艾地苯醌對(duì)血管性癡呆大鼠海馬突觸再生和可塑性的影響

錢旭東 王東 徐倩倩 李國蕓 王紅梅 張曉璇 馬征

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科，河北 承德 067000；2呼吸內(nèi)科)

我國血管性癡呆(VD)的發(fā)病率不斷上升，目前僅次于阿爾茨海默病(AD)，癡呆患者中大約有1/5是VD患者〔1〕。突觸是神經(jīng)信息傳遞與處理過程的中心環(huán)節(jié)，研究報(bào)道稱神經(jīng)突觸的超微結(jié)構(gòu)與認(rèn)知功能密切相關(guān)，表明突觸的數(shù)量及功能狀態(tài)對(duì)認(rèn)知功能有決定性作用〔2，3〕。對(duì)艾地苯醌在VD方面的研究發(fā)現(xiàn)，其能促進(jìn) VD 大鼠海馬組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達(dá)，而 BDNF 與其受體共同作用可促進(jìn)突觸再生，提高突觸可塑性，從而改善 VD 大鼠癡呆狀況〔4〕。為進(jìn)一步明確艾地苯醌對(duì) VD 大鼠海馬區(qū)突觸的影響，本研究從突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)和突觸超微結(jié)構(gòu)的角度進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)，體重250～300 g，7周齡，健康SD清潔級(jí)雄性大鼠40只，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(冀)2008-1-003，動(dòng)物合格證編號(hào)：1404010，來源河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在濕度50%～70%、室溫20℃～25℃中飼養(yǎng)，每籠5 只，喂養(yǎng)普通顆粒型大鼠飼料，正式實(shí)驗(yàn)之前，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。

1.2試劑與儀器 小鼠抗大鼠微管相關(guān)蛋白(MAP)-2抗體、小鼠抗大鼠突觸素(SYP)抗體及小鼠抗大鼠突觸后密度蛋白(PSD)-95抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司，山羊抗小鼠〔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗〕購自上海Abcam公司，Western印跡ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購自美國Bio-Rad公司，ZS-001 Morris水迷宮購自北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司，TH4-200倒置顯微系統(tǒng)購自日本OLYMPUS。

1.3動(dòng)物建模與分組 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，按照隨機(jī)數(shù)字表將大鼠分為手術(shù)組(n=28)及假手術(shù)組(n=12)。手術(shù)組采用改良雙血管阻斷(2-VO)法建立大鼠 VD 模型，具體方法為：大鼠采用異氟烷吸入麻醉后先分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并兩端結(jié)扎，從結(jié)扎中心剪斷頸總動(dòng)脈，分層縫合并以青霉素 40萬U/只局部注射預(yù)防感染，1 w后以同樣方法處理左側(cè)頸總動(dòng)脈。假手術(shù)組不結(jié)扎及剪斷頸總動(dòng)脈，其余操作步驟同手術(shù)組。模型建立6 w后，運(yùn)用Morris 水迷宮方法挑選28只成功建模的大鼠。(逃避潛伏期各時(shí)段成績(jī)均值-平均對(duì)照組逃避時(shí)間)/逃避潛伏期該組大鼠均值≥0.2作為模型成功的辨別條件。將28只成模大鼠平均分為兩組，分別是艾地苯醌組、模型組，兩組給藥采取腹腔注射，10 mg/kg，持續(xù)給藥4 w，模型組及假手術(shù)組注入等量的生理鹽水。

1.4大鼠學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè) 給藥30 d后，對(duì)每組大鼠進(jìn)行Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)，持續(xù)6 d，前5 d用于定位航行，空間探索實(shí)驗(yàn)利用最后1 d。水溫穩(wěn)定在22℃左右，水深約0.35 m，用攝像頭跟蹤老鼠的位置。通過水迷宮分析系統(tǒng)對(duì)采集的圖像及視頻進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。定位航行測(cè)試：進(jìn)水點(diǎn)是以每個(gè)象限的中點(diǎn)為標(biāo)記，統(tǒng)計(jì)2 min內(nèi)大鼠發(fā)現(xiàn)平臺(tái)的位置，停留在平臺(tái)上時(shí)間超過2 s是避開潛伏期。1天4次，算出平均值?？臻g探索測(cè)試：撤除原平臺(tái)，將大鼠隨機(jī)選一進(jìn)水點(diǎn)放入水中，統(tǒng)計(jì)2 min內(nèi)大鼠穿越原平臺(tái)的次數(shù)和停留時(shí)間。

1.5免疫組織化學(xué)檢測(cè) 取各組大鼠腦組織切片通過二甲苯對(duì)石蠟切片進(jìn)行兩次脫蠟過程，使用酒精梯度清洗脫蠟后的組織：二甲苯孵化5 min，棄二甲苯，重新添加二甲苯再次孵化5 min，無水乙醇、無水乙醇Ⅱ洗滌、95%乙醇依次洗滌3 min，80%乙醇 洗滌3 min，而后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min；將切片放至含有0.01 mmol/L檸檬酸緩沖液中，對(duì)切片進(jìn)行恢復(fù)，并放入微波爐，加熱15 min，冷卻至室溫；將石蠟切片取出，放置在3% H2O2中(13±2)min，然后使用PBS洗滌3次；按照1∶500的比例加入NMDAR抗體，對(duì)石蠟組織切片進(jìn)行室溫孵育1 h或者4℃孵育過夜，之后用PBS沖洗3次，每次3 min；按照1∶1 000的比例加入HRP二抗，對(duì)石蠟組織切片進(jìn)行室溫孵育40 min，之后用PBS沖洗3次，每次3 min；加入DAB試劑盒中的顯色劑，室溫孵育5～10 min，然后清水沖洗；再進(jìn)行蘇木素復(fù)染室溫孵育3～5 min，清水沖洗；對(duì)染色后的切片進(jìn)行梯度酒精水化處理，采用樹脂進(jìn)行封膠固定后觀察。對(duì)組織切片中的NMDAR采取上述相同的操作方法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色觀察。

1.6突觸顯微結(jié)構(gòu)觀察 每組選擇 3 只大鼠，使用10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉后進(jìn)行斷頭處死，此時(shí)對(duì)腦組織進(jìn)行快速剝離，順著視交叉前端切一個(gè)冠狀面，選取3 塊、大小約為1 mm3的大鼠左邊腦部CA1 區(qū)海馬組織，按照固定-漂洗-脫水-滲透-包埋順序操作后，制作60～80 nm超薄切片。采用鈾鉛進(jìn)行雙染色，并經(jīng)充分瀝水過夜后，利用透射電鏡研究突觸情況。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差分析。

2 結(jié) 果

2.13組學(xué)習(xí)記憶能力比較 連續(xù)給藥1 w后，與假手術(shù)組比較，模型組逃避潛伏時(shí)間明顯增高，而穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(均P<0.05)；與模型組比較，艾地苯醌組逃避潛伏時(shí)間明顯減少，而穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增高(均P<0.05)。見表1。

表1 3組學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.23組海馬相關(guān)突觸蛋白的表達(dá) 3組MAP-2、SYP、PSD-95表達(dá)水平比較：艾地苯醌組>假手術(shù)組>模型組(均P<0.05)。見表2，圖1、圖2。

表2 3組海馬突觸蛋白表達(dá)比較

圖1 各組海馬MAP-2表達(dá)(DAB，×400)

圖2 各組海馬突觸相關(guān)蛋白表達(dá)(DAB，×400)

2.33組突觸超微結(jié)構(gòu)的變化 假手術(shù)組突觸結(jié)構(gòu)完整，突觸間隙清晰可見，突觸前后膜間吻合良好，突觸后膜可見均勻增厚，突觸曲面弧度規(guī)整，突觸小泡豐富，有結(jié)構(gòu)完整的線粒體；模型組無突觸間隙，前后突觸膜界限難以區(qū)分，弧度不整齊，具有較少的突觸小泡，線粒體出現(xiàn)腫大或消失；艾地苯醌可見清晰突觸間隙、均勻增厚的突觸后膜，突觸結(jié)構(gòu)大體完整，有較多的突觸小泡和完整、豐富的線粒體結(jié)構(gòu)。見圖3。

圖3 各組突觸超微結(jié)構(gòu)(×3 000)

3 討 論

VD是最常見的認(rèn)知功能障礙病因之一，病變的腦血管引起全腦或局部供血、供氧不足，從而導(dǎo)致參與認(rèn)知記憶等腦部特定神經(jīng)組織受損可能與其發(fā)病的機(jī)制相關(guān)〔5〕。中樞神經(jīng)系統(tǒng)對(duì)缺血缺氧有高度的敏感性，特別是小腦、海馬、大腦皮質(zhì)(第三層)等部位〔6〕。腦缺血受損會(huì)引發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，比如氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、腦梗死周圍去極化、興奮性氨基酸毒性及能量衰竭等環(huán)節(jié)會(huì)使突觸傳遞和神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控受到影響，促使神經(jīng)元突變受損，進(jìn)而使學(xué)習(xí)記憶功能出現(xiàn)障礙〔7〕。大鼠和人類一樣，具有完整的Willis環(huán)，因此本研究采用2-VO法建立大鼠VD模型，而雙側(cè)頸總動(dòng)脈阻斷后可導(dǎo)致大鼠海馬慢性供血不足。海馬CA1區(qū)神經(jīng)元對(duì)缺血、缺氧損害極其敏感，頸總動(dòng)脈阻斷導(dǎo)致的缺血缺氧性病變勢(shì)必導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡及突觸的變性和丟失，使突觸數(shù)量下降，可塑性降低，突觸相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)生改變，并進(jìn)一步影響突觸的結(jié)構(gòu)與功能〔8，9〕。研究表明，突觸相關(guān)蛋白可調(diào)控突觸的生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟，并與突觸可塑性密切相關(guān)，當(dāng)其表達(dá)發(fā)生變化后會(huì)導(dǎo)致個(gè)體產(chǎn)生交流缺陷、認(rèn)知功能受損與感覺、焦慮等神經(jīng)精神癥狀及社會(huì)活動(dòng)缺陷等，因此突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)是突觸數(shù)量及功能狀態(tài)的標(biāo)志，能夠從微觀層面反映突觸的病理生理變化〔10〕。

本研究發(fā)現(xiàn)，艾地苯醌能明顯改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。免疫組化檢測(cè)則進(jìn)一步證實(shí)艾地苯醌能明顯促進(jìn)突觸相關(guān)蛋白SYP、MAP-2、PSD-95的表達(dá)。SYP是一種突觸前囊泡特定蛋白，由313個(gè)氨基酸組成，分子量38 kD，對(duì)突觸形成和突觸功能的維持意義重大，是突觸重建的重要標(biāo)志〔10〕。SYP可作為突觸結(jié)構(gòu)的標(biāo)志物，在神經(jīng)外科手術(shù)中常用來標(biāo)記突觸終末，避免神經(jīng)損傷。作為樹突生長(zhǎng)神經(jīng)元標(biāo)志蛋白的MAP-2主要在突觸后致密區(qū)、樹突棘、樹突、神經(jīng)元胞體中表達(dá)，與樹突棘的功能及形態(tài)和突觸可塑性緊密關(guān)聯(lián)，有調(diào)控突觸可塑性，促進(jìn)神經(jīng)元突起成形等作用，與癲癇等疾病密切相關(guān)〔11〕。PSD-95是一種由724個(gè)氨基酸構(gòu)成的突觸后蛋白，與突觸的可塑性、學(xué)習(xí)記憶等相關(guān)，其變異可導(dǎo)致個(gè)體智能障礙〔12〕。PSD-95不僅參與突觸信號(hào)的修飾，而且對(duì)樹突棘從生長(zhǎng)-發(fā)育-分支-成熟的過程中都扮演著主要的作用。神經(jīng)元PSD-95的表達(dá)增多和突觸興奮性增強(qiáng)相關(guān)，而AD及輕度認(rèn)知障礙(MCI)患者的神經(jīng)元PSD-95表達(dá)則明顯下降〔13～16〕。艾地苯醌MAP-2表達(dá)水平上升提示艾地苯醌對(duì)樹突成形和新突觸形成有促進(jìn)作用，改善突觸可塑性，增強(qiáng)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力；另一方面，艾地苯醌大鼠SYP與PSD-95也明顯升高，說明艾地苯醌能夠保存現(xiàn)有突觸，并促進(jìn)了突觸重建與再生，從而保護(hù)了缺血缺氧損傷的神經(jīng)組織。PSD-95與MAP-2表達(dá)水平提升說明生成的神經(jīng)元樹突及增多和成熟的樹突棘創(chuàng)造了突觸重建的條件。電鏡觀察也進(jìn)一步表明大鼠經(jīng)艾地苯醌治療后有正常突觸結(jié)構(gòu)，豐富的突觸囊泡，突觸的尺寸變大，這些變化為神經(jīng)信息的有效傳遞和治療提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。模型組無突觸間隙，前后突觸膜界限難以區(qū)分，無正常曲面，弧度不整齊，有較少的突觸小泡，線粒體出現(xiàn)腫大或消失；PSD-95、MAP-2、SYP比假手術(shù)組和艾地苯醌明顯降低，提示學(xué)習(xí)記憶能力下降與突觸損害、萎縮或凋亡緊密相關(guān)。

綜上，艾地苯醌可能對(duì)強(qiáng)突觸相關(guān)蛋白SYP、PSD-95、MAP-2的表達(dá)以上調(diào)的方式，改善學(xué)習(xí)記憶功能。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明艾地苯醌還能促使突觸再生，確保了突觸的生理結(jié)構(gòu)及功能正常，為神經(jīng)信息有序高效的處理創(chuàng)造了物質(zhì)前提。