(zhì)有極高效的分離效果。

表4 尿素14C膠囊樣品中55Fe的測(cè)量結(jié)果Table 4 Measurement resultof 55Fe in urea 14C capsule

4 結(jié)論

1) 本工作計(jì)算了尿素14C膠囊樣品雜質(zhì)核素55Fe的限值，建立了尿素14C膠囊樣品中55Fe活度測(cè)定方法：膠囊樣品溶解后，采用AGMP-1陰離子交換樹脂對(duì)其進(jìn)行2次分離純化，再用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量55Fe的活度。

2) 驗(yàn)證了方法的專屬性、耐用性和檢測(cè)限。

3) 實(shí)際尿素14C膠囊實(shí)測(cè)結(jié)果表明，本文所建方法滿足55Fe放射性核純度小于0.1%的質(zhì)控要求。